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1、凝胶过滤层析凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。定义n n凝胶凝胶过滤层过滤层析是生化分离常用析是生化分离常用色色谱谱技技术术的一种。的一种。n n利用具有网状利用具有网状结结构的凝胶的构的凝胶的分子分子筛筛作用作用,根据被分离物根据被分离物质质的的分子大小不同分子大小不同来来进进行分离，也被称行分离，也被称为为体体积积排阻排阻层层析（析（size exclusi
2、on chromatographysize exclusion chromatography）、分子）、分子筛层筛层析析（Molecular Sieve ChromatographyMolecular Sieve Chromatography）、凝胶渗透）、凝胶渗透层层析（析（Gel Permeation ChromatographyGel Permeation Chromatography）应用l l凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。l l分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。l l利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进
3、行脱盐、去热源和脱色。原理n n凝胶是一凝胶是一类类多孔性高分子聚合物，每多孔性高分子聚合物，每个个颗颗粒犹如一个粒犹如一个筛筛子。子。n n当当样样品溶液通品溶液通过过凝胶柱凝胶柱时时，相相对对分子分子质质量量较较大大的物的物质质沿着凝胶沿着凝胶颗颗粒粒间间的孔的孔隙，随着溶隙，随着溶剂剂流流动动，首先流出，首先流出层层析柱；析柱；n n相相对对分子分子质质量量较较小小的物的物质质可自由地可自由地进进出凝胶出凝胶颗颗粒的网孔，使流量增粒的网孔，使流量增长长，移，移动动速率慢而最后流出速率慢而最后流出层层析柱。析柱。n n中等大小的分子中等大小的分子在大分子物在大分子物质质与小分与小分子物子物
4、质质之之间间被洗脱。被洗脱。n n这样这样，经过层经过层析柱，混合物中的各物析柱，混合物中的各物质质按其分子大小不同而被分离。按其分子大小不同而被分离。带网孔的带网孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子进入小分子进入葡聚糖珠内葡聚糖珠内大分子不大分子不能进入珠能进入珠内，经珠内，经珠之间缝隙之间缝隙流出流出固定相（凝胶）固定相（凝胶）n三维空间网状结构三维空间网状结构样品样品样品样品固固定定相相流流动动相相小分子小分子被延滯被延滯小分子小分子大分子大分子较较快流出快流出分子分子分子分子筛筛效效效效应应：按分子大小不同按分子大小不同按分子大小不同按分子大小不同,在凝胶受到的在凝胶受到的在凝胶受到的在凝胶受到
5、的阻阻阻阻滞作用滞作用滞作用滞作用有差异有差异有差异有差异,从而造成各从而造成各从而造成各从而造成各组组分在凝胶分在凝胶分在凝胶分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。柱中的迁移速度不同得到分离。柱中的迁移速度不同得到分离。柱中的迁移速度不同得到分离。基本概念n n外水体外水体外水体外水体积积(Vo)(Vo)是指凝胶柱中凝胶是指凝胶柱中凝胶是指凝胶柱中凝胶是指凝胶柱中凝胶颗颗粒周粒周粒周粒周围围空空空空间间的体的体的体的体积积，也就是凝胶，也就是凝胶，也就是凝胶，也就是凝胶颗颗粒粒粒粒间间液体流液体流液体流液体流动动相的体相的体相的体相的体积积。n n内水体内水体内水体内水体积积(Vi)(Vi)是
6、指凝胶是指凝胶是指凝胶是指凝胶颗颗粒中孔穴的体粒中孔穴的体粒中孔穴的体粒中孔穴的体积积。n n基基基基质质体体体体积积(Vg)(Vg)是指凝胶是指凝胶是指凝胶是指凝胶颗颗粒粒粒粒实际实际骨架体骨架体骨架体骨架体积积。n n柱床体柱床体柱床体柱床体积积(Vt)(Vt)就是指凝胶柱所能容就是指凝胶柱所能容就是指凝胶柱所能容就是指凝胶柱所能容纳纳的的的的总总体体体体积积。n n洗脱体洗脱体洗脱体洗脱体积积(Ve)(Ve)是指将是指将是指将是指将样样品中某一品中某一品中某一品中某一组组分洗脱下来所需洗脱液的体分洗脱下来所需洗脱液的体分洗脱下来所需洗脱液的体分洗脱下来所需洗脱液的体积积凝胶凝胶凝胶凝胶层
7、层析柱各种体析柱各种体析柱各种体析柱各种体积积示意示意示意示意图图（阴影部分）（阴影部分）（阴影部分）（阴影部分）分配系数（Kd）Ve=Vo+Ve=Vo+Ve=Vo+Ve=Vo+KdKdKdKdViViViVi(2)Ve=Vo+Vi(2)Ve=Vo+Vi，Kd=1Kd=1n分子完全不被排阻分子完全不被排阻n完全向凝胶颗粒内部扩散完全向凝胶颗粒内部扩散n在两相分配的比值为在两相分配的比值为1,1,最后流出最后流出(1)Ve=Vo(1)Ve=Vo，Kd=0Kd=0n分子完全被排阻于凝胶颗粒之外分子完全被排阻于凝胶颗粒之外n全部分布于流动相里全部分布于流动相里n最先流出最先流出(3)0 Kd 1(3
8、)0 Kd 1，Ve=Vo+ViKdVe=Vo+ViKdn为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散散n每个溶每个溶质分子在流分子在流动相和固定相之相和固定相之间有一个特定的分配系数有一个特定的分配系数特点：特点：与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关 Kd=0 0Kd=0 0Kd1 Kd=1Kd1 Kd=1洗脱体洗脱体洗脱体洗脱体积积小分子量小分子量大分子量大分子量典型的凝胶类型n交联葡聚糖凝胶：交联葡聚糖凝胶：SephadexSephadex n丙烯葡聚糖凝胶：丙烯葡聚糖凝胶：Sephacryl Sephacryl n琼脂糖凝胶：琼脂糖凝胶：SepharoseS
9、epharose和和Bio-GelBio-Gel n其它：有机凝胶其它：有机凝胶SepharonSepharon，交联聚醚，交联聚醚ToyopealToyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等，纤维素凝胶，改性刚性填料等凝胶过滤层析实验技术1、凝胶的、凝胶的选择2、凝胶的、凝胶的预处理理3、装柱、装柱4、样品的准品的准备5、上、上样6、洗脱和收集、洗脱和收集7、凝胶的再生及保存、凝胶的再生及保存凝胶过滤层析实验技术1、凝胶的、凝胶的选择n选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考何种凝胶及其型号、粒度，一方面
10、要考虑凝胶的性凝胶的性质，包括，包括凝胶的凝胶的分离范分离范围（渗入限与排阻限）、（渗入限与排阻限）、理化理化稳定性、定性、强度、度、非特异吸附性非特异吸附性质等。等。n对生物生物样品来品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极分子量极为悬殊的两殊的两类物物质分开分开，如蛋白，如蛋白质与与盐类，称作，称作类分离或分离或组分离分离。另一。另一类则是要将是要将分子量相差不很大的物分子量相差不很大的物质加加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做叫做分分级分离分离。后。后者者对实验条件和操作要求都比条件和操作要求都比较高。
11、高。类分离n目的是分开目的是分开样品中分子量品中分子量悬殊的殊的“较大分子大分子组”和和“较小分子小分子组”两两类物物质，并不要求分离分子量相近的，并不要求分离分子量相近的组分分n选择凝胶凝胶时，应使使样品中品中大分子大分子组的分子量大于其排阻限的分子量大于其排阻限，而，而小小分子分子组的分子量小于渗入限的分子量小于渗入限。也就是。也就是说大分子的分配系数大分子的分配系数Kd=0，小分子的小分子的Kd1。这样能取得最好的分离效果。能取得最好的分离效果。例题：从某蛋白质溶液（例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下列）中除去无机盐，应选择下列哪种凝胶最合适？哪种凝胶最合适？
12、B.Sephadex G-25（分（分级范范围，1000-5000 D）A.Sephadex G-15（分（分级范范围，1,500 D）C.Sephadex G-150（分（分级范范围，5,000-400,000 D）凝胶粒度的影响n凝胶粒度的大小凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来分离效果有直接的影响。一般来说，细粒粒凝胶柱凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析精制分离或分析等。等。粗粒粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱粗制分离，脱盐等。等。n在一般柱在一般柱层
13、析中，使用干析中，使用干颗粒直径在粒直径在70m左右左右较合适。合适。对于在水中于在水中保存的凝胶如保存的凝胶如琼脂粉凝胶脂粉凝胶颗粒直径粒直径应在在150m左右。凝胶左右。凝胶颗粒大小粒大小要均匀，要均匀，这样流速流速稳定，效果定，效果较好好同一流速下不同粒度的同一流速下不同粒度的Sephadex G-25Sephadex G-25柱的洗脱效果柱的洗脱效果2、凝胶的预处理n溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上或将干胶加入水里，边加边搅，然后放到沸水浴中加热接近100，保持数个小时。根据干凝胶的填充体积计算所需的干凝胶量n平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲
14、液相同（使凝胶溶胀状态稳定）3、装柱n n一般一般一般一般选选用用用用细长细长的的的的层层析柱作凝胶析柱作凝胶析柱作凝胶析柱作凝胶过滤过滤。进进行行行行类类分离（如脱分离（如脱分离（如脱分离（如脱盐盐）时时，柱高，柱高，柱高，柱高50cm50cm比比比比较较合适；分合适；分合适；分合适；分级级分离分离分离分离时时，100cm100cm较为较为合适合适合适合适n n具体步具体步具体步具体步骤为骤为：l l将将将将层层析柱析柱析柱析柱垂直固定垂直固定垂直固定垂直固定，一般是先在柱内装入，一般是先在柱内装入，一般是先在柱内装入，一般是先在柱内装入约约1/31/3高度的水或高度的水或高度的水或高度的水
15、或缓缓冲液冲液冲液冲液排走空排走空排走空排走空气气气气；l l将平衡好的凝胶将平衡好的凝胶将平衡好的凝胶将平衡好的凝胶搅搅匀，匀，匀，匀，连续倾连续倾入柱中，待其自然沉降至入柱中，待其自然沉降至入柱中，待其自然沉降至入柱中，待其自然沉降至1/4-1/31/4-1/3高高高高时时打开打开打开打开下端出口，下端出口，下端出口，下端出口，让让溶溶溶溶剂剂慢慢流出，慢慢流出，慢慢流出，慢慢流出，继续继续倒入凝胶至沉降到所需高度。倒入凝胶至沉降到所需高度。倒入凝胶至沉降到所需高度。倒入凝胶至沉降到所需高度。l l用用用用3-53-5倍柱床体倍柱床体倍柱床体倍柱床体积积的的的的起始起始起始起始缓缓冲液冲液
16、冲液冲液走柱，使凝胶介走柱，使凝胶介走柱，使凝胶介走柱，使凝胶介质质充分充分充分充分平衡平衡平衡平衡，柱床，柱床，柱床，柱床稳稳定定定定（若第一步采用起始（若第一步采用起始（若第一步采用起始（若第一步采用起始缓缓冲液排空气冲液排空气冲液排空气冲液排空气则该则该步步步步骤骤略）。略）。略）。略）。层析柱层析柱（a a）自自制制简简易易层层祈祈柱柱（1 1玻玻璃璃管；管；2.2.橡皮塞；橡皮塞；3 3尼龙网）；尼龙网）；（b b）普通商品柱；）普通商品柱；（c c）双双底底板板层层析析柱柱（1.1.洗洗脱脱液液进进出出口口；2.2.多多孔孔底底板板；3 3柱柱床床；4 4恒恒温温水水进进口口；5
17、5恒恒温温水水出出口口；6 6可调节的塞子）可调节的塞子）4、样品的准备p样品的品的粘度粘度：粘度大：粘度大产生介生介质吸附，吸附，一般要求一般要求样品粘度品粘度小于小于sp样品的品的浓度度：样品品浓度以度以不大于不大于4为宜，宜，样品品浓度度过大往往大往往导致粘致粘度增大。如果度增大。如果样品品浑浊，应先先过滤或离心除去或离心除去颗粒后上柱粒后上柱p样品的品的体体积：分析用量一般：分析用量一般应低于低于总柱体柱体积的的5%，制，制备用量一般用量一般为15%或更多（或更多（20-30%）。样品黏度对洗脱曲线的影响（1 1）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000，使终浓度为，使终浓度为5%5%，
18、相对粘度，相对粘度11.8;11.8;（2 2）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000，使终浓度为，使终浓度为2.5%2.5%，相对，相对粘度粘度4.2;4.2;（3 3）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000，使终浓度为，使终浓度为1%.1%.5、上样p打开层析柱下端出口，使缓冲液流出至刚好达到凝胶胶面p具体步骤为：p沿柱壁缓慢加入样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁p加样时应尽量减少凝胶床面的搅动。加样的方法可以是直接将样品加到层析床表面，或可用微量泵控制6、洗脱和收集n打开起始打开起始缓冲液冲液阀门，连续洗脱。洗脱。n用自用自动部分收集器自部分
19、收集器自动或手或手动收集，合并同一高峰各管收集，合并同一高峰各管。p洗脱洗脱时应注意的注意的问题：流速不宜流速不宜过快且要快且要稳定定洗脱液的成分也不洗脱液的成分也不应改改变（凝胶溶（凝胶溶胀程度）程度）整个洗脱整个洗脱过程中始程中始终保持一定的操作保持一定的操作压可以用水或可以用水或缓冲液作洗脱液冲液作洗脱液 流速对洗脱曲线的影响流速对洗脱曲线的影响 流速流速较低，分辨率低，分辨率较高高常常常常用用用用恒恒恒恒流流流流泵泵泵泵控控控控制制制制7、凝胶的再生及保存p再生p用过的凝胶经的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能，或参照凝胶产品说明书p凝胶的保存方法p0.02%叠氮钠或0.00
20、2%双氯苯双胍己烷应用：测定相对分子质量p标准曲线法标准曲线法 对于于特定的特定的测定系定系统，先以，先以3个以上（越多越好）的已知分子量的个以上（越多越好）的已知分子量的标准蛋白准蛋白（目前已有配套（目前已有配套标准蛋白系列准蛋白系列产品出售）品出售）过柱，柱，测取各自的取各自的Ve值。以。以Ve作作纵坐坐标，LogM作横坐作横坐标制做制做标准曲准曲线。在在同一同一测定系定系统中中测出未知物出未知物质的的Ve值便可由便可由标准曲准曲线求得分子量。分子求得分子量。分子量在量在10 000150 000之之间的球形蛋白用此法的球形蛋白用此法测出的分子量出的分子量误差在差在10左右左右Velog M标准曲线标准曲线凝胶过滤层析的特点p优点：p操作条件温和，样品回收率可接近100，并且重复性高。p作为脱盐手段，与透析法相比速度快、精度高；与超滤法相比，蛋白活性收率高；p分离机理简单，操作参数少，容易规模放大p缺点：p分辨率不高，对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离p料液处理量小，并且样品粘度不宜太高p分离操作较慢，由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，流速过快会降低分辨率