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1、第三节第三节 凝胶层析凝胶层析凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。离的技术。优点：操作简便分离效果好，重复性高，回收率高分离条件温和应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐分辨率低主要应用：生物大分子的纯化生物大分子的纯化分子量测定分子量测定脱盐及去除小分子杂质脱盐及去除小分子杂质去热源物质去热源物质 溶液的浓缩溶液的浓缩相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔
2、相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻被完全排阻被完全排阻被完全排阻在孔外，在孔外，在孔外，在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。移动速度快；所以首先流出。移动速度快；所以首先流出。移动速度快；所以首先流出。相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗
3、相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。移动速率慢；所以最后流出。移动速率慢；所以最后流出。移动速率慢；所以最后流出。中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大
4、小，所以它们流出的时间介于二者之度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺
5、序依次流出，从而达到了分离的目的。次流出，从而达到了分离的目的。次流出，从而达到了分离的目的。次流出，从而达到了分离的目的。分子筛凝胶色谱原理出柱顺序：按分子由大到小顺序先后流出并得到分离。常用的溶剂：碱性水溶液（4OH）含盐水溶液（NaCl等）醇及含水醇，如甲醇、甲醇水其他溶剂：如含水丙酮，甲醇-氯仿凝胶层析分离原理示意图凝胶层析分离原理示意图凝胶层析分离原理示意图凝胶层析分离原理示意图 凝胶色谱填料葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶Sephadex G-Sephadex G-系列系列聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 Sephacryl Sephacryl系列系列琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶SepharoseSeph
6、arose系列系列SuperoseSuperose系列系列葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3氯1，2环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度受到的阻滞
7、作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。从柱中流出，由此就可以达到分离目的。影响凝胶层析效果的主要因素：