《凝胶层析原理》PPT课件.ppt

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1、小 结 名称原理电极缓冲液支持介质电泳形式加样方式染色液分辨率醋酸纤维素电泳琼脂糖凝胶电泳PAGEIEFSDS-PAGE层层 析析CHROMATOGRAPHYCHROMATOGRAPHY一、概述一、概述 1 1、定义、定义 层析层析(又名色谱又名色谱)一一种种利利用用混混合合物物中中各各组组分分的的物物理理化化学学性性质质间间的的差差异异，使使各各组组分分在在层层析析两两相相中中以以不不同同程程度度分分配配，借借此此将将各各组组分分分分离。离。分子极性分子极性分子大小分子大小分子形状分子形状离子亲和力离子亲和力分子亲和力分子亲和力吸附能力吸附能力凝胶层析凝胶层析离子交换层析离子交换层析亲和层析

2、亲和层析2 2、物理化学性质间的差异、物理化学性质间的差异吸附层析吸附层析LL 层析层析分析法的基本原理：分析法的基本原理：流动相Mobilephase固定相Stationaryphase样本分子依其分子极性选择亲和两相之一吸附层析分配层析Liquid-SolidLiquid-Liquid两相系统ABC每次分离样本都要做一次选择One Plate ofSeparation(理论板数)S极性L非极性极性非极性样本样本19031903年年 俄国植物学家俄国植物学家 茨维特茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区物色素，以

3、石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带带;3 3、层析的发展、层析的发展19311931年，年，KuhnKuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素采用柱色谱分离了类胡萝卜素19411941年，年，MartinMartin和和SyngeSynge提出分配色谱法提出分配色谱法 19441944年，年，MartinMartin等又提出纸色谱法等又提出纸色谱法 19521952年，年，MartinMartin和和JamesJames发明了气液色谱法发明了气液色谱法19551955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代 色谱分析的建立色谱分析的建立19561956年，年，Stahl

4、Stahl系统研究了薄层色谱法系统研究了薄层色谱法(TLC)(TLC)19581958年，年，SteinStein和和MooreMoore研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构酸的分子结构19671967年，年，HorvvathHorvvath和和HuberHuber等研制了高效液相色谱等研制了高效液相色谱(high-high-performance liquid chromatography,HPLCperformance liquid chromatography,HPLC)仪仪19751975年，年，SmallSmall等提出离子色谱等提出离子色谱

5、2020世纪世纪8080年代，超临界色谱年代，超临界色谱2020世纪世纪9090年代，毛细管电泳（年代，毛细管电泳（18091809年年ReRessss第一次电泳实验）第一次电泳实验）2121世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更大的发展大的发展 层层析析法法进进行行时时有有两两个个相相，一一个个相相称为称为固定相固定相，另一相称为，另一相称为流动相流动相。支持物支持物含待分离物质含待分离物质气气相相层层析析液液相相层层析析气气-固固 气气-液液 液液-固固 液液-液液二二.层析技术的分类层析技术的分类1.1.按两相所处的状态分类按

6、两相所处的状态分类以气体作为流动相以气体作为流动相以液体作为流动相以液体作为流动相2.2.按层析的机制可分为按层析的机制可分为n n吸附层析吸附层析吸附层析吸附层析adsorption chromatography n n分配层析分配层析分配层析分配层析partition chromatography n n凝胶层析凝胶层析凝胶层析凝胶层析gel chromatographyn n亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析affinity chromatographyn n离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析 ion-exchange chromatography n定义定义 指指混混合合物

7、物随随流流动动相相通通过过吸吸附附剂剂时时，由由于于吸吸附附剂剂对对不不同同物物质质的的吸吸附附力力而而使使混合物分离的方法混合物分离的方法n n原理原理原理原理 在不同条件下，吸附剂与在不同条件下，吸附剂与在不同条件下，吸附剂与在不同条件下，吸附剂与被吸附物之间的作用被吸附物之间的作用被吸附物之间的作用被吸附物之间的作用物理作用的范德华吸附：物理作用的范德华吸附：物理作用的范德华吸附：物理作用的范德华吸附：无无无无选选选选择择择择性性性性，吸吸吸吸附附附附速速速速度度度度快快快快，吸附的过程是可逆的吸附的过程是可逆的吸附的过程是可逆的吸附的过程是可逆的化化化化学学学学吸吸吸吸附附附附：由由由

8、由原原原原子子子子价价价价力力力力的的的的作作作作用用用用引引引引起起起起。有有有有选选选选择择择择性性性性，吸吸吸吸附附附附速度较慢，不易解吸速度较慢，不易解吸速度较慢，不易解吸速度较慢，不易解吸（1 1）吸附层析）吸附层析 在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸吸附层析吸附层析n常用的吸附剂 硅胶碱性碱性碱性碱性:碳氢化合物碳氢化合物碳氢化

9、合物碳氢化合物 中中中中性性性性:醛醛醛醛,酮酮酮酮,醌醌醌醌,酯酯酯酯,内酯酸内酯酸内酯酸内酯酸性性性性:酸性色素酸性色素酸性色素酸性色素,醛醛醛醛,酸酸酸酸聚酰胺氧化铝 活性炭磷酸钙粉末粉末粉末粉末:吸附力大吸附力大吸附力大吸附力大,流速慢流速慢流速慢流速慢 颗粒颗粒颗粒颗粒:吸附力中吸附力中吸附力中吸附力中,流速易控流速易控流速易控流速易控 锦纶锦纶锦纶锦纶-活性炭活性炭活性炭活性炭:吸附力弱吸附力弱吸附力弱吸附力弱锦纶锦纶锦纶锦纶66666666或锦纶或锦纶或锦纶或锦纶6 6 6 6 酰酰酰酰胺基团胺基团胺基团胺基团 对酚对酚对酚对酚,DNP-,DNP-,DNP-,DNP-氨基酸氨基酸

10、氨基酸氨基酸,醌醌醌醌,羧酸羧酸羧酸羧酸 氢氢氢氢键：羟基与羰基键：羟基与羰基键：羟基与羰基键：羟基与羰基唯一用于生物活性物质唯一用于生物活性物质唯一用于生物活性物质唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石羟基磷灰石羟基磷灰石羟基磷灰石（2 2）分配层析分配层析利利用用不不同同组组分分在在流流动动相相和和固固定定相相中中的的分分配系数不同配系数不同而进行分离的方法。而进行分离的方法。n柱层析柱层析colum chromatographycolum chromatography 进样量大且容易回收进样量大且容易回收n薄层层析薄层层析thin layper chromatographythin laype

11、r chromatography 小量样品，快速，小量样品，快速，操作简便操作简便3.3.按制备量分类按制备量分类 层层析法的析法的演变过程演变过程：圆形滤纸圆形滤纸长条滤纸长条滤纸薄层层析薄层层析(TLC)TLC)柱柱层层析析容量容量变变大大容量更大容量更大加展开液加展开液纸层析纸层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析三三.层析的一般原理层析的一般原理 1.1.分配系数分配系数Partition coefficientPartition coefficient 表示一种物质在两种特定相（流动相和固定相）表示一种物质在两种特定相（流动相和固定相）中分配程度中分配程度 溶质在固定相中的浓度溶质在固定相

12、中的浓度 CsCsK=K=溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度 CmCm特定的温度：常数特定的温度：常数K K大：被固定相吸附的牢固，随流动相大：被固定相吸附的牢固，随流动相 的移动速度较慢。的移动速度较慢。纯化生物物质的纯度纯化生物物质的纯度 取决于混合物中各组分取决于混合物中各组分K K 值的差异程度值的差异程度 混混合合物物中中各各组组分分若若 K K值值相相差差较较大大,则则能能较较易易地地把把混混合合物物中中的的生生物物物物质质分分离离。反反之之,K,K值值相相差差较较小小,不不易易把把混混合合物物中中的的生生物物物物质质分离分离 1 2 3 4 5K=1K=0.13232161

13、616168 816168 84 4121212124 42 28 812128 82 2909010101001001 1181881810.10.12.72.724.324.372.972.90.010.010.360.364.864.8629.1629.1665.6165.61凝胶层析凝胶层析Gel ChromatographyGel Chromatography凝胶过滤凝胶过滤 （gel filtrationgel filtration）(Porath,Flodin,1959)分子筛层析（分子筛层析（molecular sieve chromatographymolecular sie

14、ve chromatography）(Hjertn,Mosbach,1962)排阻层析排阻层析 （exclusion chromatographyexclusion chromatography）(Pedersen,1962)指混合物随流动相经固定相的层析柱时，指混合物随流动相经固定相的层析柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。的技术。一、基本原理一、基本原理 固定相（凝胶）固定相（凝胶）n三维空间网状结构三维空间网状结构A good gel for gel filtration contains about95%water 凝胶层凝胶层析法

15、：析法：样品样品固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较快流出 分子筛效应分子筛效应：分子大小不同分子大小不同,在凝胶受到的在凝胶受到的阻滞作用有差阻滞作用有差异异,从而造成各从而造成各组分在凝胶柱组分在凝胶柱中的迁移速度中的迁移速度不同得到分离不同得到分离。凝胶层析过程的数理关系凝胶层析过程的数理关系 1 1、柱床体积、柱床体积(V(VT T)V VT T=1/4 =1/4 D D2 2h h 2 2、洗脱体积（洗脱体积（VeVe）n即即欲欲分分离离物物质质通通过过层层析析柱柱洗洗脱脱下下来来所所需需洗洗脱脱液液的的总体积。总体积。3 3、外水体积（外水体积（V V0 0）即存在于柱床内凝胶外

16、面空隙即存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中流动相的之间的水相体积，相应于一般层析法中流动相的体积。体积。4 4、内内水水体体积积（ViVi）即即凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部所所含含水水相相的的体体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量求得。积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量求得。5 5、凝胶干体积（、凝胶干体积（VgVg）柱床体积柱床体积VT凝胶干体积凝胶干体积Vg内水体积内水体积Vi存在于柱床内凝胶存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水外面空隙之间的水相体积，相应于一相体积，相应于一般层析法中流动相般层析法中流动相的体积。的体积。颗粒内部所含水相颗粒内部所含水相的体积它可从的体积它

17、可从干凝干凝胶颗粒重量胶颗粒重量和吸水和吸水重量相减求得。重量相减求得。凝胶体积以及颗粒内凝胶体积以及颗粒内外间隙体积的总和。外间隙体积的总和。V VT T=1/4 =1/4 D D2 2h h 外水体积外水体积V0V VT T =Vg+V=Vg+V0 0+Vi+Vi数理关系数理关系Ve Ve VoVo Kd=Kd=Vi Vi6、分配系数（、分配系数（Kd）：）：特点：特点：（1 1）与被分离物质分子的）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关有关 （2 2）与柱的长短粗细无关）与柱的长短粗细无关 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一每个溶质分子在流动相和固定相之

18、间有一每个溶质分子在流动相和固定相之间有一每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数（个特定的分配系数（个特定的分配系数（个特定的分配系数（KdKdKdKd）Ve=Vo+KdViVe=Vo+KdViVe=Vo+KdViVe=Vo+KdVi(2)Ve=Vo+Vi(2)Ve=Vo+Vi Kd=1 Kd=1n分子完全不被排阻分子完全不被排阻n完全向凝胶颗粒内完全向凝胶颗粒内部扩散部扩散n在两相分配的比值在两相分配的比值为为1,1,最后流出最后流出.(1)Ve=Vo(1)Ve=Vo Kd=0 Kd=0n分分子子完完全全被被排排阻阻于凝胶颗粒之外于凝胶颗粒之外n全全部部分分布布于于流流动动相里

19、相里,n最先流出。最先流出。(3)0 Kd 1 (3)0 Kd 1 Ve=Vo+ViKdVe=Vo+ViKd为溶质以某种程度为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散向凝胶颗粒内扩散 Kd=0Kd=0Kd=0Kd=0 0 0 0 0Kd1Kd1Kd1Kd1 Kd=1Kd=1Kd=1Kd=1洗脱体积洗脱体积洗脱体积洗脱体积三三.凝胶层析的优点凝胶层析的优点 1.1.凝凝胶胶是是一一种种不不带带电电荷荷的的惰惰性性载载体体，结结构稳定构稳定 2.2.操作条件较温和操作条件较温和。3.3.样样品品得得率率高高,重重复复性性好好,可可进进行行大大量量样样品的分离纯化品的分离纯化 四、凝胶层析的缺点四、凝胶层析的

20、缺点1.1.要要求求样样品品和和洗洗脱脱液液的的粘度很低粘度很低 2.2.凝凝胶胶颗颗粒粒网网络络孔孔径径大大小小非非常常有有限限,所所以以可可被被纯纯化化的的物物质质的的分分子子量范围受到限制量范围受到限制 3.3.凝凝胶胶结结构构对对某某些些溶溶质质分子具有吸附作用分子具有吸附作用 五、凝胶的结构与性能五、凝胶的结构与性能 1.1.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶19591959年年PorathPorath和和FlodinFlodin合成合成（商品名为（商品名为SephadexSephadex）（1 1）结构：）结构：基基 本本 骨骨 架架：葡葡 聚聚 糖糖（dextrandextran）交交联联剂剂

21、：3-3-氯氯代代-1-1,2-,2-环环氧氧氯氯丙丙烷烷使使葡葡聚聚糖糖之之间间通通过过醚醚键键交交联联聚聚合合而而成成的的三三维维空空间间网网状结构状结构 （2 2）特点：）特点：交联度：交联度：n交联剂越多交联剂越多 交联度越大交联度越大 网孔结构越紧密网孔结构越紧密n交联剂越少交联剂越少 交联度越小交联度越小 网孔结构越疏松网孔结构越疏松化学性质：化学性质：稳稳定定,不不溶溶于于水水、盐盐、弱弱酸酸、碱碱和和一一般般有有机机溶溶剂剂,耐耐热热耐耐碱碱不不耐强酸耐强酸（2 2）特点：）特点：SephadexSephadex的分级范围的分级范围 G10 700G10 700G15 1,50

22、0G15 1,500G25 1,000-5,000G25 1,000-5,000G-50 1,500-30,000G-50 1,500-30,000G-75 3,000-70,000G-75 3,000-70,000G100 4,000-150,000G100 4,000-150,000G150 5,000-400,000G150 5,000-400,000G200 5,000-800,000G200 5,000-800,000吸水性吸水性nG类的型号类的型号表示每克干凝胶吸表示每克干凝胶吸水量（水量（ml）x10如如G-50每克干凝胶吸每克干凝胶吸水量为水量为5mln大孔凝胶大孔凝胶n工作范

23、围的下限几乎是工作范围的下限几乎是 SephadexSephadex的上限的上限n可分离可分离MW40MW40万以上万以上的物质的物质n可用来分离核酸及病毒。可用来分离核酸及病毒。2.2.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶（商品名为（商品名为Sepharose)Sepharose)3.3.聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶各种层析胶体：PharmaciaSephadexSepharoseSephacrylSephacelglucoseagaroseglucose+acrylamidecelluloseBio-RadBioGel PBioGel Aacrylamideagarose六六.其它条件选择其它条件选择 1

24、.1.1.1.柱的选择柱的选择柱的选择柱的选择 柱柱柱柱短短短短而而而而粗粗粗粗,则则则则易易易易使使使使样样样样品品品品稀稀稀稀释释释释,柱柱柱柱长长长长而而而而窄窄窄窄,则则则则柱柱柱柱的的的的管管管管壁壁壁壁效效效效应应应应较较较较大大大大,会会会会造造造造成拖尾现象成拖尾现象成拖尾现象成拖尾现象 2.2.2.2.样品的选择：样品的选择：样品的选择：样品的选择：量适当量适当量适当量适当,粘度小粘度小粘度小粘度小 3.3.3.3.洗脱液的选择：洗脱液的选择：洗脱液的选择：洗脱液的选择：每每每每种种种种样样样样品品品品分分分分离离离离所所所所用用用用的的的的缓缓缓缓冲冲冲冲洗洗洗洗脱脱脱脱液

25、液液液应应应应根根根根据据据据使使使使样样样样品品品品稳定稳定稳定稳定的原则使用的原则使用的原则使用的原则使用 七、应用七、应用1.1.1.1.分离纯化分离纯化分离纯化分离纯化 2.2.2.2.脱盐脱盐脱盐脱盐 3.3.3.3.测分子量测分子量测分子量测分子量Elution volume(ml)AlbuminNaClnDesalting in a simple column 测分子量测分子量测分子量测分子量 Velog Mr对同一类型的化合物对同一类型的化合物对同一类型的化合物对同一类型的化合物,洗洗洗洗脱特性与组分的分子量脱特性与组分的分子量脱特性与组分的分子量脱特性与组分的分子量有关有关有

26、关有关,流过凝胶柱时流过凝胶柱时流过凝胶柱时流过凝胶柱时,按按按按分子量分子量分子量分子量(MW)(MW)(MW)(MW)大小顺序流大小顺序流大小顺序流大小顺序流出出出出,MW,MW,MW,MW大的走在前面大的走在前面大的走在前面大的走在前面,Ve,Ve,Ve,Ve与与与与MWMWMWMW的关系可用下式表的关系可用下式表的关系可用下式表的关系可用下式表示示示示:Ve=K1-K2lgMWVe=K1-K2lgMWVe=K1-K2lgMWVe=K1-K2lgMWK1,K2 K1,K2 K1,K2 K1,K2 为常数为常数为常数为常数,MW,MW,MW,MW为分为分为分为分子量子量子量子量实验：实验：

27、凝胶层析法分离蛋白质凝胶层析法分离蛋白质血红蛋白血红蛋白64,480二硝基苯二硝基苯-鱼精蛋白鱼精蛋白2,000-12,000SephadexG-50孔径孔径1,500-30,000一、原理：一、原理：Kd=0Kd=0Kd=1Kd=11 1、装柱、装柱 先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积 凝胶不能有气泡和分层现象凝胶不能有气泡和分层现象 装柱结束后要保持凝胶表面平整装柱结束后要保持凝胶表面平整 二、操作注意点：二、操作注意点：凝胶柱凝胶柱的的装填装填方法：方法：装填胶体暂停流洗X继续流洗已堆积沉淀中上清紧密堆积检查好管柱是否畅通12GelGel继续流洗2 2、加样、加样使液面和凝胶表面相切，关闭出口使液面和凝胶表面相切，关闭出口 加样时尽量不要破坏凝胶面加样时尽量不要破坏凝胶面 让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱 血红蛋白和二硝基苯血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的鱼精蛋白的洗脱体积？洗脱体积？三、结果要求：三、结果要求：