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1、关于凝胶层析法第一页，本课件共有133页n凝胶层析（凝胶层析（gelchromatography）也称：也称：分子筛层析分子筛层析 分子排阻层析分子排阻层析 凝胶过滤凝胶过滤 凝胶色谱等凝胶色谱等是指混合物随流动相经过凝胶层析柱时，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。第二页，本课件共有133页简介简介 凝凝胶胶色色谱谱是是以以各各种种多多孔孔性性凝凝胶胶填填料料为为固固定定相相，利利用用流流动动相相中中所所含含各各种种组组分分的的相相对对分分子子质质量量不不同同而而达达到到物物质质分离的一种技术。分离的一种技术。突突出出优优点点是是：凝凝胶胶不不带带电电荷荷、吸吸附
2、附力力弱弱、不不需需再再生生处处理理可可反反复复使使用用、操操作作条条件件温温和和、对对分分离离成成分分不不变变性性和破坏、对高分子物质有很好的分离效果。和破坏、对高分子物质有很好的分离效果。第三页，本课件共有133页4第一节第一节凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理n凝凝胶胶层层析析的的分分离离过过程程是是在在装装有有多孔物质填料的柱中进行的。多孔物质填料的柱中进行的。n柱柱的的总总体体积积为为V VA A，它它包包括括填填料料的的骨骨架架体体积积V VGMGM，填填料料的的孔孔体体积积V Vi i(内内水水体体积积)以以及及填填料料颗颗粒粒之之间间的体积的体积V V0 0（外水体积）。（外
3、水体积）。nV VA A=V Vi i+V V0 0+V VGMGM 第四页，本课件共有133页1 1、外水体积：、外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝胶颗粒间液体胶颗粒间液体流动相流动相的体积的体积。（用。（用VoVo表示）表示）2 2、内内水水体体积积：指指凝凝胶胶颗颗粒粒中中孔孔穴穴的的体体积积，即即凝凝胶胶层层析析中中固固定相定相体积体积。（用。（用ViVi表示）表示）3 3、骨架体积：、骨架体积：指凝胶颗粒实际骨架体积。指凝胶颗粒实际骨架体积。（用（用V VGMGM表示）表示）4 4、柱的总体积：、柱的总体积：指凝胶柱所能容纳的总体积
4、指凝胶柱所能容纳的总体积。（用。（用V VA A表示）表示）5 5、洗洗脱脱体体积积：指指将将样样品品中中某某一一组组分分洗洗脱脱下下来来所所需需洗洗脱脱液液的的体积。（用体积。（用Ve Ve 表示）表示）第五页，本课件共有133页则：则：Vt=Vo+Vi+Vg流动相体积流动相体积固定相体积固定相体积总体积总体积第六页，本课件共有133页7第七页，本课件共有133页8原理原理n当当具具有有一一定定分分子子量量分分布布的的高高聚聚物物溶溶液液从从柱柱中中通通过过时时，较较小小的的分分子子在在柱柱中中停停留留时时间间比比大大分分子子停停留留的的时时间间要要长长，于于是是样样品品各各组组分分即即按按
5、分分子子大大小小顺顺序序而而分分开开，最最先先淋淋出的是最大的分子。出的是最大的分子。Ve=V0+ViKd第八页，本课件共有133页1 1、比比孔孔穴穴孔孔径径大大的的分分子子不不能能扩扩散散到到孔孔穴穴内内部部，完完全全被被排排阻阻在在孔孔外外，只只能能在在凝凝胶胶颗颗粒粒外外的的空空间间随随流流动动相相向向下下流流动动，它它们们经经历历的的流流程程短短，流流动动速速度度快快，所所以以首先流出；首先流出；2 2、较较小小的的分分子子则则可可以以完完全全渗渗透透进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；3 3、分分子子大大
6、小小介介于于二二者者之之间间的的分分子子在在流流动动中中部部分分渗渗透透，渗渗透透的的程程度度取取决决于于它它们们分分子子的的大大小小，所所以以它它们们流出的时间介于二者之间。流出的时间介于二者之间。第九页，本课件共有133页也叫凝胶过滤层析也叫凝胶过滤层析第十页，本课件共有133页凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图小分子小分子大分子大分子凝胶基质凝胶基质凝胶凝胶珠珠第十一页，本课件共有133页 分分子子越越大大的的组组分分越越先先流流出出，分分子子越越小小的的组组分分越越后后流流出出。这这样样样样品品经经过过凝凝胶胶层层析析后后，各各个个组组分分便便按按分分子子从从大大到到小小的的
7、顺顺序序依依次次流流出出，从从而而达达到到了了分分离离的的目的。目的。第十二页，本课件共有133页13（一）平衡排除理论（一）平衡排除理论n当当溶溶质质层层流流过过一一个个填填料料颗颗料料这这段段距距离离时时，溶溶质质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。n平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。第十三页，本课件共有133页14（二）（二）扩散分离理论扩散分离理论 n溶溶质质分分子子在在流流经经色色谱谱柱柱的的过过程程中中，在在流流动动相相和和固固定定相相之之间间没没有有达达到到平平衡，存在着衡，存在着流速依赖性。流速依
8、赖性。聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线的流速依赖性1流速为0.65ml/min；2流速为2.0ml/min溶剂为甲苯 第十四页，本课件共有133页15（三）（三）流动分离理论流动分离理论n红细胞在毛血细管中流动时比血浆红细胞在毛血细管中流动时比血浆流得快。流得快。n较大的分子较先通过或绕过这个较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。行分离。第十五页，本课件共有133页16分离过程分离过程n三三种种不不同同分分子子量量物物质质的的混混合合样样品品用用某某种种规规格的凝胶柱进行分离。格的凝胶柱进行分离。n样样品品加加入入，以以水水或或其其他他溶溶液液
9、进进行行洗洗脱脱，即即得得洗洗脱曲线脱曲线。第十六页，本课件共有133页17分离过程分离过程n最最先先流流出出物物质质A，A分分子子量量最最大大，完完全全不不能能进进入入颗颗粒粒内内部部，只只能能从从颗颗粒粒间间隙隙流流过过，“全全排排阻阻”。其其流经体积最小，等于外水体积流经体积最小，等于外水体积V0。n最最后后流流出出物物质质C，它它分分子子量量最最小小，其其分分子子可可以以自自由由进进出出凝凝胶胶颗颗粒粒，“全全渗渗入入”。流流经经体体积积是是外外水水体积与内水体积之和体积与内水体积之和V0+Vi。n物物质质B分分子子量量介介于于渗渗入入限限与与排排阻阻限限之之间间，其其分分子子能能够够
10、部部分分地地进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒中中。“部部分分排排阻阻”或或“部部分分渗渗入入”。流流径径体体积积Ve是是全全部部外外水水体体积积加加上上内内水水体体积积的的一部分，即一部分，即Ve=V0+KdVi第十七页，本课件共有133页18分配系数分配系数Kdn排阻系数：排阻系数：n当当Kd=1时，洗脱体积时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。，为全渗入。n当当Kd=0时，洗脱体积时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。，为全排阻。n0Kd1时，洗脱体积时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。，为部分渗入。第十八页，本课件共有133页19物质的物质的Kd值值第十九页，本课件共有133页20凝胶层
11、析的特点凝胶层析的特点（1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。）凝胶层析操作简便，所需设备简单。（2）分离效果较好，重复性高。）分离效果较好，重复性高。（3）分离条件缓和。）分离条件缓和。（4）应用广泛。）应用广泛。（5）分辨率不高，分离操作较慢。）分辨率不高，分离操作较慢。第二十页，本课件共有133页21第二节第二节凝胶的结构和性质凝胶的结构和性质一、一、葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶(Sephadex)二、修饰葡聚糖凝胶二、修饰葡聚糖凝胶(ModifiedSephadex)三、三、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）四、四、琼脂糖类凝胶琼脂糖类凝胶（Sepharose）五、多孔玻璃微球五、
12、多孔玻璃微球(Bio-glas)六、疏水性凝胶六、疏水性凝胶（hydrophobicgels）第二十一页，本课件共有133页22一、葡聚糖凝胶一、葡聚糖凝胶(Sephadex)n商品名为商品名为SephadexG类。类。n交交联联葡葡聚聚糖糖的的基基本本骨骨架架是是葡葡聚聚糖。糖。n再再经经3-氯氯-1，2-环环氧氧丙丙烷烷为为交交联联剂剂，形形成成三三维维网网状状结结构构的的高分子化合物。高分子化合物。n其其交交联联度度是是通通过过交交联联剂剂的的加加量量及反应条件来控制的。及反应条件来控制的。第二十二页，本课件共有133页交联葡聚糖凝胶的化学结构交联葡聚糖凝胶的化学结构 第二十三页，本课件
13、共有133页 葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大网孔越大，吸水膨胀就越大 。G G类类葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶常常用用G-XG-X代代表表，X X数数字字既既代代表表交交联联度度，也也代代表表特特水水量量。X X数数字字越越小小，交交联联度度越越大大，网网孔孔越越小小，适适用用于于分分离离低低分分子子质质量量生生化化产产品品。X X数数字字越越大大，交交联联度度越越小小，网网孔孔
14、越越大大，适适用用于于分分离离高高分分子子生生化化产产品品。X X数数字字也也代代表表凝凝胶胶的的持持水水量量，如如G-25G-25表表示示1g1g干干胶胶持持水水2.5mL2.5mL，G-100G-100表表示示 1g1g干干胶胶持持水水10mL10mL，依依次次类推。类推。第二十四页，本课件共有133页25SephadexG编号意义：编号意义：1、吸液量；、吸液量；2、溶涨时间；、溶涨时间；3、凝胶孔径凝胶孔径；4、分离范围分离范围蛋白质、多糖蛋白质、多糖第二十五页，本课件共有133页26葡聚糖凝胶性能与编号的关系葡聚糖凝胶性能与编号的关系编号交联度吸液量膨胀速度凝胶孔径分离限凝胶强度大（
15、SephadexG150）小大慢大大小小（SephadexG50）大小快小小大第二十六页，本课件共有133页27葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（G类）的规格类）的规格第二十七页，本课件共有133页28葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（G类）特点类）特点1、孔径孔径。2、稳定性。、稳定性。3、吸附作用吸附作用。4、芳香族化合物和杂环化合物。、芳香族化合物和杂环化合物。第二十八页，本课件共有133页 1 1、SephadexSephadex在在水水、盐盐、碱碱、弱弱酸酸以以及及有有机机溶溶液中都比较稳定，可以多次重复使用。液中都比较稳定，可以多次重复使用。2 2、稳稳定定工工作作pHpH为为2 21010，强强酸酸
16、溶溶液液和和氧氧化化剂剂会会使交联的糖苷键水解断裂。使交联的糖苷键水解断裂。3 3、在在高高温温下下稳稳定定，可可煮煮沸沸消消毒毒，在在100 100 CC下下40 40 minmin对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。性质与特点性质与特点第二十九页，本课件共有133页 4 4、含含有有羟羟基基，呈呈弱弱酸酸性性，有有可可能能与与分分离离物物中中的的一一些些带带电电基基团团（尤尤其其是是碱碱性性蛋蛋白白）发发生生吸吸附附作作用用。但但一一般般在在离离子子强强度度大大于于0.050.05的的条条件件下下，几几乎乎没没有有吸吸附作用。附作用。5 5、有有各各种种
17、颗颗粒粒大大小小（粗粗、中中、细细、超超细细）可可以以选选择择，一一般般粗粗颗颗粒粒流流速速快快，但但分分辨辨率率较较差差；细细颗颗粒粒流速慢，但分辨率高。流速慢，但分辨率高。6 6、机械稳定性相对较差，不耐压，分辨率高的、机械稳定性相对较差，不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。分离。第三十页，本课件共有133页31保存保存n保存的方法有保存的方法有干法、湿法和半缩法干法、湿法和半缩法三种。三种。n湿湿法法：加加入入一一定定量量的的防防腐腐剂剂置置于于冰冰箱箱中中作作短短期期保保存存（6个月以内）。个月以内）。n常常用
18、用0.02%叠叠氮氮化化钠钠、0.02%三三氯氯叔叔丁丁醇醇、20%乙醇等。乙醇等。n干干法法：用用浓浓度度逐逐渐渐升升高高的的乙乙醇醇分分步步处处理理洗洗净净的的凝凝胶胶，脱水收缩，抽滤，用脱水收缩，抽滤，用6080吹干。吹干。n半缩法：半缩法：第三十一页，本课件共有133页32二、修饰葡聚糖凝胶二、修饰葡聚糖凝胶(ModifiedSephadex)（一一）亲亲脂脂性性葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶（LipophilicSephadex）骨骨架架结结构构上上引引入入一一些些有有机机基基团团，如如甲甲基基、羟羟丙丙基基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。使呈亲脂性，同时保留亲水性。这这种种凝凝胶胶既既亲亲脂脂
19、又又亲亲水水，可可在在多多种种有有机机溶溶剂剂中中膨膨胀胀。这这种种凝凝胶胶在在pH2的的不不含含氧氧化化剂剂的的溶溶液液中中稳稳定定。用用低低级级醇醇为为溶溶剂剂时时，对对芳芳香香族族、杂杂环环族族化化合合物物仍仍有有吸吸附附作作用用。但但用用氯氯仿仿时时则则可可去去除除对对上上述述化化合合物物的的吸吸附附作作用用，而而对对含含羟羟基基与与羧基的化合物却有吸附作用羧基的化合物却有吸附作用。第三十二页，本课件共有133页 国国产产Sephadex Sephadex LHLH2020可可用用于于分分子子筛筛层层析析、吸吸附附层层析析和和分分配配层层析析。很很适适用用于于脂脂肪肪酸酸、甘甘油油脂脂
20、、类类固固醇醇、维维生生素素、激激素素类类生生化化产产品品的的分分离离。洗洗脱脱剂剂可可用用单单一一有有机机溶溶剂剂如如甲甲醇醇、氯氯仿仿等等，也也可可用用混混合合溶溶剂剂如如氯氯仿仿与与甲甲醇醇的的混混合液。合液。第三十三页，本课件共有133页（二）葡聚糖凝胶离子交换剂（二）葡聚糖凝胶离子交换剂 在在G G类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后，则制类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后，则制得各种葡聚糖凝胶离子交换剂得各种葡聚糖凝胶离子交换剂 。如如引引入入磺磺乙乙基基（SE-SephadexSE-Sephadex）、羧羧甲甲基基（CM-SephadexCM-Sephadex）及及二二乙乙胺胺基基乙乙
21、基基（DEAE-Sephadex DEAE-Sephadex A A）等等。葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶离离子子交交换换剂剂具具有有离离子子交交换换和和分分子子筛筛双双重重作作用用。其其结结构构多多孔孔、疏疏松松、非非特特异异性性吸吸附附很很少少，层层析析时时流流速速易易控控制制，特特别别适适用用于于蛋蛋白白质质、酶酶、激激素素、多核苷酸等的分离纯化，以及生化制剂的除热原。多核苷酸等的分离纯化，以及生化制剂的除热原。第三十四页，本课件共有133页35交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂第三十五页，本课件共有133页36 （三）（三）Supperdex系凝胶系凝胶由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合
22、而成。由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。（四）（四）Sephacryl系凝胶系凝胶是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。的。理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。第三十六页，本课件共有133页37Supperdex系凝胶系凝胶第三十七页，本课件共有133页38Sephacryl系凝胶系凝胶第三十八页，本课件共有133页39三、聚丙烯酰胺凝胶三、聚丙烯酰胺凝胶n商品名为商品名为生物凝胶生物凝胶-P-P（Bio-Gel PBio-Gel P）。）。n该该凝凝胶胶由由丙丙烯烯酰酰胺胺组组成成；
23、以以亚亚甲甲基基双双丙丙烯烯酰酰胺胺为为交交联联剂剂，聚聚合合而而成成。只只要要控控制制单单体体用用量量和和交交联联剂剂的的比比例例，就就能能得得到到不不同同型号的凝胶。型号的凝胶。n特点特点：1、孔径；孔径；2、稳定性、强度；、稳定性、强度；3、无非特异吸附，保存方便；、无非特异吸附，保存方便；4、编号反映出它的分离界限编号反映出它的分离界限。第三十九页，本课件共有133页在在聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶的的合合成成过过程程中中，单单体体和和交交联联剂剂的的配配比比可可以以任任意意改改变变。以以（T T）代代表表100mL100mL凝凝胶胶溶溶液液中中含含有有的的单单体体和和交交联联剂剂总总
24、克克数数，称称为为凝凝胶胶浓浓度度。而而其其中中交交联联剂剂占占单单体体和和交交联联剂剂总总量量的的百百分分比比称称为为交交联联度度，以以（C C）表表示示，交交联联度度越越大大，网网孔孔越越小小，交交联联度度越越小小，则则网网孔孔越越大大。聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶全全是是由由碳碳一一碳碳骨骨架架构构成成，稳稳定定性性较较好好，适适合合于于做做凝凝胶胶层层析析的的载载体体。只只有有在在极极端端pHpH条条件件下下酰酰胺胺键键才才被被水水解解为为羧羧基基，使使凝凝胶胶带带有有一一定定的的离离子子交交换换基基团团，故故一一般般只只在在pH2pH21111的的范范围围内使用。内使用。第四十页，本
25、课件共有133页 像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。目前，美国Bio-Rad Laboratories生产并出售多种规格的Bio-Gel P。第四十一页，本课件共有133页42聚丙烯酰胺凝胶的性质聚丙烯酰胺凝胶的性质n生物凝胶的编号反映出它的分离界限。生物凝胶的编号反映出它的分离界限。n如
26、如Bio-GelP-100。第四十二页，本课件共有133页43四、琼脂糖类凝胶四、琼脂糖类凝胶（Sepharose）（一）琼脂糖凝胶（一）琼脂糖凝胶n结结构构是是由由-D-半半乳乳糖糖与与3，6-脱脱水水-L-半半乳乳糖糖以以-1，3-和和-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。糖苷键相间连接而成的链状分子。第四十三页，本课件共有133页SepharoseSepharose琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶（agarose agarose gelgel）可可以以分分离离葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶和和生生物物胶胶所所不不能能分分离离的的大大分分子子，使使凝凝胶胶层层析析的的分分离离区区间间扩扩大大到到大大分分子子和
27、和病病毒毒颗颗粒粒，其其最最大大范范围围可可达达相相对对分分子子质质量量10108 8，但但是是由由于于琼琼脂脂有有强强烈烈的的吸吸附附作作用用，给给使使用用造造成成了了困困难难，后后来来，从从琼琼脂脂中中分分离离出出两两个个组组分分，一一个个组组分分为为带带负负电电荷荷的的琼琼脂脂果果胶胶，含含有有磺磺酸酸基基和和羧羧基基；另另一一组组分分叫叫琼琼脂脂糖糖，它它不不含含有有带带电电基基团团，其其结结构构是是有有-D-吡吡喃喃半半乳乳糖糖和和3，6脱脱水水-L-吡吡喃喃半半乳乳糖糖相相结结合合的的链链状状多糖。多糖。第四十四页，本课件共有133页这这种种琼琼脂脂糖糖被被用用来来进进行行凝凝胶胶
28、层层析析，它它既既具具有有琼琼脂脂凝凝胶胶相相同同的的分分离离区区间间，又又没没有有吸吸附附作作用用。但但其其稳稳定定性性远远不不如如葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶和和生生物物胶胶P P，强强酸酸强强碱碱能能引引起起结结构构破破坏坏。最最好好使使用用条条件件控控制制在在pH pH 4 49 9之之间间，温温度度0 04040，超超出此范围出此范围,可能被破坏。可能被破坏。第四十五页，本课件共有133页46琼脂糖凝胶特点：琼脂糖凝胶特点：1、没有共价键的交联。、没有共价键的交联。2、孔径依赖于琼脂糖的浓度。孔径依赖于琼脂糖的浓度。3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。4、非特异性吸
29、附力低。、非特异性吸附力低。5、分离范围大分离范围大。6、颗粒强度差颗粒强度差。第四十六页，本课件共有133页 琼脂糖的商品名称有琼脂糖的商品名称有:Sepharose(Sepharose(瑞典瑞典)Bio-gel A(Bio-gel A(美国美国)Segavac(Segavac(英国英国)Gelarose(Gelarose(丹麦丹麦)等多种，因生产厂家不同名称各异。等多种，因生产厂家不同名称各异。第四十七页，本课件共有133页 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶。它的商品名因生产厂家不同而异。瑞 典 的 商 品 名 称 为 Sepharose，有 3种 型 号，即Sepharose 2B
30、，4B和6B（同中国相同）。阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。美国的为BioGA，有6个型号，即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。第四十八页，本课件共有133页 英国的称为Sagavac，又分为Sagavac 2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状。丹麦的称为Gelarose，有5种类型，即2，4，6%，8和10。第四十九页，本课件共有133页 琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大都以含水状态供应，并应
31、在湿态保存。一般悬浮在l0-3 mo1/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。百分数表示干胶量。第五十页，本课件共有133页51琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖凝胶有琼脂糖凝胶有3个规格：个规格：Sepharose2B、4B、6B分别表示琼脂糖分别表示琼脂糖浓度为浓度为2%，4%，6%。第五十一页，本课件共有133页52几种蛋白质Kav值第五十二页，本课件共有133页53（二）架桥琼脂糖凝胶（二）架桥琼脂糖凝胶（SepharoseCL）n架架桥桥琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶为为琼琼脂脂线线性性分分子子经经1，3-二二溴溴丙丙醇醇交交联联的的凝凝胶。胶。n它它的的凝凝胶胶孔孔径径均均匀匀，机
32、机械械强强度度明显加大。明显加大。n对对热热和和化化学学物物质质的的稳稳定定性性大大大增加大增加,在在pH314范围内稳定范围内稳定。第五十三页，本课件共有133页54SepharoseCL的性质第五十四页，本课件共有133页55（三）超胶（三）超胶（Utro-gelACA）n所谓超胶是所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。的混合凝胶。n商商品品名名称称后后面面的的编编号号为为两两位位数数，各各表表示示混混合合胶胶中中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。第五十五页，本课件共有133页56（四）（四）Superose系凝胶系凝胶n是是由由珠珠状状琼琼脂
33、脂糖糖经经两两次次交交联联制制得得的的可可用用于于HPLC的的高速高速凝胶过滤介质。凝胶过滤介质。n有有6%和和12%两个规格。两个规格。第五十六页，本课件共有133页57五、多孔玻璃微球五、多孔玻璃微球(Bio-glas)特点：特点：1、化学稳定性高、化学稳定性高、强度大。强度大。2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。3、编编号号表表示示其其孔孔径径,越越大大，分分离离分分子子量量也也越越大。大。第五十七页，本课件共有133页58六、疏水性凝胶（六、疏水性凝胶（hydrophobicgels）常见的有：聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。常见的有：聚甲基丙烯酸酯凝
34、胶和聚苯乙烯凝胶。Styragel商品商品,分离范围为分离范围为160040000000。生物珠生物珠（Bio-BeadS），适于分离分子量较小的物质。），适于分离分子量较小的物质。分离不溶水的有机物质分离不溶水的有机物质。第五十八页，本课件共有133页59常用的商品化凝胶介质常用的商品化凝胶介质第五十九页，本课件共有133页60一第六十页，本课件共有133页第三节第三节凝胶层析的实验条件和操作凝胶层析的实验条件和操作61第六十一页，本课件共有133页62凝胶层析的实验条件和操作凝胶层析的实验条件和操作一、凝胶的选择和处理一、凝胶的选择和处理二、凝胶层析柱的设计和制备二、凝胶层析柱的设计和制备
35、三、凝胶层析操作三、凝胶层析操作四、主要参数测算四、主要参数测算第六十二页，本课件共有133页63一、凝胶的选择和处理一、凝胶的选择和处理（一）凝胶的选择（一）凝胶的选择选选择择适适宜宜的的凝凝胶胶是是取取得得良良好好分分离离效效果果的的最最根根本本的的保保证证。选选取取何何种种凝凝胶胶及及其其型型号号、粒粒度度，一一方方面面要要考考虑虑凝凝胶胶的的性性质质，包包括括凝凝胶胶的的分分离离范范围围（渗渗入入限限与与排排阻阻限限）还还有有它它的的理理化化稳稳定定性性、强强度度、非非特特异异吸吸附附性性质质等等；另另一一方方面面还要注意到分离目的和样品的性质。还要注意到分离目的和样品的性质。第六十三
36、页，本课件共有133页 凝凝胶胶粒粒度度的的大大小小对对分分离离效效果果有有直直接接的的影影响响。般般来来说说，细细粒粒凝凝胶胶柱柱流流速速低低，但但洗洗脱脱峰峰窄窄，分分辨辨率率高高，多多用用于于精精制制分分离离或或分分析析等等。粗粗粒粒凝凝胶胶柱柱流流速速高高，但但洗洗脱脱峰峰平平坦坦，分分辨辨率率低低，多多用用于于粗粗制制分分离离，脱脱盐盐等等。下下图图表表示示在在同同一一流流速速下下不不同同粒粒度度的的Sephadex G-25Sephadex G-25柱的洗脱效果。柱的洗脱效果。凝胶粒度与洗脱效果的关系图凝胶粒度与洗脱效果的关系图 第六十四页，本课件共有133页 对对生生物物样样品品
37、来来说说，经经常常遇遇到到的的是是两两种种分分离离形形式式。一一种种是是只只将将分分子子量量极极为为悬悬殊殊的的两两类类物物质质分分开开，如如蛋蛋白白质质与与盐盐类类，称称作作类类分分离离或或组组分分离离。另另一一类类则则是是要要将将分分子子量量相相差差不不很很大大的的大大分分子子物物质质加加以以分分离离，如如分分离离血血清清球球蛋蛋白白与与白白蛋蛋白白，这这叫叫做做分分级级分分离离。后后者者对对实实验验条条件件和和操操作作要要求求都都比比较较高高。下下面面以以最最常常用用的的葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶类类为为例例，分别加以讨论分别加以讨论 。第六十五页，本课件共有133页66将将分分子子量量极极为
38、为悬悬殊殊的的两两类类物物质质分分开开，如如蛋蛋白质与盐类，称作白质与盐类，称作类分离或组分离类分离或组分离。将将分分子子量量相相差差不不大大的的大大分分子子物物质质加加以以分分离离，如如分分离离血血清清球球蛋蛋白白与与白白蛋蛋白白，这这叫叫做做分分级级分离分离。第六十六页，本课件共有133页1 1类分离类分离 目目的的是是分分开开样样品品中中分分子子量量悬悬殊殊的的“较较大大分分子子组组”和和“较较小小分分子子组组”两两类类物物质质，并并不不要要求求分分离离分分子子量相近的组分。量相近的组分。选选择择凝凝胶胶时时，应应使使样样品品中中大大分分子子组组的的分分子子量量大大于于其其排排阻阻限限，
39、而而小小分分子子组组的的分分子子量量小小于于渗渗入入限限。也也就就是是说说大大分分子子的的分分配配系系数数Kd=Kd=0 0，小小分分子子的的KdKd1 1。这这样样能能取取得得最最好好的分离效果的分离效果。第六十七页，本课件共有133页例例如如从从蛋蛋白白质质溶溶液液中中除除去去无无机机盐盐。我我们们知知道道，蛋蛋白白质质的的分分子子量量都都大大于于5000D5000D，而而无无机机盐盐的的分分子子量量一一般般在在几几十十到到几几百百之之间间。所所以以常常选选用用Sephadex Sephadex G-25G-25凝凝胶胶作作为为分分离离固固定定相相，因因为为它它的的分分离离范范围围是是10
40、0010005000D5000D。被被分分离离的的两两组组物物质质的的分分子子量量正正好好落落在在分分离离范范围围的的两两侧侧。大大分分子子组组为为全全排排阻阻，而而小小分分子子组组为为全全渗渗入入，其其KdKd值值的的差差可可达达最最大大值值1 1。对对于于分分子子量量小小于于5000D5000D的的肽肽类类进进行行脱脱盐操作则常选用盐操作则常选用Sephadex G-15Sephadex G-15凝胶。凝胶。第六十八页，本课件共有133页691类分离类分离（1）使大分子的分配系数）使大分子的分配系数Kd=0；（2）小分子的）小分子的Kd=1。选选用用SephadexG-25凝凝胶胶，分分离
41、离范范围围10005000。第六十九页，本课件共有133页2分级分离 目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的13。第七十页，本课件共有133页因因为为分分子子量量如如与与渗渗入入限限比比较较靠靠近近，该该组组分分分分子子在在凝凝胶胶颗颗粒粒中中运运动动所所受受的的约
42、约束束很很小小，不不易易与与低低分分子子组组分分分分开开。如如分分子子量量与与排排阻阻限限比比较较靠靠近近则则不不易易与与高高分分子子组组分分分分开开。如如用用Sephadex Sephadex G-200G-200分分离离血血清清蛋蛋白白质质的的效效果果要要比比Sephadex Sephadex G-150G-150为为好好。但但也也有有人人选选用用G-150G-150，那那是是因因为为G-200G-200强强度度太太低不便操作的缘故（见下图）。低不便操作的缘故（见下图）。第七十一页，本课件共有133页不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图第七十二页，本课件共有133页732分级分离分
43、级分离（1 1）使各种物质的）使各种物质的Kd值尽可能相差大。值尽可能相差大。（2 2）不不使使分分子子量量分分布布在在凝凝胶胶分分离离范范围围的的一一侧。侧。（3 3）分分子子量量大大于于渗渗入入限限的的3倍倍，并并小小于于排排阻阻限限的的1/3。如如用用SephadexG-200分分离离血血清清蛋蛋白白质质的的效果要比效果要比SephadexG-150为好。为好。第七十三页，本课件共有133页74（二）凝胶粒度的选择（二）凝胶粒度的选择n细细粒粒凝凝胶胶柱柱流流速速低低，洗洗脱脱峰峰窄窄，分分辨辨率率高高，用用于于精精制制分分离离或或分分析。析。n粗粗粒粒凝凝胶胶柱柱流流速速高高，洗洗脱脱
44、峰峰平平坦坦，分分辨辨率率低低，用用于于粗制分离，脱盐。粗制分离，脱盐。第七十四页，本课件共有133页凝凝胶胶颗颗粒粒大大小小一一般般分分为为粗粗、中中、细细和和超超细细四四类类。颗颗粒粒越越细细，分分离离效效果果越越好好，因因为为它它容容易易达达到到平平衡衡，但但流流速速慢慢。颗颗粒粒越越粗粗，流流速速越越快快，会会使使区区带带扩扩散散，使使洗洗脱脱峰峰变变平平变变宽宽。在在一一般般柱柱层层析析中中，使使用用干干颗颗粒粒直直径径在在70m70m左左右右较较合合适适。对对于于在在水水中中保保存存的的凝凝胶胶如如琼琼脂脂粉粉凝凝胶胶颗颗粒粒直直径径应应在在150m150m左左右右。凝凝胶胶颗颗粒
45、粒大大小小要要均均匀匀，这这样样流流速稳定，效果较好。速稳定，效果较好。第七十五页，本课件共有133页76（三）凝胶的预处理（三）凝胶的预处理n使用前须使用前须溶涨溶涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到平，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到平衡。衡。n干胶以干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。倍以上吸液量的溶剂浸泡。n热法溶涨热法溶涨(水浴中加热溶胀水浴中加热溶胀)。第七十六页，本课件共有133页 葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶和和生生物物胶胶多多以以干干粉粉形形式式保保存存，使使用用前前需需用用水水或或洗洗脱脱缓缓冲冲液液充充分分溶溶账账。在在室室温温下下让让其其充充分溶账胀达到平衡，通常需要较长时间。分溶账
46、胀达到平衡，通常需要较长时间。较较快快的的做做法法是是将将干干胶胶往往水水里里加加，边边加加边边搅搅，以以防防凝凝胶胶结结块块，然然后后放放到到沸沸水水浴浴中中加加热热接接近近100100，几几个个小小时时就就可可以以使使其其溶溶胀胀，还还可可起起到到除除去去颗颗粒粒内内部部气气泡泡和杀菌作用。和杀菌作用。第七十七页，本课件共有133页78二、凝胶层析柱的设计和制备二、凝胶层析柱的设计和制备（一）层析柱的选择（一）层析柱的选择层析柱长度与直径的比值称作层析柱长度与直径的比值称作“柱比柱比”。对对于于类类分分离离，柱柱床床体体积积一一般般为为样样品品溶溶液液体体积积的的5倍倍，柱比柱比5:1到到
47、10:1即可。即可。对对于于分分级级分分离离，则则要要求求柱柱床床体体积积大大于于样样品品体体积积25倍倍以上，甚至多达以上，甚至多达100倍。倍。柱比在柱比在25至至100之间。之间。第七十八页，本课件共有133页79凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系第七十九页，本课件共有133页80（二）凝胶柱的装填（二）凝胶柱的装填n常常用用的的支支持持物物有有棉棉花花、玻玻璃璃纤纤维维、玻玻璃璃珠珠、垂垂熔熔玻璃等。玻璃等。n空柱中应留约空柱中应留约1/5的水或溶剂。的水或溶剂。n不不断断搅搅拌拌下下使使胶胶粒粒均均匀匀沉沉降降，使使不不发发生生凝凝胶胶分分层层和胶面倾斜。和
48、胶面倾斜。第八十页，本课件共有133页一般选用细长的柱作凝胶过滤。进行脱盐时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm就足够了。一般是在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使其自然沉降。如此连续操作，可以得到一个均匀的柱床。柱装得不好往往造成洗脱区带加宽，甚至使一些本来可以分开的区带重叠。如装柱时的操作压力太大，会使凝胶床压得太实，从而降低流速。第八十一页，本课件共有133页 层析柱层析柱（a）自制简易层祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3柱床；4恒温水进口；5恒
49、温水出口；6可调节的塞子）第八十二页，本课件共有133页 层析系统连接示意图 1密封橡皮塞；2恒压管；3.恒压瓶；4.层析流出液；5可调螺旋夹；6.自动收集器；7.核酸一蛋白质检测仪第八十三页，本课件共有133页 BSBS100100自动部分收集器安装圈自动部分收集器安装圈1反全阀；2.换管臂；3.滴管；4、5.换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螺丝；8.报警板；9.试管；10收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13.自动开关；14.指示灯；15.电源开关；16换向开关（逆、顺）；17手动开关第八十四页，本课件共有133页85（三）凝胶床的检查和维护（三）凝胶床的检查和维护
50、n观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。n有有色色物物质质溶溶液液过过柱柱，观观察察柱柱床床有有无无沟沟流流，色色带带是是否平整。否平整。n检查物质为检查物质为蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖。第八十五页，本课件共有133页新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用35倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。新装好的柱要检验其均匀性可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。也可以对光检查，看其是否均匀或有无气泡存在。第八十六页，本课件共有133页87操作压操作压层层析析柱柱由由于于进进出出口口之之间间液液位位压压力力差差形形成成的的对