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1、发酵工艺 项目四：灭菌电子课件项目四项目四 灭菌灭菌2006年8月15日,国家食品药品监督管理局，通报了对安徽某公司生产的克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液（欣弗）引发的药品不良事件调查结果：经查，该公司2006年6月至7月生产的克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液未按批准的工艺参数灭菌，降低灭菌温度，缩短灭菌时间，增加灭菌柜装载量，影响了灭菌效果。经中国药品生物制品检定所对相关样品进行检验，结果表明，无菌检查和热源检查不符合规定。由此可见，当前无论是食品、药品或生物产品，在生产过程都要重视灭菌和消毒工作，确保安全。导言概述灭菌：用物理或化学方法杀死或除去（物体表面灭菌：用物理或化学方法杀死或除去（物体表面或内
2、部）环境中所有微生物（或生物体），包括或内部）环境中所有微生物（或生物体），包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。营养细胞、细菌芽孢和孢子。消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的部分病源微生物，使之不再发生危害。一内外的部分病源微生物，使之不再发生危害。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。巴氏消毒法消毒牛奶加热巴氏消毒法消毒牛奶加热60维持维持30min。在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。灭菌是在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。灭菌是为了保证进行纯培养（纯种）发酵。为了保证进行纯培养（纯种）发酵。杂菌可引
3、起的后果生产菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力。杂菌的生长速度有时比生产菌生长得快，结果使反应器中以杂菌为主。杂菌会污染最终产品。杂菌所产生的物质，使提取产物时发生困难。杂菌降解所需要的产物。发酵如污染了噬菌体，可使生产菌株发生溶菌现象。物理灭菌p热力灭菌（如干热灭菌、湿热灭菌、流通蒸汽灭菌）、辐射灭菌、过滤除菌等。化学灭菌p采用化学试剂进行灭菌：液体灭菌（如75%乙醇）和气体灭菌（如臭氧、环氧乙烷等）。一、灭菌方法热力灭菌 干热灭菌、湿热灭菌射线灭菌 紫外线、阴极射线、X射线、射线超声波消毒和微波消毒等 物理灭菌干热灭菌干热灭菌：是指相对湿度在20以下的高热，有火焰灼烧灭菌和热空
4、气灭菌。湿热灭菌：湿热灭菌：又成为高压蒸汽灭菌。在实验室或工业生产中，对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热到一定的温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌。热力灭菌p火焰灼烧灭菌。利用火焰直接将微生物烧死。火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。p热空气灭菌。利用高温干燥空气（160-170 ）加热灭菌12h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。干热法干热法干热灭菌温度和时间的关系干热灭菌温度和时间的关系灭菌温度/170160150140121灭菌时间/min60120150180
5、过夜湿热灭菌通常采用饱和水蒸汽、沸水进行灭菌。效果比同温度下干热好。湿热法湿热法煮沸灭菌：将待灭菌物品置于沸水中加热灭菌的方法。煮沸法可用于饮水和一般器械（刀剪、注射器等）的消毒。巴斯消毒：有些物品不能加热到蒸煮温度(100左右)，可采用较低的温度，如加热62、30min，以杀死不耐高温的微生物营养细胞(对芽孢无效)。这种方法是法国微生物学家巴斯德首创的，故名“巴氏消毒法”。湿热法湿热法高压蒸汽灭菌：利用具有适当压力和温度的饱和水蒸汽对物料或设备进行灭菌。灭菌原理：蒸汽冷凝时释放出大量潜热并具有强大穿透力，在高温和有水存在时，微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键（特别是氢键）极易受到
6、破坏，引起不可逆变性，致使微生物在短时间内因代谢障碍而死亡。湿热法湿热法灭菌时间和温度规律 高压灭菌器 某灭菌锅饱和蒸汽压力（表压）与温度的关系某灭菌锅饱和蒸汽压力（表压）与温度的关系蒸汽压力/MPa0.050.080.100.110.130.150.20温度/111.4 116.9 120.2 121.7 124.7 127.4 133.6高压蒸汽灭菌的关键是为热的传导提供良好条件，其中最重要的是使冷空气从灭菌器中顺利排除。因为冷空气导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌物品，并且还可降低蒸汽分压使之不能达到应有的温度。空气排除程度与罐内温度的关系空气排除程度与罐内温度的关系蒸汽压力/atm罐内实际温
7、度/完全未排除排除1/3排除1/2排除2/3 完全排除0.37290941001090.7901001051091151.01001091121151211.31091151181211261.5115121124126130利用电磁辐射产生的电磁波杀死物品上微生物的一种有效方法。用于灭菌的电磁波有微波、紫外线（UV）、x射线和射线等，在发酵工业中常用紫外线进行灭菌。原理：紫外线波长在260nm杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收，可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成正比。辐射灭菌缺点：穿透力不大。距照射物1.2m为宜。应用：无菌室，医院。注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用射线灭菌
8、：r射线，穿透力强，适用于堆积物品的灭菌。用于辐射灭菌的装置包括微波炉、紫外光灯、阴极射线管、X射线发生器、放射性核素等。是利用频率在20200kHz的声波作用下，使细菌细胞机械破裂和原生质迅速游离，达到消毒目的。如超声洗手器，用于手的消毒；超声洗涤机，用于注射器的清洁和初步的消毒处理。超声波消毒微波就是一种高频电磁波，其杀菌的作用原理，一为热效应，所及之处产生分子内部剧烈运动，使物体里外湿度迅速升高；一为综合效应，诸如化学效应、电磁共振效应和场致力效应。目前已广泛应用于食品、药品的消毒，用微波灭菌手术器械包、微生物实验室用品等亦有报告。微波消毒过滤除菌是用过滤的方法将液体或空气中的细菌除去，
9、以达到无菌目的。主要用于血清、毒素、抗生素等不耐热生物制品、培养基及空气的除菌。微生物学实验室最常用的除菌滤器是膜滤器。滤膜通常由醋酸纤维或硝酸纤维构成，孔径一般选择为0.45m，用于对少量的液体的除菌，如滤除血清和酶液中的微生物。过滤除菌 膜滤器化学灭菌是用化学药剂直接作用于微生物而将其杀死的方法。一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中的病原微生物，所以起消毒剂作用，而不起灭菌剂作用。原理是利用药物与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，而破坏细菌代谢机能，如使蛋白质变性、核酸的破坏、酶类失活、细胞膜透性的改变而杀灭微生物。化学灭菌常用的化学药剂有乙醇、臭氧、环氧乙烷、甲醛、石炭酸、
10、过氧乙酸、高锰酸钾和新洁尔灭等。常用化学杀菌剂及应用常用化学杀菌剂及应用类型名称使用浓度应用范围醇乙醇70%75%皮肤消毒或器皿表面消毒醛甲醛（福尔马林）36%40%熏蒸（接种室、培养室）酚石炭酸5%（m/v）空气喷雾消毒煤酚皂（来苏尔）3%5%（m/v）皮肤消毒酸乳酸0.331mol/L空气喷雾消毒醋酸35mL/m3熏蒸空气消毒碱石灰水1%3%（m/v）厕所、厂房灭菌氧化剂高锰酸钾0.1%3%（m/v）器具灭菌氯气3%自来水灭菌次氯酸钙（漂白粉）1%5%（m/v）清洗培养室、水消毒去垢剂新洁尔灭1:50皮肤消毒二、培养基湿热灭菌的理论基础二、培养基湿热灭菌的理论基础培养基灭菌是指从培养基中杀
11、灭有生活能力培养基灭菌是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。去杂菌更为常用。工业上培养基灭菌使用的方法是湿热灭菌。工业上培养基灭菌使用的方法是湿热灭菌。湿热灭菌简便、有效、经济。湿热灭菌简便、有效、经济。要求达到无菌程度（要求达到无菌程度（N=10N=10-3-3）即灭菌）即灭菌10001000次，次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。有一次是失败的，残留了一个活菌体。灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，
12、也是不必要的。因此在工程设计中常取必要的。因此在工程设计中常取N=10N=10-3-3。这是。这是工业上对培养基要求达到无菌程度标准。工业上对培养基要求达到无菌程度标准。概述湿热灭菌的效果，取决于致死温度和致死时间。杀死微生物的极限温度称为致死温度，在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。微生物的致死温度和致死时间 几类杂菌致死温度和致死时间几类杂菌致死温度和致死时间杂菌名称致死温度/致死时间/min嗜热芽孢杆菌12012枯草芽孢杆菌100617大肠杆菌6010肺炎球菌5657酵母菌5060510在一定温度下，微生物的受热死亡符合单分子反应动
13、力学，微生物的热死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成正比，即在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残存的活菌数的减少而递减，这就是对数残留定律，用方程表式为：t-受热时间；N-灭菌过程中某瞬间的活菌数；-灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率，即死亡速率；k-灭菌过程中菌体死亡速率常数（s-1或min-1），是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。理论灭菌时间的确定积分后得对数残留定律的数学表达式：t-表示理论灭菌时间，s；N0-开始灭菌(t=0)时原有活菌数，个/mL；Nt-经时间t后残存活菌个数，个/mL；k-菌死亡速率常数，s-1，与微生物的种类和温度有关。灭菌时间取决于污染程度（N0）、灭菌程度
14、（Nt）和k值。在实践过程中，因蒸汽压力（不稳定）、蒸汽的流量等有很大差别，甚至培养基中固体颗粒的大小、培养基的粘度等因素，都会影响灭菌效果。在灭菌过程中活菌数呈指数减少，如果取Nt=0，那么t=，显然与实际不符，也不可能实现。通常生产中对培养基的灭菌要求，即灭菌度为Nt10-3个罐（次），即每处理1000罐（次）中只允许1罐（次）因灭菌不彻底而染菌，或者说因培养基灭菌不彻底而造成染菌的几率是11000，这是工业上对培养基达到无菌程度的标准。微生物死亡速率常数k是微生物耐热性的一种特征，随着微生物种类和灭菌温度而异。相同温度下，不同微生物的k值是不同的，k值越小，微生物越耐热。如在121，细菌
15、芽孢的k值比营养细胞的k值小得多，表明细菌芽孢的耐热性比营养细胞大。因此，k值大小反映了微生物的耐热性。例如：芽孢在121时，k=60/s；营养体，在121，k=606*1010/s。需注意的几个问题 某些细菌的某些细菌的k值（值（121121C C）细菌名称k值/min-1细菌名称k值/min-1枯草杆菌FS52303.82.6嗜热芽孢杆菌FS15180.77梭状芽孢杆菌PA36791.8嗜热芽孢杆菌FS6172.9同一种微生物在不同的温度下，k值也不同。因此，对于同一微生物而言，温度升高时，k值越大，微生物越容易热死，需灭菌时间越短；反之，温度越低，k值越小，微生物越不易热死。不同温度下嗜
16、热肪芽孢杆菌的残留曲线 不同温度下大肠杆菌的残留曲线理论灭菌时间，只可以用于工程计算中，在实践过程中，因蒸汽的压力问题（不稳定）、蒸汽的流量问题有很大差别，甚至培养基中的固体颗粒的大小、培养基的粘度等因素，都会影响灭菌效果因此在实际生产中，通常采用经验数值，即歇灭菌，121，2030min；连续灭菌，137，1530s，在维持罐中保温820min。培养基组分的破坏主要包括两种情况：培养基中不同营养成分之间的相互反应。热敏感物质的降解，主要是对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解作用。灭菌温度的选择灭菌温度的选择灭菌温度/达到灭菌程度的时间/min 维生素B1的损失/%100110120130
17、140150843757.60.8510.1070.01599.9989271031灭菌温度、时间和维生素B1损失的关系达到相同灭菌效果，T越高，所需t 越短采用高温短时（HTST）灭菌效果好，既能达到灭菌的效果，又可以减少营养成分的破坏。灭菌过程实质上也是营养成分破环的过程，灭菌温度和时间的选择应考虑营养成分的破坏，要在保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。随着温度上升，菌体死亡速率增加的倍数要大于培养基成分破坏速率常数增加的倍数。也就是说，温度升高，菌体死亡速率要比营养成分破坏速率快得多。将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死亡速率，缩短灭菌时间，从而减少有效成分的破坏
18、。采用高温短时灭菌既能达到灭菌的效果，又可以减少营养成分的破坏。为什么要采用为什么要采用高温短时灭菌高温短时灭菌？三、工业培养基灭菌的操作方法分批灭菌连续灭菌空罐灭菌将配制好的培养基全部输入到发酵罐内或其它装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度的灭菌过程。分批灭菌（实消）分批灭菌（实消）实罐灭菌过程温度的变化情况实罐灭菌示意图 分批灭菌操作要点1.罐体清洗检查 清洗时应注意罐盖顶部的电器接口不能进水，否则可能会引起电器元件的损坏或数据测量错误。检查设备、管道有无渗漏，主要是冷却管道。检查发酵罐夹套内的冷凝水是否排掉，保证夹套内无冷却水。罐体内部结构
19、合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象。2.灭菌前准备 把发酵罐的分空气过滤器灭菌，并用无菌空气吹干。关闭空气管路进气阀，打开罐体排气阀卸压。将清洗完并校正好的电极插入罐内，连接好电极线。将配好的物料加入罐内，按照工艺要求加入所需的水定容，加入消泡剂，并检查有没有遗漏的物料。完毕，开搅拌以防料液沉淀。3.加热升温（1）间接加热 打开罐体各排气阀，同时，关掉夹套冷却水，打开夹套或蛇管蒸汽阀，将蒸汽引入夹套或蛇管对料液进行间接加热，微开夹套进水管排污阀，排出罐体及夹套内的冷凝水。待罐温升至8090，将排气阀逐渐关小。（2）直接加热 用夹套预热至8090后，关闭夹套进汽阀，打开罐体
20、进汽阀，蒸汽直接通入罐中，使罐温上升到118120，并打开各种排汽阀，并停止搅拌。4.保温保压 当物料温度接近工艺规定温度时，逐渐收小蒸汽阀门并调节各阀门的平衡，使压力和温度平稳达到工艺要求的压力和温度。通用发酵罐一般有三个开口（进空气管、出料管、取样管）进蒸汽，这就是所谓的“三路进汽”。“四路出汽”即蒸汽直接从排气、接种、进料和消沫剂管排汽。5.冷却降温 灭菌结束后，首先关闭所有的进汽阀，将排汽阀稍微收小一些。接着，当罐内压力低于空气分过滤器压力时，打开进空气阀通入无菌空气，以维持罐压。最后，打开冷却水阀在夹套或蛇管中通冷水进行快速冷却，开搅拌，使培养基的温度冷却至发酵工艺要求的温度。空气分
21、过滤器压力要高于罐内压力（一般降至为0.5Mpa左右时）时才能打开进空气阀，防止培养基倒流入过滤器。灭菌结束后，需要及时引入无菌空气，保证罐内压力（一般调节罐压在0.1Mpa）后，方进冷却水冷却。计算有一发酵罐，内装培养基40m3，在121温度下进行实罐灭菌。设每毫升培养基含有耐热菌的芽孢2107个，在121时的灭菌速率常数为0.0287s-1。试求灭菌失败的几率为0.001所需的时间。分批灭菌的优缺点优点分批灭菌不需其他设备，操作简单易行。省去了连消设备和操作，节省了动力。染菌的危险性较小人工操作较方便对培养基中固体物质含量较多时更为适宜缺点 升温慢、降温也慢，增加了发酵前的准备时间，延长了
22、发酵周期，设备利用低，而且无法采用高温短时灭菌。连续灭菌（连消）是指将培养基在罐外经过专用的消毒设备，连续进行加热、维持和冷却，然后再进入已灭菌发酵罐的灭菌方法。连续灭菌（连消）培养基连续灭菌的时间连消塔加热灭菌流程 连消塔加热连续灭菌流程连消塔加热连续灭菌流程（1）先在配料罐中将配好的培养基预热到6075。（2）用连消泵把预热的料液送入加热器（连消塔）底部，用高温饱和蒸汽使料液温度很快升至灭菌温度（一般以126132为宜），并停留时间为2030s。（3）料液升至灭菌温度后，由连消塔流入维持罐。生产上一般维持时间为57min。（4）灭菌结束后，料液经喷淋冷却器冷却，用冷水在排管外从上向下喷淋，
23、使管内料液逐渐冷却，料液在管内逆向流动。喷射加热灭菌流程 培养基喷射加热连续灭菌流程间 喷射加热器示意图1-喷嘴；2吸入口；3-吸入室；4-混合喷嘴；5-混合段；6-扩大管用泵将培养液打入喷射加热器，培养液以较高的速度自喷嘴喷出，借高速流体的抽吸作用与蒸汽混合后，培养液急速升至预定的灭菌温度(140)，然后在该温度下进入维持管道维持一段时间灭菌。灭菌后的培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器，因真空作用使水分急剧蒸发而迅速冷却至7080，再进入发酵罐冷却到接种温度。生培养液先在板式换热器2内进行预热，此处用到热集成，即灭菌后的培养液作为加热介质，把热量传递给生培养基，同时使灭菌后的培养液得到初步冷却
24、。在板式换热器3内预热后的培养液被加热到灭菌温度。加热源为蒸汽 在维持段维持一段时间，完成灭菌 在板式换热器2处被预冷。在板式换热器1处，经过预冷的培养液继续被冷却水进一步冷却至设定温度。薄板换热器加热灭菌流程 连续灭菌优缺点优点高产量。缩短灭菌周期，营养成分破坏少；蒸汽负荷均匀，锅炉利用率高，操作方便；发酵罐利用率高；较易自动控制，降低劳动强度；糖受蒸汽的影响较少；缺点设备比较复杂，投资较大。通入饱和蒸汽于未加培养基的罐体内进行湿热灭菌。培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法，则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。意义：由于空消时反应器内的死角少，蒸汽的传热效率高，对于反应器灭菌效果好，通常
25、在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。采用培养基连续灭菌的工艺，需要空消。空罐灭菌（空消）通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持20min。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。四、常见灭菌问题的分析及处理四、常见灭菌问题的分析及处理（一）影响培养基灭菌的其它因素培养基成分培养基的物理状态 pH 培养基的培养基的pHpH对灭菌时间的影响对灭菌时间的影响温度/孢子数/(个/mL)灭菌时间/minpH 6.1pH 5.3pH 5.0pH 4.7p
26、H 4.5120100008753311510000252512131311010000706535302410010000340720180150150微生物性质与数量蒸汽性质 高压蒸汽灭菌应采用饱和蒸汽，只有蒸汽的压力和温度相匹配才是保证灭菌效果的重要条件。饱和蒸汽如果继续加热，使蒸汽温度升高并超过沸点温度，此时得到的蒸汽称为过热蒸汽。灭菌器内的过热蒸汽遇到待灭菌物品时不能充分凝结成水，不能释放出足够的热能，不利于灭菌。（二）培养基和设备灭菌中出现的染菌及防止（二）培养基和设备灭菌中出现的染菌及防止消后培养基带菌的原因很多，统计表明，设备损坏、密封不严以及空气过滤系统带菌等是造成染菌的主要
27、原因。染菌原因及出现的概率染菌原因及出现的概率染菌原因 概率/%染菌原因 概率/%种子被污染8培养基灭菌不彻底9接种时罐压为零1设备及管道灭菌不彻底3空气过滤系统带菌18补料过程造成染菌5发酵液逃液2设备损坏或不严密26人为操作失误9原因不明191.空气系统空气过滤系统带菌是发酵全过程中引起染菌的重要因素。在灭菌过程中，主要是防止过滤器中过滤介质因蒸汽压力过大被冲翻而造成短路。若空气过滤器前后两个压力表的压力差大于0.03MPa，说明过滤器的滤芯损坏或被浸湿，应停止灭菌，拆开检查，将滤芯更换或吹干，再重新灭菌。2.设备及管道的渗漏及“死角”发酵罐及其管道渗漏罐壁与接管处泄露示意图取样阀门堵塞示意图发酵罐“死角”衬里鼓起或破裂造成的“死角”罐底的加强板形成“死角”法兰及移种管道安装“死角”（b）（a）蒸汽不易达到的“死角”及消除方法法兰安装不当造成的“死角”3.培养基成分 实罐灭菌过程中，最忌讳的是培养基原材料当中的颗粒和杂物，这是造成染菌的主要原因。淀粉质原料，在升温过快或混合不均匀时容易结块，使团块中心部位出现“夹生”，蒸汽不易进入将杂菌杀死。4.灭菌操作不当 主要原因是：实消时，由于操作不合理，未将罐内的空气完全排除，造成压力表显示“假压”；连续灭菌过程中，培养基灭菌的温度及其停留时间没有符合灭菌的要求，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度。