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1、层层 析析CHROMATOGRAPHY掌握：掌握：凝胶的结构与性质凝胶的结构与性质凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理装层析柱的过程及装柱要求装层析柱的过程及装柱要求熟悉：层析技术的分类熟悉：层析技术的分类凝胶层析的特点凝胶层析的特点层析的概念、一般原理层析的概念、一般原理了解：凝胶的选择了解：凝胶的选择柱、样品、洗脱液的选择柱、样品、洗脱液的选择凝胶的保存凝胶的保存 层层析析Chromatography(色色谱谱),利利用用混混合合物物中中各各组组分分的的物物理理化化学学性性质质间间的的差差异异(溶溶解解度度、分分子子极极性性、分分子子大大小小、分分子子形形状状、吸吸附附能能力力、分分子子亲
2、亲合合力力等等)，使使各各组组分分在在支支持持物物上上集集中中分分布布在在不不同同区区域域，借借此此将将各各组组分分分离。分离。层层析析法法进进行行时时有有两两个个相相，一一个个相相称称为为固固定定相相(Stationaryphase)，另另一一相相称称为为流流动动相相(Mobilephase)。由由于于各各组组分分所所受受固固定定相相的的阻阻力力和和流流动动相相的的推推力力影影响响不不同同，各各组组分分移移动动速速度度也也各各异异，从而使各组分得到分离从而使各组分得到分离。1.按两相所处的按两相所处的状态状态分类分类以以液液体体作作为为流流动动相相的的层层析析称称为为液液相相层层析析，以气体
3、作为，以气体作为流动相流动相的称为的称为气相层析气相层析。其其固固定定相相也也可可有有两两种种状状态态，一一种种是是以以固固体体作作为为吸吸附附剂剂的的固固定定相相，另另一一种种是是以以涂涂布在固体载体表面的布在固体载体表面的液体液体作为固定相。作为固定相。层析层析气相层析（气相层析（gas-chromatography）液相层析（液相层析（liquid-chromatography）气气-固层析（固层析（gas-solidchromatography）气气-液层析（液层析（gas-liquidchromatography）液液-固层析（固层析（liquid-solidchromatograp
4、hy）液液-液层析（液层析（liquid-liquidchromatography）.吸附层析吸附层析(adsorptionchromatography)-利用吸附剂对不同组分利用吸附剂对不同组分吸附吸附能力的不同能力的不同加以分离的方法。加以分离的方法。.分配层析分配层析(partitionchromatography)-利用不同组分在流动相和固定相中的利用不同组分在流动相和固定相中的分配系数分配系数不同而进行分离的方法。不同而进行分离的方法。.离子交换层析离子交换层析（ion-exchangechromatography）-利利用用离离子子交交换换剂剂与与各各组组分分之之间间的的离离子子亲
5、亲和和力不同力不同而进行层析分离的方法。而进行层析分离的方法。.凝胶层析凝胶层析（gelchromatography）-利利用用不不同同组组分分之之间间分分子子大大小小不不同同，在在通通过过凝凝胶胶介介质质时时所所受受到到的的阻阻滞滞作作用用的的差差异异而而进行分离的方法。进行分离的方法。.亲和层析亲和层析（affinitychromatography）-利利用用生生物物大大分分子子之之间间特特有有亲亲和和力力的的不不同同进分离纯化的方法。进分离纯化的方法。.柱层析柱层析（columchromatography）-将将固固定定相相装装在在层层析析柱柱中中，使使样样品品朝朝着着一一个个方方向向移
6、移动动，通通过过各各组组分分随随流流动动相相流流动而得到分离的方法。动而得到分离的方法。纸层析纸层析（paperchrmatography）-用用纸纸作为液体的载体，样品点在作为液体的载体，样品点在纸上随后展开达到分离鉴定的纸上随后展开达到分离鉴定的方法。方法。.薄层层析薄层层析（thinlayperchromatography）-将适当的将适当的吸附剂吸附剂在玻璃板或在玻璃板或其他材料薄板上其他材料薄板上铺成薄层铺成薄层，样品，样品点在上面随后用流动相展开达点在上面随后用流动相展开达到分离鉴定的方法。到分离鉴定的方法。二、塔板理论 最早由最早由MartinMartin等人提出塔板理论，把色等
7、人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。标。凝胶层析凝胶层析GelChromatography一、定义一、定义凝凝胶胶层层析析是是按按照照被被分分离离物物质质分分子子大大小小,经经过过具具有有一一定定孔孔径径的的多多孔孔物物质质进进行行分分离离的的一一种种方方法法。其其又又称称为为凝凝胶胶过过滤滤或或分分子子筛筛过滤过滤或排阻层析。或排阻层析。主要机理是主要机理是分子筛效应分子筛效应,当被分离物质
8、当被分离物质流经凝胶柱时流经凝胶柱时,因各组份的因各组份的分子大小不同分子大小不同,在凝胶受到的在凝胶受到的阻滞作用有差异阻滞作用有差异,从而造成各从而造成各组分在凝胶柱中的组分在凝胶柱中的迁移速度不同迁移速度不同得到分得到分离。流动相（洗脱液）流动相（洗脱液）固定相（凝胶）固定相（凝胶）原理原理：被分离物质中各组分的：被分离物质中各组分的分子量分子量不同不同。进入具有一定孔径的凝胶柱后进入具有一定孔径的凝胶柱后,较较大大的的分子分子不能进入凝胶孔隙不能进入凝胶孔隙中中,被排阻在外被排阻在外,而而较较小小的分子则的分子则能进入凝胶孔隙能进入凝胶孔隙,加入洗脱剂加入洗脱剂后后,大分子大分子就随洗
9、脱剂从凝胶间隙洗脱下来就随洗脱剂从凝胶间隙洗脱下来,受到的受到的阻力小阻力小,其其流速较快流速较快,小分子小分子物质从物质从上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝胶孔隙中胶孔隙中,这样这样多次反复多次反复,大分子物质先从大分子物质先从柱中流出柱中流出,小分子物质后流出小分子物质后流出。小小分分子子由由于于扩扩散散作作用用进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部而而被被滞滞留留,大大分分子子被被排排阻阻在在凝凝胶胶颗颗粒粒外外面面,在颗粒之间在颗粒之间迅速通过迅速通过。三、常用术语三、常用术语 1固定相固定相固定相是由层析基质组成的。其基质包括：固体物质(如吸附剂、离子
10、 交换剂)液体物质(如固定在纤维素 或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附吸附吸附吸附、溶解溶解溶解溶解和交换交换交换交换作用。2流动相流动相 在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体液体或气体液体或气体液体或气体称为流动相。在柱层析时，流动相又称洗脱剂洗脱剂洗脱剂洗脱剂或洗涤剂洗涤剂洗涤剂洗涤剂(即推动有效成分或杂质向一定方面移动的溶液)。在薄层层析时，流动相又称展层剂展层剂展层剂展层剂。3 3层析层析 以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分分分分配配配配、吸附吸附吸附吸附或交换交换交换交换作用，最
11、终结果是使混合物得到分离。4操作容量操作容量 即在特定条件下，某种成分与基质反应反应反应反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量饱和容量饱和容量饱和容量；一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。(mmol/g,mg/g,mmol/ml,mg/ml)其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。5床体积床体积(Vt)通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(V Vt t)。V Vt t是基质的外水体积(V0 0)和内水体积(Vi i)以及自身体积(Vg g)的总总总总和和和和，即:V V V Vt t t t=V=V=V=V0 0 0 0+V+V+V+Vi i i
12、 i+V+V+V+Vg g g g (详见图3-1)6洗脱体积洗脱体积(Ve)洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。用Ve e表示(见图3-7中OB)。V V V Ve e e e=V=V=V=V0 0 0 0K K K Kavavavav()7外水体积外水体积(V0)外水体积指基质颗粒之间之间体积的总和。8内水体积内水体积(Vi)内水体积是指基质颗粒内部内部体积体积的总和。9基质体积基质体积(Vg)基质体积是指基质自身所具有的体积。V0 0、Vi i、Vg g都是随着床体积和基质性质变化而变化的。+凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径凝胶
13、过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径较一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可完全或部分排阻较一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则可以在筛某些大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则可以在筛孔中自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻的程度孔中自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻的程度用分配系数用分配系数 表示表示 洗脱体积；洗脱体积；外水体积；外水体积；凝胶床体积凝胶床体积 在一定层析条件下，在一定层析条件下，和和 均为固定值，而均为固定值，而 随着被分离物分子量的随着被分离物分子量的变化而变化。组分分子量越大，则洗脱更
14、容易（排阻越多），变化而变化。组分分子量越大，则洗脱更容易（排阻越多），越小，越小，越小越小 各组分间的各组分间的 值差异越大，分离效果越好；值差异越大，分离效果越好；差异越小差异越小,则分离效果很差，或根本无法分离则分离效果很差，或根本无法分离 流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分 1、当当Kav=0时时，则则Ve=Vo，即即对对于于根根本本不不能能进进入入凝凝胶胶内内部部的的大大分分子子物物质质全全排排阻阻，洗洗脱脱体体积积等等于于空空隙隙
15、体体积积即即外外水水体体积积（图图中组分中组分）2、当当Kav=1时时，Ve=Vo+Vi。即即小小分分子子可可完完全全渗渗入入凝凝胶胶内内部部时时，洗洗脱脱体体积积应应为为空空隙隙体体积积与与内内水水体体积积之之和和。Ve=Vo+Vi（图中组分（图中组分）3 3、当当0 0K Kavav1 1时时，V Ve e=V Vo o+K Kavav（V Vi i V Vg g）。表表示示固固定定相相中中只只有有一一部部分分可可被被组组分分扩扩散散渗渗入入，一一部部分分被被排排阻阻，V Ve e即即在在V Vo o与与V Vo o+V Vi iV Vg g之间变化（图中组分之间变化（图中组分）4 4、有
16、时、有时K Kavav1 1，表示凝胶对组分有吸附作用表示凝胶对组分有吸附作用 （从内水中从内水中洗脱出来的含量下降），此时洗脱出来的含量下降），此时V Ve eV Vo o+V Vi iV Vg g。例如一些芳例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在Sephadex Sephadex G-25G-25中的洗脱体积远超出理论计算的最大值中的洗脱体积远超出理论计算的最大值10膨胀度膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分在一定溶液中，单位重量的基质充分溶溶胀胀后所占有的体积用后所占有的体积用V V表示。即每克溶表示。即每克溶胀基质所具有的床体积。
17、胀基质所具有的床体积。V=Vt/g 一般一般亲水性亲水性基质的膨胀度比基质的膨胀度比疏水性疏水性的的大大。（一）优点（一）优点1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结构稳定构稳定,所以凝胶所以凝胶本身不与样品发生化本身不与样品发生化学反应。学反应。操作条件较温和操作条件较温和,不易引起生不易引起生物物质的变性物物质的变性,即使用来分离一些理化性即使用来分离一些理化性质不稳定的物质也很少被破坏。质不稳定的物质也很少被破坏。3.样品得率高样品得率高,重复性好重复性好.如果按比例扩大柱如果按比例扩大柱的体积和高度的体积和高度,可进行大量样品的分离纯可进行大量样品的分离
18、纯化。化。（二）缺点（二）缺点1.要求要求样品和洗脱液的样品和洗脱液的粘度很低粘度很低。孔径大小非常有限孔径大小非常有限,所以可被所以可被纯化的物质的纯化的物质的分子量范围受到限制分子量范围受到限制。对某些溶质分子具有吸附作用对某些溶质分子具有吸附作用,如如芳香族化合物与脂蛋白等。芳香族化合物与脂蛋白等。（商品名为（商品名为Sephadex）结构：结构：葡葡聚聚糖糖用用交交联联剂剂1-氯氯代代-2,3-环环丙丙烷烷使使葡葡聚聚糖糖之间通过醚键之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联交联聚合而成的聚合而成的三维空间网状结构三维空间网状结构。OH1.特点：特点：Sephadex的的三
19、三维维空空间间网网状状结结构构的的网网孔孔大大小小取取决决于于交交联联度度,交交联联度度的的大大小小可可在在合合成成Sephadex时时控控制制加加入入交交联联剂剂的的百百分分比比决决定定.交交联联剂剂的的百百分分比比高高,交交联联度度大大,网网状状结结构构愈愈紧紧密密,孔孔隙隙愈愈小小,吸吸水水后后膨膨胀胀也也愈愈小小,机机械械强强度度高高,分分离离物物质质的的分分子子量量也也小小。反反之之,交交联联剂剂的的百百分分比比低低,分分离离物物质质的的分分子子量量大大。G类类Sephadex的的型型号号表表示示每每克克干干凝凝胶胶吸吸水水量量x10,如如G-50表表示示每每克克干干凝胶吸水量为凝胶
20、吸水量为5ml。Sephadex的的化学性质稳定化学性质稳定,不溶于水、盐、弱酸和碱不溶于水、盐、弱酸和碱,耐热耐碱不耐酸耐热耐碱不耐酸。2 2稳定性稳定性 葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。很少产生化学降解。在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120)(120)消毒，其性质并不改变。在溶液中浸泡消毒，其性质并不改变。在溶液中浸泡1-2h1-2h，甚至在，甚至在L HClL HCl溶液中浸泡溶液中浸泡6 6个月
21、以上，对个月以上，对分离效果无明显的影响。分离效果无明显的影响。但是，当暴露于但是，当暴露于强酸或氧化剂强酸或氧化剂溶液时，则容溶液时，则容易使易使糖苷键水解断裂糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。，因此，要避免与其接触。3 3吸附性吸附性 葡聚糖凝胶系葡聚糖凝胶系弱酸性弱酸性物质、这是由于其每克干物质、这是由于其每克干胶含胶含101020ug20ug当量的羧基基团所致。该基团能与分当量的羧基基团所致。该基团能与分离物中电荷基团离物中电荷基团(尤其是碱性蛋白质尤其是碱性蛋白质)发生发生吸附作用吸附作用。当离子强度大于时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附当离子强度大于时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力
22、了。因此进行葡聚糖凝胶层析时，常用力了。因此进行葡聚糖凝胶层析时，常用含有含有NaClNaCl的缓冲液作洗脱液。的缓冲液作洗脱液。（商品名为（商品名为Sepharose)它它是是一一种种大大孔孔凝凝胶胶,其其工工作作范范围围的的下下限限几几乎乎是是Sephadex的的上上限限,可可分分离离MW40万万以以上上的的物物质质,因此可用来分离核酸及病毒。因此可用来分离核酸及病毒。琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶不不带带电电荷荷,不不受受微微生生物物作作用用而而降降解解,但对热不稳定但对热不稳定,易受易受pH影响影响(只在范围内稳定只在范围内稳定.琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性机械强度和筛孔的稳定
23、性都比葡都比葡聚糖凝胶好，分离范围大。用琼脂糖凝胶进行柱层聚糖凝胶好，分离范围大。用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。析时，流速可以快些。最最好好使使用用条条件件控控制制在在pH pH 4 49 9之之间间，温温度度0 04040，超出此范围超出此范围,可能被破坏。可能被破坏。琼脂糖凝胶规格琼脂糖凝胶规格 瑞典和国产的产品有瑞典和国产的产品有3 3种规格：种规格：Sepharose2B、4B、6B分别表示琼脂糖浓度分别表示琼脂糖浓度为为2%、4%、6%。美国的为美国的为BioGA，有，有6个型号个型号:即即，5M，15M，50M和和150M。阿拉伯数阿拉伯数字乘以字乘以106表示排阻限度。
24、表示排阻限度。3.聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶使使用用范范围围及及效效果果同同葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶相相似似,但但化化学学性性质较葡聚糖稳定质较葡聚糖稳定,可在可在pH2-11范围内使用范围内使用.聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶的的商商品品为为生生物物胶胶P（Bio-GelP），由由美美国国Bio-Rod厂厂生生产产，型型号号很很多多，从从P-2至至P-300共共10种种，P后后面面的的数数字字再再乘乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。就相当于该凝胶的排阻限度。聚丙烯酰胺凝胶的结构聚丙烯酰胺凝胶的结构单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，并一般聚丙
25、烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，并以干凝胶形式出售，使用时必须溶胀。以干凝胶形式出售，使用时必须溶胀。稳定性：稳定性：该凝胶不溶于水和普通有机溶剂，该凝胶不溶于水和普通有机溶剂，能忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；在能忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；在PH1-10PH1-10或短时间超过此或短时间超过此pHpH范围的溶液中较稳定，范围的溶液中较稳定，要避免长期与强酸和强碱接触，如果与其接触要避免长期与强酸和强碱接触，如果与其接触并在高温条件下，酚胺基将迅速发生分解。并在高温条件下，酚胺基将迅速发生分解。物理化学性质物理化学性质 吸附性：吸附性：聚丙烯酰胺凝胶对芳香族的、酸性聚丙烯酰胺凝胶对芳香
26、族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象，如使用离子强度和碱性的化合物稍有吸附现象，如使用离子强度略高的洗脱液操作，此弊病可以克服。略高的洗脱液操作，此弊病可以克服。不为微生物利用，易保存。不为微生物利用，易保存。4 4、SephacrylSephacryl SephacrylSephacryl是由是由烯丙烷基葡聚糖烯丙烷基葡聚糖与与甲撑双丙甲撑双丙烯酰胺烯酰胺共价交联制成的，此凝胶属硬性凝胶，共价交联制成的，此凝胶属硬性凝胶，它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。SephacrylSephacryl吸水时，其珠状颗粒直径为吸水时，其珠状颗粒直径为25-25-
27、75um75um，通常是用于水相系统中。若在有机相系，通常是用于水相系统中。若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。统使用时，其孔径大小略有变化。化学性质稳定：化学性质稳定：它在所有的溶剂中不它在所有的溶剂中不溶解溶解，化学降解也很，化学降解也很少；它可在少；它可在pH2pH21111范围范围内使用，当内使用，当pHpH低时，葡低时，葡聚糖链发生少许水解作用；在溶液中聚糖链发生少许水解作用；在溶液中(室温室温)处理处理100h100h，对其低流速和多孔性没有明显影响，对其低流速和多孔性没有明显影响;用去用去污剂污剂(如如SDS)SDS)、6mo16mo1L L盐酸胍和盐酸胍和8mol/L8m
28、ol/L尿素溶液尿素溶液可作为洗脱剂，高温可作为洗脱剂，高温(120)(120)消毒时消毒时)处理后，层处理后，层析性质没有明显变化。析性质没有明显变化。S-100/200/300/400/500;HR200/300/400/500 S-100/200/300/400/500;HR200/300/400/500 5 5、SuperdexSuperdex SuperdexSuperdex是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成的。共价结合而成的。该凝胶具有良好的分子筛特性和物理、化学该凝胶具有良好的分子筛特性和物理、化学稳定性。在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度稳
29、定性。在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度可在可在pH3-12pH3-12范围内变化，溶液中加入去污剂范围内变化，溶液中加入去污剂(如如1 1SDS)SDS)和和(或或)解离剂解离剂(如如8mol/L8mol/L尿素、尿素、6mol6molL L盐盐酸胍酸胍)时，也不会影响分离效果。时，也不会影响分离效果。适合作大规模生产凝胶层析的填料。适合作大规模生产凝胶层析的填料。缺点：对蛋白质有吸附能力。缺点：对蛋白质有吸附能力。6.凝胶的选择凝胶的选择选选择择何何种种凝凝胶胶以以及及它它的的型型号号,这这需需要要根根据据实实验验条条件件,溶溶质质的的分分子子量量的的大大小小和和分分离离工工作作的的目目的
30、的而而定定,每每种种型型号号凝凝胶胶都都有有一一定定分分离离溶溶质质分分子子量量的的范范围围,选选择择的的型型号号凝凝胶胶要要能能满满足实验要求。足实验要求。层层析析的的长长度度（L）与与直直径径（D）之之比比（L/D）对对层层析析分分辨辨率率有有影影响响,一一般般对对用用于于组组别别分分离离的的层层析析柱柱其其L/D为为1518：1分分级级分分离离可可采采用用L/D40：1,甚至甚至100：1,层析柱体积一般大于样品体积的层析柱体积一般大于样品体积的25倍。倍。柱柱短短而而粗粗,则则易易使使样样品品稀稀释释,柱柱长长而而窄窄,则则柱柱的的管管壁壁效应较大效应较大,会造成拖尾现象。会造成拖尾现
31、象。2.样品的选择：样品的选择：量适当量适当,粘度小粘度小。3.洗脱液的选择：洗脱液的选择：每每种种样样品品分分离离所所用用的的缓缓冲冲洗洗脱脱液液应应根根据据使使样样品稳定品稳定的原则使用。的原则使用。凝胶层析法分离蛋白质凝胶层析法分离蛋白质 操作操作 1.1.装柱：装柱：在层析柱的底部出口套上乳胶塑料在层析柱的底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占体积的占体积的1/3时，关闭下端出口，自顶部缓时，关闭下端出口，自顶部缓缓加入已处理好的缓加入已处理好的Sephade
32、xG-50悬液，待悬液，待底部凝胶沉积底部凝胶沉积12cm时，再打开出口，凝胶时，再打开出口，凝胶加至凝胶沉积离层析柱口约加至凝胶沉积离层析柱口约3cm即可。即可。装柱注意点：装柱注意点：不得有气泡和分层不得有气泡和分层；凝胶表面应平整凝胶表面应平整；柱床体积稳定；柱床体积稳定；不能让凝胶表面露出水面。不能让凝胶表面露出水面。凝胶柱的鉴定凝胶柱的鉴定 新装的吸附柱用适当的缓冲液平衡后，将带色新装的吸附柱用适当的缓冲液平衡后，将带色的蓝色葡聚糖的蓝色葡聚糖-2000-2000、或者红色葡聚糖、细胞色素、或者红色葡聚糖、细胞色素C C、血红蛋白等物质配成血红蛋白等物质配成2mg/ml2mg/ml的
33、溶液过柱，观察色带的溶液过柱，观察色带是否均匀下降，如均匀下降，则表明柱中凝胶是均是否均匀下降，如均匀下降，则表明柱中凝胶是均匀的，或者说柱中没裂缝和气泡，是可以使用的，匀的，或者说柱中没裂缝和气泡，是可以使用的，否则就须重新装柱。否则就须重新装柱。2.2.加样加样：取样品液：取样品液5滴即为上柱样品。将出滴即为上柱样品。将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面，口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面，注意尽量注意尽量不要使平整的床表面搅动不要使平整的床
34、表面搅动，然后，然后打开出口，让样品进入床内，直至床面恰打开出口，让样品进入床内，直至床面恰好露出，用上法不断加蒸馏水洗涤好露出，用上法不断加蒸馏水洗涤，立即立即用试管收集，待红色流尽，换试管收集。用试管收集，待红色流尽，换试管收集。加加样样量量与与层层析析柱柱床床体体积积及及检检测测方方法法的的灵灵敏敏度度有有关关。床床体体积越小、方法灵敏度越高时，加样量越少积越小、方法灵敏度越高时，加样量越少层层析析的的目目的的在在于于分分析析时时，加加样样量量占占床床体体积积的的12，作作制备、脱盐用时，占制备、脱盐用时，占2030一一般般来来说说，加加样样量量越越少少，分分辨辨率率越越高高。具具体体加
35、加样样体体积积由由分配系数分配系数(Kav)或洗脱体积或洗脱体积(Ve)来决定来决定加样量加样量 V VeAeA、V VeBeB：组分组分A A、B B的洗脱体积的洗脱体积 K KavAavA、K KavBavB：组分：组分A A、B B的分配系数的分配系数 V Vs s：A A、B B两两组组分分的的洗洗脱脱体体积积之之差差（又又称称为为分分离离体体积积）V Vs s=V=VeA eA V VeBeB当当样样品品体体积积V Vp pV Vs s时时，理理论论上上的的洗洗脱脱图图形形是是两两种种物物质质恰恰好好分分开开(图图中中)。但但由由于于样样品品流流过过柱柱时时的的扩扩散散作作用用，其其
36、体体积积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大加样量（加样量（V Vp p）的确定）的确定 图图、中中A A、B B两两种种物物质质有有一一定定程程度度的的交交叉叉，这这表表明明二二者者只只是是部部分分分分开开。因因此此，当当V Vp p等等于于或或大大于于V Vs s时时，A A、B B两两种种物质就不能完全分开物质就不能完全分开(图中图中)当当V Vp pV Vs s时，时，A A、B B两种物质就能分开两种物质就能分开(图中图中)根据根据 V Ve e=V=Vo o+K+Kavav（Vi+VgVi+Vg）又又 V Vs s=V=VeAeAV VeB eB
37、 =（K KavAavAK KavB avB）（）（Vi+VgVi+Vg）A A、B B两种物质能分开的最低限：两种物质能分开的最低限：V Vp pV Vs s最大最大V Vs s时的必要条件：时的必要条件：KKavAavAK KavB avB 最大，为最大，为1 10 01 1 V Vi i+V+Vg g最大，一般为最大，一般为V Vt t/2/2则：则：最大理论加样量最大理论加样量V Vp pV Vs sV Vt t/2/2最大理论加样量的计算最大理论加样量的计算粘度对柱层析的影响粘度对柱层析的影响 样品与洗脱液的黏度相当为宜样品与洗脱液的黏度相当为宜流速对洗脱曲线的影响流速对洗脱曲线的影
38、响 3.洗脱洗脱 4、凝胶柱的再生及保存、凝胶柱的再生及保存 （1 1）、）、再生再生 仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后即可仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后即可再次使用；但使用过多次后，由于凝胶床体积变小、流再次使用；但使用过多次后，由于凝胶床体积变小、流动速度降低或污染杂质过多等原因，致使其正常性能受动速度降低或污染杂质过多等原因，致使其正常性能受到影响。在此情况下，如欲重复使用，就须进行再生处到影响。在此情况下，如欲重复使用，就须进行再生处理。理。方法是：先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进方法是：先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行平衡，平衡毕，即可重复使用；另一种方法
39、是，把凝行平衡，平衡毕，即可重复使用；另一种方法是，把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处理胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处理后重新装柱即可再行使用。后重新装柱即可再行使用。（2）保存方法：）保存方法：湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入适湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入适量的防腐剂如氯仿、量的防腐剂如氯仿、NaN3NaN3或或2020乙醇等，不然微生物将生乙醇等，不然微生物将生长。长。干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收缩，干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收缩，再抽干乙醇，用再抽干乙醇，用60-8060-80的暖风吹干，
40、在室温下保存。的暖风吹干，在室温下保存。半缩法：是过度法，用半缩法：是过度法，用60%-70%60%-70%的乙醇使凝胶部分脱水，的乙醇使凝胶部分脱水，然后封口，然后封口，4 4 保存。保存。凝胶过滤层析经常遇见的问题凝胶过滤层析经常遇见的问题1 1流速慢流速慢（1 1）有气泡、出水管阻塞）有气泡、出水管阻塞（2 2）硅胶层堵塞）硅胶层堵塞（3 3）柱压太紧（操作压过大、长期使用、接头漏气）柱压太紧（操作压过大、长期使用、接头漏气）2 2柱内产生气泡柱内产生气泡（1 1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流（2 2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧）接口漏气，如上水
41、口螺丝拧的不紧3 3条带扭曲条带扭曲（1 1）胶面不平）胶面不平（2 2）样品或洗脱液中有颗粒）样品或洗脱液中有颗粒（3 3）装柱不均匀）装柱不均匀4 4分辩率不高分辩率不高（1 1）装柱不均匀）装柱不均匀 （2 2）样品量过大）样品量过大（3 3）流速太快）流速太快（4 4）柱不垂直或柱不合适）柱不垂直或柱不合适（5 5）长菌）长菌 （6 6）柱下口软管太长）柱下口软管太长（7 7）胶不适当）胶不适当原原理理：盐盐类类小小分分子子物物质质进进入入凝凝胶胶筛筛孔孔，而而大大分分子子物物质质则则被被排阻在外排阻在外（分子筛原理）（分子筛原理）优点：优点：与透析相比，速度快，不会引起大分子物质变性
42、与透析相比，速度快，不会引起大分子物质变性材料：材料：细颗粒葡聚糖凝胶细颗粒葡聚糖凝胶G-25G-25 二、脱盐和浓缩二、脱盐和浓缩原原理理：Kav=blgM+c或或lgM=adKav(M为为分分子子质质量量，常数常数a、b、c、d均大于均大于0)先做标准曲线，再在相同条件下测样品先做标准曲线，再在相同条件下测样品Kav也可用以下也可用以下4个指标代替个指标代替VeVo：分离体积分离体积Ve/Vo：相对保留体积（另相对保留体积（另RVo/Ve）Ve/Vt：简化的洗脱体积，受柱的填充情况的影响较小简化的洗脱体积，受柱的填充情况的影响较小Ve：洗脱体积洗脱体积lgM=abVe特点：简便实用，所需样
43、品量较少特点：简便实用，所需样品量较少 三、测定分子质量三、测定分子质量pH6pH68 8的的范范围围内内，曲曲线线线线性性才才比比较较好好；而而在在极极端端pHpH时时，由由于变性等原因易偏高于变性等原因易偏高 一般一般适用于球状适用于球状propro的分子量测定，而纤维状的分子量测定，而纤维状propro不合适不合适糖蛋白中若糖蛋白中若糖的比例糖的比例5 5时，测定结果偏大时，测定结果偏大不受不受变性剂变性剂如尿素和盐酸胍的影响如尿素和盐酸胍的影响有些酶类不适用。如有些酶类不适用。如淀粉酶淀粉酶，能与葡聚糖凝胶形成络合，能与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶物，这种络合物与酶-底物络合物
44、相似，因此在凝胶层析时底物络合物相似，因此在凝胶层析时有异常反应有异常反应用凝胶过滤法测定分子量的局限性用凝胶过滤法测定分子量的局限性2003年中科院考研题年中科院考研题n今有今有a、b、c、d四种蛋白质，其分子体积由大四种蛋白质，其分子体积由大到小的顺序是到小的顺序是abcd，在凝胶过滤柱层析中，在凝胶过滤柱层析中，最先洗脱出来的蛋白质一般应该是（最先洗脱出来的蛋白质一般应该是（）nA、anB、bnC、cnD、d2000年中科院考研题年中科院考研题2003年上海师范大学考研题年上海师范大学考研题n指出从分子排阻层析柱上洗脱下来下列蛋白质指出从分子排阻层析柱上洗脱下来下列蛋白质时的洗脱顺序，为
45、什么？分离蛋白质的范围是时的洗脱顺序，为什么？分离蛋白质的范围是5,000-400,000。n肌红蛋白（马心肌）肌红蛋白（马心肌）16900n过氧化氢酶（马肝）过氧化氢酶（马肝）247500n细胞色素细胞色素c（牛心肌）（牛心肌）13370n肌球蛋白（鳕鱼肌）肌球蛋白（鳕鱼肌）524800n糜蛋白酶原（牛胰）糜蛋白酶原（牛胰）23240n血清清蛋白（人）血清清蛋白（人）685001 1在在凝凝胶胶层层析析柱柱中中分分离离某某有有效效成成分分时时，洗洗脱脱体体积积为为140140mlml，其其外外水水体体积积和和总总体体积积分分别别为为6060mlml和和200200mlml，求求分分配系数是多少配系数是多少?思考题思考题 解：解：V Ve e=V=Vo o+K+Kavav（V Vt t V Vo o ）140 140=60+K=60+Kavav（200200 60 60）K Kavav解：最大理论加样量解：最大理论加样量Vp=Vs=Vt/2=3.14(5.0/2)260/2=589ml思考题思考题2 2cm60cmcm60cm的凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最的凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最 多加多加样体积是多少毫升样体积是多少毫升?