《克隆基因治疗》PPT课件.ppt

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1、细胞分化的可逆性细胞分化的可逆性个体发育个体发育：细胞分裂分化的过程。细胞分裂分化的过程。一个受精卵是有全能性的，它可以产生各种类型的细胞。在个体发育的什么一个受精卵是有全能性的，它可以产生各种类型的细胞。在个体发育的什么阶段，细胞的全能性受到了限制呢？阶段，细胞的全能性受到了限制呢？一直认为植物细胞具有全能性、动物一直认为植物细胞具有全能性、动物细胞不具有全能性。细胞不具有全能性。n直到直到19971997年年2 2月，苏格兰学者用体细胞核移植技术培养成月，苏格兰学者用体细胞核移植技术培养成“多莉多莉”绵羊绵羊，这一动物细胞无全能性的观点才发生动摇。其实，这一动物细胞无全能性的观点才发生动摇

2、。其实，壁虎再生失去的尾巴，壁虎再生失去的尾巴，涡虫、蚯蚓可以再生失去的部分涡虫、蚯蚓可以再生失去的部分都说明都说明动物细胞是具有全能性的动物细胞是具有全能性的，只不过，只不过是能够再生的组织和器官在数目和种类上是有限的，特别是高等动物。是能够再生的组织和器官在数目和种类上是有限的，特别是高等动物。一、植物的组织培养一、植物的组织培养 植物的组织培养植物的组织培养:在体外人工培养植物组织和细胞的技术。在体外人工培养植物组织和细胞的技术。n例：胡萝卜韧皮部的例：胡萝卜韧皮部的单个细胞单个细胞重新发育成一个完整的个体。重新发育成一个完整的个体。现在小麦、玉米、水稻等很多植物都可以通过组织培养获现在

3、小麦、玉米、水稻等很多植物都可以通过组织培养获得愈伤组织，产生新的个体。得愈伤组织，产生新的个体。n 因此，分化的细胞，可以从高度的分化状态回复过来因此，分化的细胞，可以从高度的分化状态回复过来（脱分化脱分化），重新再分化，形成植株，即），重新再分化，形成植株，即植物细胞具有全植物细胞具有全能性能性。二、动物的核移植试验二、动物的核移植试验 （一）移植开端（一）移植开端 19381938年年汉斯汉斯.施佩曼提出他称之为施佩曼提出他称之为“奇异的实验奇异的实验”的设想：从发育到后期的的设想：从发育到后期的胚胎（成熟的或未成熟的胚胎均可）中取出细胞核，将其移植到一个卵子中。胚胎（成熟的或未成熟的胚

4、胎均可）中取出细胞核，将其移植到一个卵子中。19521952年，年，研究细胞全能性的第一个人研究细胞全能性的第一个人R.BriggsR.Briggs（罗伯特（罗伯特.布里格斯）布里格斯）豹纹蛙豹纹蛙 囊胚期细胞核囊胚期细胞核去核的去核的同种蛙卵同种蛙卵卵卵发育成个体发育成个体（即克隆）（即克隆）胚胎后期到蝌蚪、成蛙的细胞胚胎后期到蝌蚪、成蛙的细胞细胞核去核的细胞核去核的同种蛙卵同种蛙卵失败失败.认为认为胚胎胚胎早期细胞核具有全能性早期细胞核具有全能性，而，而胚胎以后胚胎以后各个时期的细胞核难以体现各个时期的细胞核难以体现全能性，即全能性，即分化难以逆转分化难以逆转，多数生物学家转向以未成熟的胚

5、胎细胞克隆动物，多数生物学家转向以未成熟的胚胎细胞克隆动物的领域。的领域。二、动物的核移植试验二、动物的核移植试验（二）胚胎细胞核移植（二）胚胎细胞核移植胚胎细胞克隆胚胎细胞克隆 胚胎早期（囊胚期）的细胞核移入去核的异种动物的受胚胎早期（囊胚期）的细胞核移入去核的异种动物的受精卵中，使受精卵发育成个体的过程。精卵中，使受精卵发育成个体的过程。鲤鱼鲤鱼囊胚细胞囊胚细胞 鲫鱼鲫鱼受精卵受精卵 具有生殖能力具有生殖能力 取核取核 去核受精卵去核受精卵 肌肉蛋白含量比鲤鱼高肌肉蛋白含量比鲤鱼高 3.78%3.78%融合融合 培育培育 杂交鱼杂交鱼 脂肪含量比鲤鱼高脂肪含量比鲤鱼高 5.58%5.58%

6、1 除核2 注核3 注核4 注核5 注核6 电击（三）体细胞核移植（三）体细胞核移植体细胞克隆体细胞克隆 动物体细胞克隆技术动物体细胞克隆技术又称体细胞核移植技术或无性繁殖技术，它是用动物特定发育又称体细胞核移植技术或无性繁殖技术，它是用动物特定发育阶段的核供体（体细胞核）及相应的核受体（去核的原核胚或成熟的卵母细胞、卵细阶段的核供体（体细胞核）及相应的核受体（去核的原核胚或成熟的卵母细胞、卵细胞）不经过有性繁殖过程，进行体外重构，并通过重构胚的胚胎移植，从而达到扩繁胞）不经过有性繁殖过程，进行体外重构，并通过重构胚的胚胎移植，从而达到扩繁同基因型动物种群的目的。同基因型动物种群的目的。1 1

7、、体细胞克隆的类型、体细胞克隆的类型 （1 1）同种体细胞核移植：）同种体细胞核移植：科学家用取自一只科学家用取自一只6 6岁成羊的乳腺细胞培育成功一只克隆羊。岁成羊的乳腺细胞培育成功一只克隆羊。（2 2）异种体细胞核移植：）异种体细胞核移植：陈大元等将陈大元等将大熊猫大熊猫的子宫上皮细胞、骨骼肌细胞和乳腺上皮细的子宫上皮细胞、骨骼肌细胞和乳腺上皮细胞的细胞核移入去核的胞的细胞核移入去核的兔卵母细胞兔卵母细胞后，分别有后，分别有9.9%9.9%、6.8%6.8%和和11.7%11.7%的重构卵的重构卵发育发育到囊胚到囊胚，染色体、线粒体，染色体、线粒体DNADNA和核和核DNADNA分析均证实

8、异种重构胚的核遗传物质来自大熊猫分析均证实异种重构胚的核遗传物质来自大熊猫供体细胞。这不仅开创了大熊猫体细胞移核的先例，而且也是首次大熊猫体细胞核的供体细胞。这不仅开创了大熊猫体细胞移核的先例，而且也是首次大熊猫体细胞核的异种移核。对大熊猫的快繁及保护提供了一线希望。异种移核。对大熊猫的快繁及保护提供了一线希望。（三）体细胞核移植（三）体细胞核移植体细胞克隆体细胞克隆n2、体细胞克隆的一般方法、体细胞克隆的一般方法 胎儿细胞或成年动物已分化的细胞作为胎儿细胞或成年动物已分化的细胞作为核供体核供体，进行细胞核移，进行细胞核移植，得到与供体细胞具有同性质动物的过程。植，得到与供体细胞具有同性质动物

9、的过程。n克隆羊克隆羊“多莉多莉”的克隆方法如下：的克隆方法如下：nA羊乳腺细胞羊乳腺细胞B羊未受精卵羊未受精卵nn取出细胞取出细胞核核除去细胞核的除去细胞核的卵卵 融合融合n显微注射显微注射电击融合电击融合n早期胚胎发育早期胚胎发育nn胚胎移植到胚胎移植到C羊子宫羊子宫nnC羊分娩产下羊分娩产下“多莉多莉”与与A羊同羊同山东皮肤细胞克隆牛北京克隆牛欣欣欣欣之母莱莱阳阳农农学学院院克克隆隆牛牛（四）关于克隆人（四）关于克隆人 19971997年年,克隆克隆(即无性繁殖即无性繁殖)羊羊“多莉多莉”的问世的问世,让人们听到了克隆让人们听到了克隆人的脚步声。由于克隆人不单纯是科技问题人的脚步声。由于

10、克隆人不单纯是科技问题,更是对人类社会及其未来更是对人类社会及其未来命运有着非同寻常影响命运有着非同寻常影响,所以国外各界人士纷纷从科学、哲学所以国外各界人士纷纷从科学、哲学(包括科技包括科技哲学、价值哲学、伦理学、宗教哲学哲学、价值哲学、伦理学、宗教哲学)、社会学、法学、心理学等不同、社会学、法学、心理学等不同角度，对克隆人问题展开了广泛的探讨。角度，对克隆人问题展开了广泛的探讨。克隆人克隆人“三疯子三疯子”的科学家是：的科学家是：美国美国“克隆基金克隆基金”主任主任布瓦瑟利布瓦瑟利耶耶、肯塔基州肯塔基州列克星顿大学激素学院院长列克星顿大学激素学院院长扎沃斯扎沃斯和和意大利意大利科学家科学家

11、安蒂诺安蒂诺里里。由于此三人是克隆人的坚定推崇者，因此被学术界称为。由于此三人是克隆人的坚定推崇者，因此被学术界称为“科学疯子科学疯子”。（四）关于克隆人（四）关于克隆人 1 1、克隆人就在我们身边、克隆人就在我们身边（1 1）体细胞克隆人的过程）体细胞克隆人的过程人造人人造人（2 2）同卵双胞胎的产生过程）同卵双胞胎的产生过程天然的克隆人天然的克隆人 同卵双胞胎同卵双胞胎由同一个受精卵一分二，而二个细胞各自发育由同一个受精卵一分二，而二个细胞各自发育形成二个独立个体，二个人不但细胞核、细胞质完全相同，而在完全形成二个独立个体，二个人不但细胞核、细胞质完全相同，而在完全相同的子宫环境发育成长，

12、比由克隆技术产生的克隆人有更完美的吻相同的子宫环境发育成长，比由克隆技术产生的克隆人有更完美的吻合度。这个完美的天然的克隆人是一种更为完美的克隆人，真正意义合度。这个完美的天然的克隆人是一种更为完美的克隆人，真正意义上的克隆人上的克隆人同卵双胞胎同卵双胞胎（四）关于克隆人（四）关于克隆人天然的克隆人天然的克隆人（四）关于克隆人（四）关于克隆人2、治疗性克隆与生殖性克隆、治疗性克隆与生殖性克隆 治疗性克隆治疗性克隆:体细胞核体细胞核卵细胞卵细胞新的细胞新的细胞“桑椹桑椹”胚胎干细胞胚胎干细胞克隆人体器官，供医学研究，解决器官移植克隆人体器官，供医学研究，解决器官移植供体不足问题等。供体不足问题等

13、。例如：例如：治疗性克隆希望使用病人自己细胞中的遗传物质治疗性克隆希望使用病人自己细胞中的遗传物质来产生胰岛以治疗糖尿病来产生胰岛以治疗糖尿病,或者产生神经细胞来修复受损或者产生神经细胞来修复受损的脊髓。的脊髓。2 2、治疗性克隆与生殖性克隆、治疗性克隆与生殖性克隆 生殖性克隆生殖性克隆:即通常所说的克隆人。体细胞核即通常所说的克隆人。体细胞核卵细胞卵细胞新的细胞新的细胞“桑椹桑椹”(”(胚胎干细胞胚胎干细胞)胚胎植入到一个女性子宫胚胎植入到一个女性子宫婴儿婴儿 如果干细胞保留时间超过如果干细胞保留时间超过1414天，它就可能长出神经元，此时，这一细胞天，它就可能长出神经元，此时，这一细胞就有

14、了生命意义。就有了生命意义。据报道，据报道，1999.111999.11（1998.111998.11）美国科学家在马萨诸塞州的细胞技术公司，）美国科学家在马萨诸塞州的细胞技术公司，用人的用人的皮肤细胞皮肤细胞克隆克隆出首个人类胚胎出首个人类胚胎，1212天后把它焚化烧毁。天后把它焚化烧毁。目前国际上已对治疗性克隆规定了目前国际上已对治疗性克隆规定了三条原则三条原则。一是一是取得的材料卵子、体取得的材料卵子、体细胞，必须是自愿的，不能是骗来的，不能是买来的，提供者有知情权。细胞，必须是自愿的，不能是骗来的，不能是买来的，提供者有知情权。二二是是胚胎细胞保留时间不能超过胚胎细胞保留时间不能超过1

15、414天，超过了，就被视为动机不纯，有克隆人天，超过了，就被视为动机不纯，有克隆人之嫌。之嫌。三是三是不能将克隆的胚胎细胞植入人体子宫。不能将克隆的胚胎细胞植入人体子宫。辽宁省计划生育研究院王彤博士等人在我国首次完成人类全胚胎体外培养取得成功。目前止共培养成活28例人类胚胎.存活最常至今22天.左图是培养液中的约1cm长的人胚胎。受精后20-50天胚胎长度2mm-1cm.2004年4月19日钱江晚报（五）体细胞克隆目前存在的问题（五）体细胞克隆目前存在的问题 n体细胞克隆已在牛、绵羊、山羊、小鼠和猪等动物中取得了成功，但在其它动物体细胞克隆已在牛、绵羊、山羊、小鼠和猪等动物中取得了成功，但在其

16、它动物上还有待进一步验证。其总体水平仍处于实验研究阶段，走向实践运用还上还有待进一步验证。其总体水平仍处于实验研究阶段，走向实践运用还面临许面临许多问题，主要表现在以下几个方面：多问题，主要表现在以下几个方面：n1.1.费用高、效率低：费用高、效率低：通过体细胞克隆动物的费用非常高，如仅用于制作通过体细胞克隆动物的费用非常高，如仅用于制作“多莉多莉”的费用就超过了的费用就超过了200万英镑，同时效率很低。万英镑，同时效率很低。根据目前的研究报道情况综合来看，克隆根据目前的研究报道情况综合来看，克隆绵羊绵羊只有只有3%左右的重组胚能发育左右的重组胚能发育为正常后代。在克隆为正常后代。在克隆牛牛的

17、研究中，重组胚的囊胚发育率最高能达的研究中，重组胚的囊胚发育率最高能达49%，约有，约有80%的移植胚能发育为正常胎儿，但胎儿出生后的死亡率达的移植胚能发育为正常胎儿，但胎儿出生后的死亡率达50%。克隆。克隆小鼠小鼠研究研究中，只有中，只有2%3%的重组胚能发育产仔，仔鼠死亡率也高达的重组胚能发育产仔，仔鼠死亡率也高达40%。以上结果说明，体细胞克隆技术仅处于初步研究阶段，还需要在其它动物上进以上结果说明，体细胞克隆技术仅处于初步研究阶段，还需要在其它动物上进一步充分研究，以提高生产效率。一步充分研究，以提高生产效率。（四）体细胞克隆目前存在的问题（四）体细胞克隆目前存在的问题n2.克隆胎儿初

18、生体重增加，质量差克隆胎儿初生体重增加，质量差：由于培养基中血清的存在，导致早：由于培养基中血清的存在，导致早期胚胎基因表达发生改变，致使许多克隆动物初生重增加，很难自然分娩，期胚胎基因表达发生改变，致使许多克隆动物初生重增加，很难自然分娩，大多数需人工辅助。初生儿还伴有各种缺陷，死亡率增高。出现这一现象大多数需人工辅助。初生儿还伴有各种缺陷，死亡率增高。出现这一现象的原因还不清楚，目前只能从优化培养条件及操作程序入手以减少胎儿死的原因还不清楚，目前只能从优化培养条件及操作程序入手以减少胎儿死亡率。亡率。n3.克隆动物生长发育不正常，非正常死亡率高克隆动物生长发育不正常，非正常死亡率高：研究发

19、现，有些用修饰：研究发现，有些用修饰过的细胞培育出的克隆动物存在缺陷，它们在生长过程中会出现难以预料过的细胞培育出的克隆动物存在缺陷，它们在生长过程中会出现难以预料的后果的后果。“多莉多莉”羊羊在生长过程中就出现了比同龄羊在生长过程中就出现了比同龄羊提前衰老提前衰老的现象，而的现象，而且且现已死亡现已死亡。亦有研究表明，克隆鼠成年后常患有肥胖症的原因与早期胚。亦有研究表明，克隆鼠成年后常患有肥胖症的原因与早期胚胎阶段的细胞缺陷有关。胎阶段的细胞缺陷有关。（五）成功率低的原因（五）成功率低的原因n尽管也有少数成功率较高的报道尽管也有少数成功率较高的报道,但但目前公认目前公认的的体细胞克隆成功率在

20、体细胞克隆成功率在1%3%。克隆胚胎移植后的出生率平均不到克隆胚胎移植后的出生率平均不到10%。胎儿异常、流产和围产期死亡率高。胎儿异常、流产和围产期死亡率高,出生后一周的死亡率最高可达出生后一周的死亡率最高可达100%。原因七方面原因七方面:n1.不能高效率的去除受体卵母细胞的染色体：不能高效率的去除受体卵母细胞的染色体：现有的各种去核技术都要现有的各种去核技术都要损失部损失部分卵母的细胞质分卵母的细胞质。n2.重组胚的融合和卵母细胞质的激活重组胚的融合和卵母细胞质的激活n3.供体核与受体胞质细胞周期同步的问题供体核与受体胞质细胞周期同步的问题：供体核与受体胞质细胞周期同步与：供体核与受体胞

21、质细胞周期同步与否是影响克隆胚胎发育的重要因素之一。目前通用的受体胞质是否是影响克隆胚胎发育的重要因素之一。目前通用的受体胞质是M期的卵母细期的卵母细胞。胞。目前一般认为目前一般认为,除了除了S期以外期以外,其它各时期细胞均可作为核供体。其它各时期细胞均可作为核供体。（五）成功率低的原因（五）成功率低的原因n4.4.线粒体来源问题线粒体来源问题：无论直接注射还是细胞融合无论直接注射还是细胞融合,供体核都带入一部分细供体核都带入一部分细胞质。于是胞质。于是,就出现了移核胚胎的线粒体来源问题。就出现了移核胚胎的线粒体来源问题。结论不一致结论不一致：来源于：来源于受体；来源于共体与受体双方。受体；来

22、源于共体与受体双方。n5.5.端粒的问题端粒的问题：端粒：端粒(telomere)是染色体端部特化部分是染色体端部特化部分,因无黏性而能防因无黏性而能防止染色体黏着。细胞每复制一次端粒核苷酸就减少止染色体黏着。细胞每复制一次端粒核苷酸就减少50100bp。端粒复。端粒复制要靠端粒酶制要靠端粒酶(telomerase)。正常细胞缺乏此酶。正常细胞缺乏此酶,故端粒随细胞分裂而变故端粒随细胞分裂而变短短,细胞衰老。而生殖细胞和癌细胞则都有此酶细胞衰老。而生殖细胞和癌细胞则都有此酶,因此不衰老。那么因此不衰老。那么,克隆克隆动物是否会遗传供核细胞缩短的端粒而提前衰老呢动物是否会遗传供核细胞缩短的端粒而

23、提前衰老呢?不一致：多莉短；克不一致：多莉短；克隆牛不短。隆牛不短。（五）成功率低的原因（五）成功率低的原因n6.X-6.X-染色体灭活问题：染色体灭活问题：雌雄哺乳动物的雌雄哺乳动物的基因剂量补偿基因剂量补偿是通过是通过灭活灭活雌性动物雌性动物的的一条一条X-染色体染色体来实现的。正常情况下来实现的。正常情况下,着床前胚胎的两条着床前胚胎的两条X染色体都活动。染色体都活动。后来后来,上胚层中上胚层中X染色体随机灭活染色体随机灭活,而滋养层细胞则专门灭活父系而滋养层细胞则专门灭活父系X染色体。染色体。死亡克隆死亡克隆胎盘胎盘X染色体染色体随机灭活随机灭活,但但活克隆活克隆为为父亲父亲X染色体灭

24、活。染色体灭活。n7.7.克隆胚胎某些基因的再程序化异常克隆胚胎某些基因的再程序化异常：已经证明：已经证明,受精后父系和母系基因组受精后父系和母系基因组都发生广泛的都发生广泛的去甲基化去甲基化。有人证明。有人证明,牛着床前牛着床前移核胚胎移核胚胎中有些重复序列的中有些重复序列的甲甲基化异常基化异常,某些胚胎基因往往不能再激活。某些胚胎基因往往不能再激活。这说明这说明,大多数克隆胚胎的后成大多数克隆胚胎的后成性再程序化异常性再程序化异常,不彻底的再程序化可能是造成克隆成功率低的原因。不彻底的再程序化可能是造成克隆成功率低的原因。医用细胞工程医用细胞工程基因导入基因导入基因治疗基因治疗Gene T

25、herapyGene Therapy 内容提示 基因治疗基因治疗(genetherapy)体细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗体细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗 基因转移方法基因转移方法 靶细胞特点、靶细胞种类靶细胞特点、靶细胞种类 反义寡核苷酸技术反义寡核苷酸技术 自杀基因与旁观者效应自杀基因与旁观者效应基因治疗（基因治疗（Genetherapy）基因治疗（基因治疗（Genetherapy）：指应用：指应用DNA重组技术，将重组技术，将外源正常基因外源正常基因导入导入靶细靶细胞胞，以，以纠正纠正或或补偿补偿因基因缺陷和异常引起因基因缺陷和异常引起的疾病的疾病,以达到治疗的目的。以达到治疗的目的。为

26、达到这一目的，实施相应的策略。为达到这一目的，实施相应的策略。为达到这一目的，实施相应的策略。为达到这一目的，实施相应的策略。一、基因治疗策略一、基因治疗策略策略：直接基因治疗和间接基因治疗策略：直接基因治疗和间接基因治疗1、直接基因治疗：、直接基因治疗：纠正纠正突变基因突变基因 在在原位原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较为较理想理想的基因治疗策略，由于存在某些问的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）题，目前正在努力之中。（未实现）2 2、间接疗法：、间接疗法：以正常的基因以正常的基因替代替代致病基因致病基因。导入外源正常基因，导入

27、外源正常基因，代替代替有缺陷的基因。而有缺陷的基因。而 对靶细胞而言，对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因没有去除或修复有缺陷的基因。用用DNADNA重组技术重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。目的。途途径径:就基因转移的就基因转移的受体细胞受体细胞不同，不同，基因治疗有两种途径：基因治疗有两种途径：1、生殖细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗2、体细胞基因治疗、体细胞基因治疗 1、生殖细胞基因治疗l l将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细

28、胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为为理想理想的治疗方法，从的治疗方法，从根本根本上治疗遗传病，上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。使其有害基因不能在人群中散播。但还存在某些问题：但还存在某些问题：1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；2）基因转移效率不高，只能用）基因转移效率不高，只能用显微注射显微注射方法；方法；3）只适用于排卵周期）只适用于排卵周期短而次数多短而次数多的动物，很难适的动物，很难适用于人类。用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细

29、胞的办法。一次可获取少者获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多个，多者十几个。）者十几个。）2体细胞基因治疗somatic cell gene therapy 将正常基因转移到将正常基因转移到体细胞体细胞，使之表达基，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。遗传给后代。措 施：（1 1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效 表达后，再回输到体内。表达后，再回输到体内。（2 2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体 上，准确的替换异常基因，是上，准确的替换异

30、常基因，是理想理想的措施。的措施。（3 3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达）随机整合，非特定座位，只要有效的表达 即可达到治疗的目的。即可达到治疗的目的。（4 4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体 细胞。细胞。存在的问题 l l对特定座位基因转移，目前还存在较大对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；困难；l l随机插入可能引起后代的基因突变。随机插入可能引起后代的基因突变。二二、基因治疗的方法、基因治疗的方法基因治疗的关键性步骤基因治疗的关键性步骤-目的基因的目的基因的获得与转移获得与转移基因治疗首先获得目的基因通常从基因治疗首先获得目的基因通

31、常从基因组基因组中分离中分离 基因克隆基因克隆 定定 位位 表表 达达 评价表达情况评价表达情况一）目的基因的获得一）目的基因的获得 正常基因的分离与克隆正常基因的分离与克隆二）外源基因的转移l l通过不同方法，将目的基因转移至受体通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。细胞。1）物理方法（1）电穿孔法电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。可渗进细胞，进而表达。瞬间瞬间细胞细胞细胞膜核膜通透性增加细胞膜核膜通透性增加高压脉冲

32、高压脉冲 DNA渗入细胞渗入细胞（2 2）显微注射法）显微注射法（microinjection microinjection）利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核胞核 例：转基因动物的制备重组基因重组基因重组基因重组基因DNADNA 微注射微注射微注射微注射（体外）（体外）（体外）（体外）小鼠受精卵小鼠受精卵小鼠受精卵小鼠受精卵回植回植回植回植假妊娠假妊娠假妊娠假妊娠 仔仔仔仔 鼠鼠鼠鼠动物模型：转基因鼠动物模型：转基因鼠动物模型：转基因鼠动物模型：转基因鼠(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传

33、每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)clonesheepDollyclonesheepDolly体细胞体细胞体细胞体细胞 提取提取提取提取 核核核核重组细胞重组细胞重组细胞重组细胞回植回植回植回植DollyDolly卵细胞卵细胞卵细胞卵细胞 去核去核去核去核细胞细胞细胞细胞（3）微粒子轰击法l l利用亚微粒的利用亚微粒的钨钨和和金金能吸附能吸附DNA，并将其包，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速度，裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损

34、伤靶细胞。的目的，而不损伤靶细胞。l l该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。乳腺等细胞中表达。2）化学法磷酸钙沉淀法：磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNADNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。磷酸钙磷酸钙+DNA 混合微细颗粒混合微细颗粒 沉淀反应沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露细胞在沉淀物中暴露 524h 方法方法简单简单，但转化，但转

35、化效率低效率低。3 3）脂质体法（）脂质体法（liposomeliposome）l l应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构脂脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。导入靶细胞，使其表达。DNA 细胞融合细胞融合转化细胞转化细胞 PEG 仙苔病毒仙苔病毒仙苔病毒仙苔病毒DNA脂膜脂膜4 4）同源重组法）同源重组法 同源重组（同源重组（homologusrecombination）:外源基因和染色体上的外源基因和染色体上的基因在基因在同源序列同源序列间发生重组而插入染色体。间发生重组而插入染色体。

36、是将外源基因是将外源基因定位定位导入细胞的染色体上。导入细胞的染色体上。单交换单交换 双交换双交换 通过同源重组定点插入珠蛋白基因Xba IBstXIXba IneoXbaIBstXIneo正常基因座位正常基因座位带有珠蛋白基带有珠蛋白基因的质粒因的质粒 C重重组组后，插入外源基因片段后，插入外源基因片段带带有有neo基因（新霉素抗性基因），基因（新霉素抗性基因），重重组组后的后的细细胞在含有胞在含有neo 的培养基中生的培养基中生长长，没有插入新基因的，没有插入新基因的细细胞死亡，将有重胞死亡，将有重组组的的细细胞胞筛选筛选出来。出来。5 5）病毒介导基因内转移（）病毒介导基因内转移（Vir

37、al mediated Viral mediated transfertransfer）l l是通过病毒为载体（是通过病毒为载体（vectorvector），将外源基），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞受体细胞感染细胞重组病毒 逆转录病毒逆转录病毒(RNA)(RNA)常用的病毒载体常用的病毒载体 DNA DNA病毒病毒 1)1)逆转录病毒（逆转录病毒（retrovirusretrovirus）目前应用最多、最成功目前应用最多、最成功.病毒感染细胞病毒感染细胞后，其基因组后，其基因组RNA RNA 经逆转录产生双链经逆转录产生双链DNADN

38、A拷拷贝，插入宿主染色体形成前病毒贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirusprovirus），前病毒转录产生的正链既），前病毒转录产生的正链既是病毒是病毒RNARNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。装成新的病毒颗粒。例如：小鼠白血病病毒（例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLVMo-MLV）基因）基因组结构：组结构：LTR LTR LTR LTR gag pol env gag pol envU3 R U5 U3 R U5U3 R U5 U3 R U5 U3=U3=增强子，增强子，增强子，增强子，R=R=启动子，启动子，启动子，启动子，U5=U5=转录

39、起始位点。转录起始位点。转录起始位点。转录起始位点。=病毒包装信号，病毒包装信号，病毒包装信号，病毒包装信号，gag=gag=核心抗原，核心抗原，核心抗原，核心抗原，pol=pol=逆转逆转逆转逆转录酶，录酶，录酶，录酶，env=env=外壳蛋白。外壳蛋白。外壳蛋白。外壳蛋白。逆转录病毒载体优点：高效感染宿主细胞，转染率可达高效感染宿主细胞，转染率可达100%病毒基因和所载的外源基因都可能表达病毒基因和所载的外源基因都可能表达宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留缺 点 病毒基因容量有限，一般只能插入病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左左右片段；右片

40、段；病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的附近的基因过度表达或失活，插入的外外源基因可能不适当的表达；源基因可能不适当的表达；逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。胞癌变。根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留病毒基因，保留LTR和和包装信号。包装信号。6）受体载体转移法l l将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表将

41、含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。的目的。重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒配体配体配体配体细胞膜细胞膜复合物复合物复合物复合物三）靶细胞的选择三）靶细胞的选择l l靶细胞靶细胞是指接受外源是指接受外源GeneGene的的体体细胞细胞选择靶细胞的选择靶细胞的原则原则是：是：1 1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术 操作；操作；2 2）易于由人体分离又便于输回体内）易于由人体分离又便于输回体内3 3）具

42、有增殖优势，生命周期长（能存活几月至）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至 几年，或整个生命周期）几年，或整个生命周期）4 4）易于受外源遗传物质转化。）易于受外源遗传物质转化。常见的靶细胞常见的靶细胞l l外周血外周血外周血外周血T T T T淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞l l上皮细胞上皮细胞上皮细胞上皮细胞l l内皮内皮内皮内皮l l皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞l l造血干细胞造血干细胞造血干细胞造血干细胞地中海贫血、严重地中海贫血、严重地中海贫血、严重地中海贫血、严重 复合免疫缺陷病等基因治疗复合免疫缺陷病等基因治疗复合免疫缺陷病等基因治疗复合免疫缺陷病

43、等基因治疗l l肝肝肝肝C C C C家族性高胆固醇血症、低密度家族性高胆固醇血症、低密度家族性高胆固醇血症、低密度家族性高胆固醇血症、低密度 脂蛋白病的基因治疗脂蛋白病的基因治疗脂蛋白病的基因治疗脂蛋白病的基因治疗l l肌细胞肌细胞肌细胞肌细胞第三节第三节 基因表达的调控基因表达的调控n一、基因表达调控的例征一、基因表达调控的例征n（一）不同条件下的基因激活（一）不同条件下的基因激活n1 1、细菌、细菌和其他单细胞生物中，不同条件下可形成不同的酶是广泛存在的和其他单细胞生物中，不同条件下可形成不同的酶是广泛存在的现象。许多单细胞生物生活在水溶液中，溶液的温度、现象。许多单细胞生物生活在水溶液

44、中，溶液的温度、pHpH、培养基成分、培养基成分经常变化，细胞必须随时改变酶的成分，才能适应周围环境的变化。经常变化，细胞必须随时改变酶的成分，才能适应周围环境的变化。n2 2、酵母菌、酵母菌小菌落在缺氧、有氧条件下，均酵解；大菌落无氧酵解，有氧小菌落在缺氧、有氧条件下，均酵解；大菌落无氧酵解，有氧进行有氧呼吸。进行有氧呼吸。n3 3、人类、人类的乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶都是诱导酶的乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶都是诱导酶。一、基因表达调控的例征一、基因表达调控的例征（二）不同发育阶段的基因活性（二）不同发育阶段的基因活性 多细胞生物的不同组织细胞的基因活性仍有很大差别。多细胞生物的不同组织细胞的基因活

45、性仍有很大差别。1 1、脊椎动物细胞内的乳酸脱氢酶的变化：、脊椎动物细胞内的乳酸脱氢酶的变化：LDHLDH有五类：有五类：LDH1LDH5LDH1LDH5。小鼠卵细胞中，只有小鼠卵细胞中，只有LDH1LDH1，大约发育到第，大约发育到第9 9天，主要是天，主要是LDH5LDH5，再，再发育又出现发育又出现LDH1LDH1，表明编码，表明编码LDH1LDH1和和 LDH5 LDH5的基因在不同时期分别处于打的基因在不同时期分别处于打开和关闭的状态。开和关闭的状态。2 2、人的血红蛋白组成的变化：、人的血红蛋白组成的变化：血红蛋白用于氧的运输，在人发育的各个阶血红蛋白用于氧的运输，在人发育的各个阶

46、段中，血红蛋白的组成各不相同。段中，血红蛋白的组成各不相同。早期胚胎（早期胚胎（1-31-3个月）：个月）：HbGower1HbGower1、HbGower2HbGower2、HbPotlandHbPotland三种血红蛋白。三种血红蛋白。胎儿：胎儿：HbFHbF、HbAHbA新生儿：新生儿：HbF7080%HbF7080%、HbA3020%HbA3020%成人：成人：HbA95%HbA95%、HbAHbA2 22.5%2.5%、HbF1%HbF1%二、原核类基因表达的调控二、原核类基因表达的调控*细菌和噬菌体的基因调控细菌和噬菌体的基因调控多数多数发生在发生在转录水平转录水平上，操纵子是细菌

47、主要的上，操纵子是细菌主要的基因调控单位，即转录单位。基因调控单位，即转录单位。1960 1960年雅各布和莫诺共同提出了年雅各布和莫诺共同提出了乳糖操纵子模型乳糖操纵子模型。其调控机理：。其调控机理：乳糖操纵子乳糖操纵子=启动基因（启动基因（P P）+操纵基因（操纵基因（O O）+结构基因（结构基因（lacZlacZ、lacYlacY和和lacAlacA三个）组成，操纵子的前边有一个调节基因三个）组成，操纵子的前边有一个调节基因R R。乳糖操纵子的调节基因乳糖操纵子的调节基因R R能产生一种阻遏物（能产生一种阻遏物（阻遏蛋白阻遏蛋白），当培养基中），当培养基中没有乳糖时，阻遏蛋白没有乳糖时，

48、阻遏蛋白与与操纵基因操纵基因相结合相结合，阻值，阻值RNARNA聚合酶的前进，聚合酶的前进，mRNAmRNA转录就不能进行转录就不能进行，乳糖代谢所需三种酶就不能合成。，乳糖代谢所需三种酶就不能合成。当培养基中当培养基中有乳糖时有乳糖时，乳糖乳糖与与阻遏蛋白阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构型发生变化，结合，使阻遏蛋白构型发生变化，失去与操纵基因结合的能力，这时失去与操纵基因结合的能力，这时结构基因可转录出结构基因可转录出mRNAmRNA，进一步合成乳，进一步合成乳糖代谢所需三种酶利用乳糖。糖代谢所需三种酶利用乳糖。三、真核类基因表达的调控三、真核类基因表达的调控（一）真核生物与原核生物基因表达调控的

49、（一）真核生物与原核生物基因表达调控的差异差异*1、分子水平上的区别：、分子水平上的区别：真核细胞基因组的含量和基因数量远远高于原核细真核细胞基因组的含量和基因数量远远高于原核细胞，并且胞，并且DNA与组蛋白结合成核小体结构，同时与非组蛋白结合成染色与组蛋白结合成核小体结构，同时与非组蛋白结合成染色体。体。2、细胞水平上的区别：、细胞水平上的区别：真核细胞的染色体是被包在核膜内，转录和翻译分真核细胞的染色体是被包在核膜内，转录和翻译分别在细胞核和细胞质中进行。别在细胞核和细胞质中进行。3、个体水平上的区别：、个体水平上的区别：绝大多数真核生物都是复杂的多细胞有机体，个体绝大多数真核生物都是复杂

50、的多细胞有机体，个体发育过程复杂，不同组织细胞的基因，总是在不同的时空序列中被活化发育过程复杂，不同组织细胞的基因，总是在不同的时空序列中被活化或阻遏。或阻遏。因此，真核细胞基因表达的调控是一种多层次的调控系统，它涉及到因此，真核细胞基因表达的调控是一种多层次的调控系统，它涉及到DNA水平、转录水平、转录后水平、翻译水平等多个调控点。水平、转录水平、转录后水平、翻译水平等多个调控点。三、真核类基因表达的调控三、真核类基因表达的调控（二）真核类基因不同层次的表达和调控（二）真核类基因不同层次的表达和调控类型类型1 1、染色体、染色体、DNADNA水平上的调控水平上的调控（1 1）染色质丢失：）染