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1、发酵工艺项目八：发酵过程控制电子课件项目八项目八 发酵过程控制发酵过程控制分批发酵分批发酵补料分批发酵补料分批发酵连续发酵连续发酵 一一 微生物发酵方式微生物发酵方式分批式发酵法分批式发酵法又称分批培养，在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式，即是以微生物的一个生长周期为一个生产周期，包括设备的灭菌、种子培养、发酵操作。目前微生物培养的最基本的方式。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。分批式发酵法分批式发酵法在分批发酵过程中，随着微生物生长和繁殖，细胞量、底物、代谢产物的浓度等均不断发生变化。微生物的生长可分为4个阶段：停滞期（a）、对数生长期（b）、稳定期（c）和衰亡期（d）分批培养
2、过程典型的细菌生长曲线分批培养过程典型的细菌生长曲线分批培养过程中各阶段的细胞特征分批培养过程中各阶段的细胞特征生长阶段细胞特征停滞期适应新环境的过程，细胞个体增大，合成新酶和细胞物质，细胞数量增加很少，微生物对不良环境的抵抗力较弱对数生长期细胞活力很强，生长速率达到最大值且保持稳定，生长速率大小取决于培养基的营养和外部环境稳定期随着营养物质的消耗和产物的积累，微生物的生长速率下降，并等于死亡速率，系统中活菌的数量基本稳定衰亡期由于自溶酶的作用或有害物质的影响，使细胞破裂死亡分批式发酵的操作时间由两部分组成，一部分是进行发酵所需的时间，即从接种后开始发酵到发酵结束为止所需的时间，另一部分为辅助
3、操作时间，包括投料、灭菌、冷却、清洗所需的时间，这些时间总和为一个发酵周期，即从第一罐接种经发酵结束至第二罐接种为止的这段时间。在发酵过程中，微生物所处的环境不断变化，相关物理、化学和生物参数也随时间而变化，整个发酵是一个不稳定的过程。1、特点发酵工业中常见的分批发酵方法是采用单罐深层分批发酵法。每一个分批发酵过程都经历灭菌、接种、生长繁殖、菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。2、优缺点优点：发酵过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质，操作简单。微生物培养可靠、安全，操
4、作引起染菌的概率低，不会产生菌种老化和变异等问题。微生物发酵过程中，微生物的各个阶段的生理、代谢特征不同，易于控制。缺点：非生产时间较长、设备利用率低。每次发酵重复进行既是一种时间的浪费，又是原材料和能量和浪费。底物利用率低，分批发酵都存在一个微生物自身的增殖过程，增殖本身就是底物消耗的过程，这必然导致转化率的降低补料分批发酵补料分批发酵补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。补料分批发酵广泛应用于抗生素、氨基酸、酶制剂、核苷酸、有机酸及高聚物等的生产。1、优点与分批培养方式比较 与连续培养方式比较 1、可以解除培养过程中的底物抑制
5、、产物的反馈抑制和葡萄糖的分解阻遏效应；2、对于耗氧过程，可以避免在分批培养过程中因一次性投糖过多造成的细胞大量生长、耗氧过多以至通风搅拌设备不能匹配的状况；在某种程度上可减少微生物细胞的生成量、提高目的产物的转化率；3、微生物细胞可以被控制在一系列连续的过渡态阶段，可用来控制细胞的质量；并可重复某个时期细胞培养的过渡态，可用于理论研究。1、不需要严格的无菌条件；2、不会产生微生物菌种的老化和变异；3、最终产物浓度较高，有利于产物的分离；4、使用范围广。2、缺点缺点：存在一定的非生产时间；和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。连续发酵连续发酵连续发酵又称连续培养，培养基料液连续
6、输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。图10-6典型的实验室连续培养系统示意图磁搅棒pH控制器空气过滤器灭菌的培养基储存器加料和出料泵空气出口酸储存器空气过滤器压缩空气流量计样品（a）单罐连续发酵（b）多罐串联连续发酵优点：能维持低基优点：能维持低基质浓度；可以提高质浓度；可以提高设备利用率和单位设备利用率和单位时间的产量；便于时间的产量；便于自动控制自动控制缺点：菌种发生变缺点：菌种发生变异的可能性较大；异的可能性较大；要求严格的无菌条要求严
7、格的无菌条件件面包酵母的生产面包酵母的生产分批发分批发酵酵连续发酵连续发酵168h最大产量(吨)7天生产酵母(吨/1000加仑)平均每h生产酵母(吨)每吨酵母耗工时每吨酵母耗电(度/吨)2251.51.347.05003002.51.783.8430面包酵母连续发酵生产与用分批发酵生面包酵母连续发酵生产与用分批发酵生产相比，其生产效率较高，而成本较低产相比，其生产效率较高，而成本较低物理参数化学参数生物参数二二、发酵过程中的工艺参数发酵过程中的工艺参数（一）物理参数1、温度、温度 指发酵整个过程或不同阶段所维持的温度。指发酵整个过程或不同阶段所维持的温度。2、压力、压力 发酵过程中发酵罐维持的
8、压力，这是罐压发酵过程中发酵罐维持的压力，这是罐压非常重要参数非常重要参数 目的：防止外来杂菌的污染（？）目的：防止外来杂菌的污染（？）控制发酵液的溶氧水平（？）控制发酵液的溶氧水平（？）主要目的：罐内维持正压，可防止外界空气中杂菌的侵入，保证纯种培养。罐压的高低与氧，CO2在培养液中的溶解度有关，间接影响菌体代谢。罐压一般维持在表压罐压一般维持在表压0.020.05MPa(0.20.5大气压大气压)。测定：一个简单的膜式压力表的指示即测定：一个简单的膜式压力表的指示即可可。一个简单的膜式压力表的指示即可一个简单的膜式压力表的指示即可。隔膜式压力表3、搅拌转速（、搅拌转速（r/min）是指搅拌
9、器在发酵罐中转动速度，通常以每min的转数来表示。搅拌转速大小与发酵液的均匀性和氧在发酵液中的传递速率有关。发酵罐的搅拌器的转速，依罐的大小而异。小罐的搅拌器转速要比大罐的快些。发酵罐的容积(L)搅拌转速范围(r/min)3103050200500100005000020020002001200150100010080050400503002520025160不同大小的通用型发酵罐搅拌器转速范围指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每立方米发酵液所消耗的功率（kW/m3）4、搅拌功率通用式发酵罐的搅拌功率是选择电动机的依据确定罐内溶解氧等重要参数的主要指标，它的大小与溶氧传递系数KLa有关搅拌是以下
10、述方式促进氧的传递：搅拌能把大的空气气泡打成微小气泡，增加了接触面积，而且小气泡的上升的速度要比大气泡慢，因此接触时间也增长。5、空气流、空气流(V/V.min)指每min内每单位体积发酵液通入空气的体积，也叫通风比。它是需氧发酵中重要的控制参数之一。它的大小与氧的传递和其它控制参数有关。一般控制在0.51.0vvm之间通入发酵罐中的无菌空气的流量常用转子流量计测定。流量计中浮动转子的位置可以通过电容或电阻原理转换为电信号，经过放大之后启动控制器便可实现气体流量控制自动化。6、黏度（、黏度（Pa.s）黏度代表流体流动时内摩擦阻力的大小。黏度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵
11、罐中菌丝分裂过程的情况。它的大小可影响氧传递的阻力，也可反映相对菌体浓度。发酵液的表观黏度与培养基的成分有关，如含有多糖类物质时，非常粘稠。而且与菌体的浓度也有关系。特别是霉菌和放线菌培养，由于大量的菌丝体，使培养液十分稠厚。通常用表观黏度表示表观黏度通常用毛细管粘度计测定。生产上的简便测定方法用一根长0.5cm，直径0.8cm的玻璃管，吸取一定量的发酵液，用秒表记录其流出速度。测定时要注意温度与罐温相同。（二）化学参数1、基质浓度：发酵过程中糖、氮、磷等营养物质的含量是反映产生菌代谢变化的重要参数控制这些物质的供给和消耗是提高产量的重要手段。2、产物浓度：是发酵产物产量高低，代谢正常与否的重
12、要参数，也是决定发酵周期长短的根据。3、pH发酵过程中各种生化反应的酸碱性的综合反映酵母菌在酸性条件下产生乙醇，在碱性条件下发酵产物是甘油4、溶解氧（、溶解氧（DO）浓度）浓度氧是微生物体内一系列细胞色素氧化酶催化产能反应的最终电子受体，也是合成某些产物的基质。利用DO浓度的变化，可以了解微生物对氧利用的规律，反映发酵的异常情况，是一个重要的控制参数。了解产生菌对氧利用的规律指示发酵的异常情况（？）溶氧可作为发酵异常的指示？溶氧可作为发酵异常的指示？发酵中污染好气性杂菌：发酵23小时时溶解氧迅速下降污染噬菌体：菌液变稀，溶氧回升操作故障或工艺错误引起的发酵异常（三）生物参数1、菌丝形态、菌丝形
13、态 菌丝形态的改变是代谢变化的反映。菌丝形态的改变是代谢变化的反映。庆大霉素发酵，每庆大霉素发酵，每8小时取样一次，镜小时取样一次，镜下观察菌丝形态及其他参数。下观察菌丝形态及其他参数。抗生素发酵过程中，若感染了噬菌体，抗生素发酵过程中，若感染了噬菌体，菌丝自溶使培养液稀化。菌丝自溶使培养液稀化。2、菌丝浓度、菌丝浓度单位体积培养液中的菌丝数量。单位体积培养液中的菌丝数量。观察分析和控制产生菌生长变化的重要参数观察分析和控制产生菌生长变化的重要参数判断放罐的重要指标，判断放罐的重要指标，菌体浓度的大小和变菌体浓度的大小和变化速度对生化反应有影响，特别是对抗生素化速度对生化反应有影响，特别是对抗
14、生素等次级代谢产物的发酵，菌体浓度与培养液等次级代谢产物的发酵，菌体浓度与培养液的粘度，的粘度，DODO都有关。都有关。菌丝浓度的测定方法菌丝浓度的测定方法 湿重法湿重法 干重法干重法 体积法体积法3、菌体比生长速率、菌体比生长速率 发酵动力学中的一个重要参数发酵动力学中的一个重要参数4、氧比消耗速率、氧比消耗速率 又叫呼吸强度，表示微生物的相对需氧量。又叫呼吸强度，表示微生物的相对需氧量。5、糖比消耗速率、糖比消耗速率6、氮比消耗速率、氮比消耗速率发酵过程参数监测方法发酵过程参数监测方法参数名称单位测试方法意义、主要作用温度罐压空气流量搅拌转速搅拌功率粘度浊度泡沫体积氧传质系数KLa CPa
15、V/V.minR/minKWPa.s透光度l/h传感器压力表传感器传感器传感器粘度计传感器传感器间接计算；在线 维持生长、合成维持正压、增加溶氧供氧、排泄废气、提高KLa物料混合、提高KLa反映搅拌情况、KLa反映菌的生长、KLa反映菌的生长情况反映发酵代谢情况反映供氧效率 物理参数参数名称单位测试方法意义、主要作用pH基质浓度溶解氧浓度氧化还原电位产物浓度尾气氧浓度尾气CO2浓度菌体浓度RNA、DNA含量ATP、ADP、AMPNADH含量摄氧率呼吸强度呼吸商比生长速率g/mlppmmVg/mlPa%G(DCW)/mlMg(DCW)/gMg(DCW)/gMg(DCW)/ggO2/L.hgO2/
16、g菌.h1/h传感器取样传感器传感器取样传感器传感器取样取样取样取样间接计算间接计算间接计算间接计算了解生长和产物合成了解生长和产物合成反映氧供需情况反映菌的代谢情况产物合成情况了解耗氧情况了解菌的呼吸情况了解生长情况了解生长情况了解能量代谢活力了解菌的合成能力了解耗氧速率了解比耗氧速率了解菌的代谢途径了解生长化学、生物参数化学、生物参数目前较常测定的参数有温度、罐压、目前较常测定的参数有温度、罐压、空气流量、搅拌转速、空气流量、搅拌转速、pH、溶氧、溶氧、基质浓度、菌体浓度基质浓度、菌体浓度(干重、离心压干重、离心压缩细胞体积缩细胞体积%)等。等。不常测定的参数有氧化还原电位、粘不常测定的参
17、数有氧化还原电位、粘度、尾气中的度、尾气中的O2和和CO2含量等。含量等。参数测定方法有：参数测定方法有：在线测定（传感器）在线测定（传感器）取样测定（离线测定）取样测定（离线测定）传感器（电极或探头）：能感受规定的被测量并按照一定的规律将其转换成可用信号的器件或装置，它通常由敏感元件、转化元件及相应的机械结构和线路组成。生物传感器：是利用酶、抗体、微生物等作为敏感材料，将所感受的生物体信息转换成电信号进行检测的传感器。传感器传感器酶传感器微生物传感器免疫传感器细胞传感器组织传感器生物电子传感器生物传感器的种类生物传感器的结构一般是在基础传感器生物传感器的结构一般是在基础传感器(电化学电化学装
18、置）上再耦合一个生物敏感膜（称为感受器装置）上再耦合一个生物敏感膜（称为感受器或敏感元件）或敏感元件）生物敏感膜紧贴在探头表面上，再用一种半渗生物敏感膜紧贴在探头表面上，再用一种半渗透膜与被测溶液隔开。当待测溶液中的成分透透膜与被测溶液隔开。当待测溶液中的成分透过半透膜有选择地附着于敏感物质时，形成复过半透膜有选择地附着于敏感物质时，形成复合体，随之进行生化和电化学反应，产生普通合体，随之进行生化和电化学反应，产生普通电化学装置能感知的电化学装置能感知的O2O2、H2H2、NH4+NH4+、CO2CO2等，等，并通过电化学装置转换为电信号并通过电化学装置转换为电信号 生物传感器的结构和原理生物
19、传感器测量原理生物传感器测量原理发酵工业用的传感器应满足的要求发酵工业用的传感器应满足的要求 1)1)传感器能经受高压蒸汽灭菌；传感器能经受高压蒸汽灭菌；2)2)传感器及其二次仪表具有长期稳定性；传感器及其二次仪表具有长期稳定性；3)3)最好能在过程中随时校正；最好能在过程中随时校正；4)4)探头材料不易老化，使用寿命长；探头材料不易老化，使用寿命长；5)5)探头安装使用和维修方便；探头安装使用和维修方便；6)6)解决探头敏感部位被物料解决探头敏感部位被物料(反应液反应液)粘住、堵塞粘住、堵塞问题；问题；7)7)价格合理，便于推广应用。价格合理，便于推广应用。对被检测物质具有极好的选择性，噪音
20、低对被检测物质具有极好的选择性，噪音低操作简单，需用样品少，能直接完成测定操作简单，需用样品少，能直接完成测定经固定化处理后，可保持长期生物活性，传感经固定化处理后，可保持长期生物活性，传感器可经得住反复使用器可经得住反复使用能在短时间内完成测定能在短时间内完成测定不要求样品具有透明度不要求样品具有透明度主要缺点是寿命较短主要缺点是寿命较短生物传感器的特点三、三、发酵过程中温度的的影响及变化发酵过程中温度的的影响及变化温度对发酵的影响从酶促反应动力学方面温度越高，酶促反应速度越快，菌体增殖、产物合成的时间均可提前；但是温度越高，酶越易失活，菌体易衰老，整个发酵周期缩短，影响发酵的最终产量从温度
21、对发酵液的性质的影响方面温度影响了发酵液的许多性质，包括营养物质的电离状态、发酵液的粘度等。以蔗糖为底物的黄源胶的发酵过程中，当黄源胶的浓度达到24g/L后，由于黄源胶的高粘度的性质，使得发酵液的温差可以达到15以上，严重的影响了黄源胶产生菌的代谢和生理活动。温度对菌体代谢调节机制的影响表现在影响生物合成的方向、表现在影响生物合成的方向、速率和产物质量。速率和产物质量。四环素发酵中金色链霉菌同时四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。能产生金霉素。在低于在低于30温度下，该菌种合温度下，该菌种合成金霉素能力较强。成金霉素能力较强。当温度提高，合成四环素的比当温度提高，合成四环素的比例也提高。在
22、温度达例也提高。在温度达35则只产则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。生四环素而金霉素合成几乎停止。分段控制理论最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：30，而产物合成温度为3234;酵母在发酵前期或酒母培养阶段，要尽量使温度控制在2830之间，以防止酵母菌过早衰老、死亡，引起发酵不完全。发酵热与罐温控制影响发酵温度的因素产热因素：生物热和搅拌热。散热因素：蒸发热和辐射热。发酵热发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。通气搅拌作用、菌体生长繁殖Q发酵热=Q生物热+Q搅拌热-Q蒸发热-Q辐射热Q生物热定义定义：生产菌在生长繁殖时产生的大量热量。用途用途：合
23、成高能化合物，供微生物生命代谢活动，热能散发。影响生物热的因素影响生物热的因素随菌株，培养基，发酵时期不同而不同菌株对营养物质利用速率越大，成分越丰富，生物热也就越大。旺盛期的生物热大于其他时间的生物热。大小还与菌体呼吸强度有对应关系。酵母菌在有氧条件 Q生物热生物热=-294kcol/mol=-2944.18KJ/mol酵母菌无氧条件Q生物热生物热=-20kcol/mol=-204.18KJ/mol四环素生物合成过程中系列参数的动态变化过程1：效价；2：呼吸强度；3：生物热；4：糖浓度生物热和菌的呼吸强度的变化有对应关系当产生的生物热达到高峰时，糖的利用速度也最大。Q搅拌热搅拌热通风发酵都有
24、大功率搅拌，搅拌的机械运动造成液体之间，液体与设备之间的摩擦而产生的热。可用下式计算：Q搅拌热=P3601P搅拌浆的搅拌功率（kw）3061机械能转为热能的热功当量（kw.h）Q蒸发热空气进入反应器与发酵液进行长时间的气、液接触，大部分气体（称为尾气）仍旧排放出反应器，由于尾气在与发酵液接触的过程中实际上在进行质量的传递，使进入的空气湿度增加，水分随着尾气一起被排除，同时伴随热量传递，这一部分热量，称之为蒸发热Q辐射热反应器内部的温度与反应器的环境温度的差别造成的热量传递。通常按照Q发酵热的5%-10%计算。最适温度的确定与选择在发酵过程中，最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长
25、或发酵产物的生成。最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条件和菌体生长阶段有关。1、根据菌种及生长阶段选择前期菌量少，稍高的温度，使菌生长迅速；中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需延长中期，提高产量，温度要稍低，推迟衰老四环素生长阶段控制在四环素生长阶段控制在28，合成期再降至，合成期再降至26，后期再升温；，后期再升温；黑曲霉生长期控制在黑曲霉生长期控制在37，产糖化酶降至，产糖化酶降至3234。但也有的菌种产物形成比生长温度高。但也有的菌种产物形成比生长温度高。谷氨酸产生菌生长谷氨酸产生菌生长3032，产酸，产酸3437林可霉素发酵试验林可霉素发酵试验发酵的变温培养发酵的变温培养接种后接种
26、后10h左右已进入对数生长期，随左右已进入对数生长期，随后是后是10h左右的加速生长期，在左右的加速生长期，在40h左右左右对数生长期基本完成，在对数生长期基本完成，在50h左右转入左右转入生产期。生产期。正交设计及实验前60h按31控制，缩短了适应期使发酵提前转入生产阶段，同时菌丝体已相当量的积累，为大量分泌抗生素提供物质基础；60h后将罐温降至30，增强抗生素合成有关的酶活性，抗生素分泌量有所增加，同时因分泌期的延长有利于进一步积累抗生素；发酵进入后期罐温再回升至31使生产菌在生命的最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物。2、根据培养条件选择、根据培养条件选择通气条件差时可适当降低温度，
27、使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也要低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。3、根据菌生长情况、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。温度控制方法温度控制方法发酵温度的监测及控制发酵温度的监测及控制在发酵过程中，通过显示器显示的温度变化，可以及时通过手动调整阀门。一般由于发酵热的产生会导致发酵液温度升高，需要及时降温，这时可以通过打开夹套进水阀门，通入冷水及时降温；若需加热，可预先通入冷水，然后通入蒸汽加热夹套内的水至所需温度即可。温度自控系统示意图
28、发酵过程的自动控制是借助于自动化仪表和发酵过程的自动控制是借助于自动化仪表和计算机组成的控制器，控制一些发酵的关键计算机组成的控制器，控制一些发酵的关键变量，达到控制发酵过程的目的。变量，达到控制发酵过程的目的。如发酵温度的开关控制系统就是通过温度传如发酵温度的开关控制系统就是通过温度传感器检测发酵罐内温度，如温度低于设定点，感器检测发酵罐内温度，如温度低于设定点，冷水阀关闭，蒸汽或热水阀打开；如温度高冷水阀关闭，蒸汽或热水阀打开；如温度高于设定点，蒸汽或热水阀关闭，冷水阀打开。于设定点，蒸汽或热水阀关闭，冷水阀打开。控制阀的动作是全开或全关，所以称为开关控制阀的动作是全开或全关，所以称为开关
29、控制。控制。由于温度传到传感器有个延迟时间，检测到的总是加热器滞后的温度，所以温度总是上下波动，需及时监控和调整。常见问题及原因分析常见问题及原因分析在发酵过程中，采用自控的方式控温，在温度控制过程中发现T较快或缓慢的上升比设定温度高，并仍然有上升趋势。编号分析原因解决方案1热水箱里面没有足够的热水往热水箱里加足够量的水并加温2直接采用了手动循环冷却采用自动控制3其他正常，而下夹套手动冷却阀门没关关闭下夹套手动冷却阀门4（冬天或外面气温较低）加热系统没打开打开加热系统5外面温度低，水泵坏用水银温度计测量并请示汇报6自控系统有问题（温度探头坏、接触不良）用水银温度计测量并请示汇报温度上升的原因分
30、析及解决方法温度的控制发酵罐：夹套（10M3以下）盘管（蛇管）（10M3以上）酵母菌在酸性条件下产生？在碱性条件下发酵产物是？四、发酵过程中四、发酵过程中pH的影响及变化的影响及变化vpH值影响到了酶的活性，不同的酶有其最适合的pH值vpH值影响了菌体细胞膜的带电状态，从而影响了细胞膜的渗透性（一）pH对菌体生长和产物合成的影响vpH值影响Medium中的营养成份和中间性代谢产物的电离状态，从而影响了微生物对这些物质的正常利用。vpH值不同，其菌体代谢途径也会发生变化，使代谢产物的质量和比例发生改变。在黑曲霉的柠檬酸发酵过程中，pH=2-3时，菌体合成并分泌柠檬酸，而当pH在中性时，（PH=6
31、-7）则合成积累草酸。不同不同pHpH下加糖对糖耗和青霉素产量的影响下加糖对糖耗和青霉素产量的影响pH范围 糖耗/%残糖/%青霉素相对单位pH6.06.3加糖100.5较高pH6.66.9加糖70.2高pH7.37.6 加糖 70.5低pH6.8控制加糖70.2最高速率恒定/（0.055%/h）vpH对细胞形态的影响实际上是pH对细胞生长和代谢途径影响的外部（宏观）表现在青霉素发酵过程中，pH6.0时，菌丝体缩短，而pH7.0时，膨胀的菌丝体明显的增加。（二）影响发酵液pH变化的因素v碳源过量。碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加上溶氧不足，致使有机酸积累（？），而pH下降v生理酸性
32、物质被利用。铵被利用，pH下降v消泡剂添加过量（？）1、引起pH下降的因素有机酸大量积累？降糖速度过快，特别是EMP速度过快，打破了EMP:TCA之间的平衡，导致丙酮酸的代谢转向供氧不足。在对数生长期，或者产物合成期，由于菌体强烈的需氧，导致发酵液的DO值急剧下降，使得有氧氧化途径受阻，使乳酸等酸性物质积累生理酸性物质？(NH4)2SO4(NH4)2HPO4 NH4H2PO4 KH2PO4K2HPO4什么是消泡剂？消泡剂添加过量为什么会引起发酵液pH的下降？各种油脂会被脂肪酸酶分解成各种脂肪酸，造成发酵液的PH值的下降。消泡剂消泡剂v氮源过多，氨基氮释放v生理碱性物质的存在v中间补料，碱性物质
33、添加过多，氨水或尿素等v发酵后期，菌体自溶造成pH的上升2、引起pH上升的因素氮源过高造成pH上升？当菌体生长到一定的阶段后，由于自身分泌的胞外蛋白酶，对培养基中的蛋白质的水解，则NH4+的浓度增加，释放出氨气，导致发酵液的pH的上升许多品种（如土霉素、四环素）发酵初期出现pH上升一、一、pH测量测量（三）（三）pH检测与控制检测与控制1 1、取样罐外测量、取样罐外测量有试纸法（精密级）；酸度计法。罐外取样测量不利于实现自动化管理。2 2、在线测量、在线测量目前，现代化的生产企业大部分是采用pH值的在线（on line）检测、控制方式，其核心部件是pH检测的电极，外加不锈钢护套后安装于罐内另外
34、有pH显示仪表。这种电极不同于普通的pH检测电极，其基本要求是：耐高温、经受120以上高温、60min的处理；需要有压力、温度补偿系统。目前已试制成功适合于发酵过程监测p值的电极，能连续测定并记录p值的变化，将信号输人p值控制器来指令加糖、加酸或加碱，使发酵液的p值控制在预定的数值。实际操作时，在移种前要通过取样测定发酵培养基的实际pH与记录的在线pH相比较，重新设定pH（1）取样测定pH，本步骤很重要。取样试管或烧杯要用发酵液洗涤4次；（2）根据实际测定的pH与记录的在线pH相比较，重新设定pH；（3）调节pH到工艺要求。如果有碱罐的，可以将碱管道的进碱阀门打开；然后将PLC控制系统打开到自
35、控；（4）自接种起，按规定时间取样，根据取样情况，及时调整pH。pH自动控制系统当p探头测得反应器内的p高于设定值时，p放大控制仪向酸泵发出信号滴加酸溶液，否则，向碱泵发出信号滴加碱溶液。p控制仪通过调节酸碱加入的频度、滴入持续时间来进行控制。pH自动控制系统（四）pH的控制方法调节基础培养基的配方常用的缓冲性物质有：CaCO3，柠檬酸盐、磷酸盐等。其中CaCO3在许多发酵过程中都使用，例如：黄源胶、Bt等；而后者，构成一个缓冲性体系应用于培养基中，在地衣芽孢杆菌的耐高温-淀粉酶（thermostableamalase）发酵过程中使用。在发酵过程中直接补加酸、碱或补料的方式来控制，特别是补料效
36、果比较明显。采用补料的方法可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH和改变培养液的性质（如粘度）等几种目的。青霉素发酵的补料工艺，利用控制葡萄糖的补加速率来控制pH的变化（已实现自动化）其青霉素产量比用恒定的加糖速率或加酸、碱来控制pH的产量高25%。通氨或流加尿素进行调节通氨一般是使用压缩氨气或工业用氨水（浓度20左右）以尿素作为氮源进行流加调节pH值，是目前国内味精厂普遍采用的方法。具体的流加方法应根据微生物的特性、发酵过程的菌体生长情况、耗糖情况等来决定，一般控制在pH值7.08.0，最好是采用自动控制连续流加方法。（五）发酵控制过程中常见问题、原因及处理（五）发酵控制过程中常见问题、
37、原因及处理在发酵过程中，某个阶段需要加碱调节pH时，出现加碱加不上当时这个批次使用的pH电极为老电极。出现图中的情况后，排除了其他各种可能的原因。最后认定是pH电极出现问题，解决方法是取样测试pH值，并且在下个批次使用新的pH电极。pH加不上的原因分析及解决方案编号原因解决方案1碱罐与发酵罐的压差太小升碱罐压或降发酵罐压2电磁阀不工作或损坏，如堵塞等检查、维修电磁阀，使之工作3根本就忘了打开自控打开自控4电极的问题取样测pH，并请示汇报5控制器或连接线的原因取样测pH，并请示汇报6将自控中的方式选择中选了“加酸”将自控中的方式选择中改为“加碱”7管路的不通（包括管路上的阀门未开）使管路保持畅通
38、（将阀门打开）发酵控制过程中发现pH直线上升，并仍然有上升趋势。pH值在12h处突然开始呈现直线上升的趋势。工程师及时查找原因，最后发现PLC控制终端上的加碱方式是手动加碱，这个直接导致了发酵液的pH值迅速上升。解决方法是立刻把加碱方式改为自动控制。编号分析原因解决方案1电磁阀内漏立即关闭手动阀门，并请示汇报，检查维修2无意打开了手动加碱立即改为自控3黏度过高可以使pH在一段时间内上升，但不会一直有上升趋势正常发酵pH曲线异常发酵pH曲线（一）氧对发酵的影响1、发酵过程中氧的需求、发酵过程中氧的需求五五 溶解氧对发酵的影响及变化溶解氧对发酵的影响及变化不同种类的微生物的需氧量不同，一般为不同种
39、类的微生物的需氧量不同，一般为25100mmol O2/(Lh)，但也有个别菌很高。同一，但也有个别菌很高。同一种微生物的需氧量，随菌龄和培养条件不同而种微生物的需氧量，随菌龄和培养条件不同而异。异。在培养过程中不需要使溶解氧浓度达到或接近饱和值，而只要超过某一临界氧浓度即可。临界溶氧浓度就是满足微生物呼吸的发酵液中最低溶氧浓度微 生 物温度（C）临界氧浓度（mmol/L）固 氮 菌大肠杆菌酵 母产黄青霉303730240.0180.0080.0040.0222、溶氧对发酵的影响、溶氧对发酵的影响供氧对谷氨酸发酵的影响极为显著通风适量生成谷氨酸；通风过量生成通风适量生成谷氨酸；通风过量生成-酮
40、戊二酸；通风不足生成乳酸或琥酮戊二酸；通风不足生成乳酸或琥珀酸。珀酸。（二）发酵过程中溶解氧的变化及异常现象（二）发酵过程中溶解氧的变化及异常现象1、溶解氧反映微生物代谢状况、溶解氧反映微生物代谢状况 每种产物发酵的溶氧浓度变化都有自己每种产物发酵的溶氧浓度变化都有自己的规律的规律发酵前期，由于微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降，出现一个低峰，发酵液中的菌浓也不断上升。过了生长阶段，需氧量有所减少，溶氧浓度以过一段时间的平衡阶段或随之上升后，就开始形成产物，溶氧浓度也不断上升。发酵中后期，溶氧浓度明显地受工艺控制手段的影响。外界补料，溶氧的变化随补料时的菌龄、
41、补入物质的种类和剂量不同而不同。如补糖，则摄氧率增加，溶氧浓度下降发酵后期由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升。2、溶解氧的异常现象溶解氧的异常现象污染好气性杂菌，大量溶氧被消耗；菌体代谢发生异常，需氧要求增加；某些设备或工艺控制发生故障或变化，如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢；消泡剂加入过多；影响供氧的工艺操作如停止搅拌、闷罐等原因会引起溶氧异常下降现象。引起溶氧异常升高现象的原因主要是耗氧出现改变，如菌体代谢异常，耗氧能力下降，或污染烈性噬菌体所致。培养菌的生长过程跟污染杂菌同样会引起DO的迅速下降或上升。因此DO是反应微生物代谢状况，不能完全反应
42、污染与否，不能作为发酵异常的指示。而且有的产品在培养过程中要人为的控制DO。比如搅拌转速、空气压力、通气量等都会直接影响DO的变化3、影响溶氧的因素、影响溶氧的因素1、养料的丰富程度：通过减少菌的生长、养料的丰富程度：通过减少菌的生长速率达到限制菌对氧的大量消耗从而提速率达到限制菌对氧的大量消耗从而提高溶氧水平高溶氧水平2、发酵液的性质：粘度大，溶氧少、发酵液的性质：粘度大，溶氧少3、温度：降低培养温度、温度：降低培养温度,C*提高，可得提高，可得到较高的溶氧值。到较高的溶氧值。4、通气量：提高通气量，增加液体中夹、通气量：提高通气量，增加液体中夹持气体的平均成分持气体的平均成分5、搅拌：增加
43、搅拌可以改善罐内液体的混合和循环，从而具有抑制气泡聚合的效果，而且可以避免低于平均氧浓度的死角存在6、罐内压力：提高罐压，增加C*。缺点：同时增加二氧化碳的溶解度，影响pH及可能会影响菌的代谢，而且对设备要求高。7、挡板：通过挡板的剪切作用,避免低于平均氧浓度的死角存在。（四）氧的传递氧的传递双膜理论基本论点双膜理论基本论点1、在气泡与包围着气泡的液体之间存在着界面，在界面的两旁具有两层稳定的薄膜，即气膜和液膜。氧气分子只能以扩散方式，即借浓度差而透过双膜。2、在气液界面上，气液两相的浓度总是互相平衡（空气中氧的分压与溶于液体中的氧浓度处于平衡状态）。3、两膜以外的气、液两相主流中，由于流体充
44、分流动，氧的浓度基本上是均匀的，也就无任何传质阻力。双膜理论的双模及气液接触氧的传递速率方程氧的传递速率方程OTR=KLa（C*-CL）OTR-单位体积培养液的溶氧速率，单位体积培养液的溶氧速率，mmol/m3h；a-比表面积（单位体积溶液中所含有的气液接触面积，比表面积（单位体积溶液中所含有的气液接触面积，m2/m3；KL-液膜传递系数，液膜传递系数，m/s；KL-以浓度差为推动力的液相体积溶氧系数，以浓度差为推动力的液相体积溶氧系数，h-1；C*-与气相氧分压平衡的液相溶氧饱和浓度，与气相氧分压平衡的液相溶氧饱和浓度，mmol/m3；CL-液相主体中的溶氧浓度，液相主体中的溶氧浓度，mmo
45、l/m3。KLa是反映发酵设备供氧能力的一个重要参数，可以作为一个整体测定。CL有一定的工艺要求，所以可以通过KLa和C*来调节，调节KLa是最常用的方法。影响传氧速率的因素影响传氧速率的因素最简单的方法就最简单的方法就是增加罐压增加是增加罐压增加罐压虽然提高了罐压虽然提高了氧的分压，从而氧的分压，从而增加了氧的溶解增加了氧的溶解度，但度，但CO2的分的分压也相应增加而压也相应增加而影响了细胞的生影响了细胞的生长和产物的代谢长和产物的代谢增加空气中氧增加空气中氧的含量，进行的含量，进行富氧通气操作。富氧通气操作。这种分离方法这种分离方法的成本都较高，的成本都较高，富氧通气还处富氧通气还处于研究
46、阶段。于研究阶段。罐内液柱高度。罐内液柱高度。通风效率是随通风效率是随发酵罐的高径发酵罐的高径比比H/D的增大的增大而增加。但而增加。但H/D太大，溶太大，溶氧系数反而增氧系数反而增加不大。一般加不大。一般罐高径比罐高径比H/D=23为宜。为宜。罐容。在几何罐容。在几何形状相似的条形状相似的条件下，发酵罐件下，发酵罐体积大的氧利体积大的氧利用率可达用率可达7%10%，而，而体积小的氧利体积小的氧利用率只有用率只有3%5%。发酵液中溶解氧的控制发酵液中溶解氧的控制主要是设法提高氧的传递推动力和氧传主要是设法提高氧的传递推动力和氧传递速率常数，因此影响供氧效果的主要递速率常数，因此影响供氧效果的主
47、要因素有：因素有：空气流量空气流量(通风量通风量)；搅拌搅拌转速；转速；气体组分中的氧分压；气体组分中的氧分压；罐压；罐压；温度；温度；培养基的物理性质等培养基的物理性质等 菌体的生理特性、培养菌体的生理特性、培养基的丰富程度、温度等。基的丰富程度、温度等。供氧方面供氧方面影响需氧影响需氧r=Qo2X供氧的控制供氧的控制调节通风与搅拌调节通风与搅拌氧传递系数KLa是随通风量的增加而增大的，当增加通风量时，空气的线速度也就相应地增大，从而增加了溶氧，氧传递系数KLa相应地也增大。搅拌转速对KLa值具有很大的影响搅拌能把大的空气气泡打成微小气泡，增加了接触面积搅拌使液体作涡流运动，使气泡做螺旋运动
48、上升，增加了气液的接触时间。发酵罐容积m30.050.55102050搅拌转速r/min550300185160140110通风比（m3/m3.Min）1:0.5-0.61:0.31:0.18-0.21:0.16-0.171:0.151:0.12改变气体组成中的氧分压改变气体组成中的氧分压改变罐压。改变罐压。增加罐压实际上就是改变氧的分压Po2来提高C*，从而提高供氧能力，但此法不是十分有效改变发酵液的理化性质改变发酵液的理化性质通入纯氧方法来改变空气中氧的含量，提高了C*值，因而提高了供氧能力需氧的控制需氧的控制微生物的吸氧量常用呼吸强度和耗氧速率两种方法来表示呼吸强度又称氧比消耗速率，是指
49、单位质量的干菌体在单位时间内所吸取的氧量，以QO2表示，单位为mmolO2(g干菌体h)。耗氧速率又称摄氧率，是指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，以r表示，单位为mmolO2(Lh)。影响因素有菌体浓度、菌龄、基质种类和浓度及培养条件，其中以菌浓影响最明显。菌体（细胞）浓度，简称菌浓，是指单位体积培养液中菌体的含量。1、依靠调节培养基的浓度来控制菌浓。2、利用菌体代谢产生的CO2量来控制生产过程的补糖量或利用溶氧的变化自动控制补糖速率，以控制菌体的生长率和浓度，保证产物的比生长速率维持在最大值，又不会使需氧大于供氧。（一）碳源对发酵的影响碳源对发酵的影响六、基质对发酵的影响及补料控制六、基
50、质对发酵的影响及补料控制有葡萄糖、蔗糖等。能迅速参与代谢、有葡萄糖、蔗糖等。能迅速参与代谢、合成菌体和产生能量，并产生分解产物，合成菌体和产生能量，并产生分解产物，有利于菌体生长，但有的分解代谢产物有利于菌体生长，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用对产物的合成可能产生阻遏作用1、速利用碳源、速利用碳源2、缓慢利用碳源、缓慢利用碳源多数为聚合物，淀粉等。为菌体缓慢利多数为聚合物，淀粉等。为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生素的分泌期，也为许多有利于延长抗生素的分泌期，也为许多微生物药物的发酵所采用。微生物药物的发酵所采用。因此