《发酵工艺 项目六：发酵生产种子制备电子课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《发酵工艺 项目六：发酵生产种子制备电子课件.ppt（46页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、发酵工艺 项目六：发酵生产种子制备电子课件项目六项目六 发酵生产种子制备发酵生产种子制备一、种子生产工艺种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。种子扩大培养的目的是：接种量的需要；菌种的驯化；缩短发酵时间，减少杂菌污染，保证生产水平。种子扩大培养流程种子扩大培养流程菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；菌种细胞的生命力旺盛，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短；菌种能保持稳定的生产性能，生理性状稳定；无杂菌和噬菌体的污染；保持稳定的生产能力。因此，菌种扩大
2、培养的任务，不但获得纯而壮的菌体，而且还要获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。条件条件实验室种子制备阶段生产车间种子制备阶段种子制备种子制备固体培养固体培养适于产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖快的菌种，产生的孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌细菌芽孢的制备。细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，培养温度一般为37，产芽孢的细菌需要培养510天。霉菌孢子的制备。霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基，培养的温度一般为2528，培养时间为414天。放线菌孢子的制备。放线菌的培养基中含有麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等，培养温度一般为
3、28，培养时间为514天。实验室种子制备实验室种子制备（1）霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮等天然农产品为培养基。营养成分适合霉菌孢子繁殖，这些物质表面积大，易于获得大量孢子。培养温度一般为2528C，培养时间一般为414d。米孢子是将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米粒上，恒温培养一段时间后产生分生孢子。以一定量的斜面制备的孢子悬液接入大（小）米或其它固体培养基上，培养成熟后称为“亲米”，由“亲米”再转至大（小）米培养基上进一步放大，培养成熟后称为“生产米”，用“生产米”接入种子罐。米孢子的制备流程（2）放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基
4、中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。其中的碳源和氮源不要太丰富，因为碳源丰富易造成生长环境呈生理酸性，不利于孢子形成；而氮源丰富则有利于菌丝繁殖，不利于孢子形成。摇瓶培养及摇瓶液体种子制备液体培养液体培养适于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种好氧培养。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子接入种子罐，如产链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌厌氧培养。对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子的制备过程如下：试管三角瓶卡式罐种子罐摇瓶培养即振荡培养，是一种能保证好氧菌获得充足溶氧的液体培养方法。摇瓶培养设备主要有旋转式摇
5、床和往复式摇床两种类型，其中以旋转式最为常用 旋转式摇床振荡培养中所使用的发酵容器通常为三角瓶，也有使用特殊类型的烧瓶或试管。振荡培养中，三角烧瓶用68层医用纱布封口或硅胶塞，试管塞一般用普通棉塞或胶塞。实验室制备的摇瓶种子还不能满足生产所需要的足够数量的种子，因此，摇瓶种子仍需要在小型发酵罐中继续培养由于其目的是培养种子，为有别于生产产物为目的的大发酵罐，一般把用来培养种子的小型发酵罐称为种子罐。通过种子罐逐级培养，然后向发酵罐大量地接入培养成熟菌种可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率；节约了发酵培养的动力消耗；并有利于减少染菌机会。生产车间种子制备生产车间种子制备
6、（1）摇瓶培养方法摇瓶振荡培养的目的在于改善活细胞的氧气和营养物的供给。摇瓶供氧实际上就是将摇瓶或试管置于摇床中，通过摇床的振荡来使氧气通过纱布层或硅胶层扩散至瓶内，进而扩散并溶解在液体中供菌体生长和产物形成的需要。摇床转速越快，偏心距越大，通气越好。一般来说，振荡培养丝状微生物时培养基最佳容量为一般为50100mL/500mL三角烧瓶，或2550mL/250mL三角烧瓶，即为所使用的发酵容器容积的10%20%。特别注意两个问题一是温度。另一个十分重要的问题就是维持连续振荡。好氧菌的培养是个需氧过程，因此要不停的振荡，特别是灭菌培养基内几乎没有溶氧，接种之后应充分振荡。黑曲霉生产柠檬酸的发酵试
7、验中，中断通气时柠檬酸的产生直线下降，甚至不可逆转。在繁殖期中断通气20min不会使菌株的活力下降，但菌株积累柠檬酸的能力受到不可逆的破坏或减慢。（2）摇瓶种子制备（三）种子罐培养（三）种子罐培养实验室制备的孢子或液体种子还需要移种至小型发酵罐中继续扩大培养，由于其目的是培养种子，为有别于生产产物为目的的大发酵罐，一般把用来培养种子的小型发酵罐称为种子罐。培养基的特点：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，更接近于发酵培养基。1.种子罐的作用 种子罐的作用主要是使实验室培养阶段获得的有限数量的孢子（菌体）发芽、生长并繁殖成大量菌丝体（菌体），满足发酵罐的需要（菌体生长和产物形成）。接入发酵罐
8、后能迅速生长，达到一定的菌体量。2.种子罐大小和级数确定 种子制备过程中，因菌种不同，可采用不同种子罐级数。种子罐级数是指制备种子需要在种子罐中逐级扩大培养的次数。一般根据种子罐从小到大的顺序，将最小的称为一级种子罐，次小的称为二级种子罐，依次类推。其它依次类推。种子罐级数主要取决于两方面：菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积。p对于生长快的细菌（如谷氨酸），种子用量比较少，级数也较少，如谷氨酸生产为二级发酵。茄子瓶种子罐发酵罐二级发酵培养（一级种子罐扩大培养）p对于生长较慢的霉菌：如青霉菌，三级发酵。茄子瓶种子罐种子罐发酵罐三级发酵培养（二级种子罐扩大培养）p放线菌：生长
9、更慢，链霉素生产采用四级发酵。三级发酵培养过程三级发酵培养过程 p酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子生产。种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会；但种子级数太少，则接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会。确定种子罐级数需要注意的问题是：种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会；种子级数太少，则接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会。二、种子罐接种发酵生产中的接种包括两个方面：从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中接种至种子罐；种子罐之间的移种及从种子罐移入生产发酵罐中。摇瓶菌丝体可在火焰保护下接入种子罐或采用压差法接入。种子罐之间或发
10、酵罐间的移种方式，主要采用压差法，由接种管道进行移种，移种过程中要防止接入罐的表压降到零，否则会染菌。（一）火焰封口接种主要采用酒精火焰在接种口形成火圈保护而进行接种。先准备好酒精棉、钳子、镊子、接种环、石棉网手套、Z字扳手等用具。将酒精棉花围在接种环周围点燃，将菌种瓶口在火焰上烧一下，用Z字扳手拧开接种口，迅速将菌种倒入罐内，此时应向罐内通气，使接种口有空气排出。将接种口螺母在火焰上灭菌后拧紧，并用酒精棉将接种口擦洗干净。接种后，调节进气阀，达到工艺要求的通风量及罐压。（二）压差移种接种瓶上装有橡皮管，在火封下与罐的接种口相连接，要求瓶与橡皮管的连接不漏，橡皮管与接种口大小一致。接种时，开大
11、种子罐排气阀门，降低罐压同时拿掉接种叉，开大接种阀门，利用两者的压力差使种子进入种子罐内，完成接种。生产上种子罐培养的种子液通常采用压差法通过专门的移种管道移入发酵罐三、种子质量的控制三、种子质量的控制（一）影响孢子质量的因素及控制（一）影响孢子质量的因素及控制原材料质量波动四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同，对孢子影响也不同，如鱼胨或骨胨 培养基温度 湿度 培养条件 不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响相对湿度/%斜面外观活孢子计数/（亿/支）16.519
12、25364045上部稀薄，下部稠略黄上部薄，中部均匀发白一片白，孢子丰富，稍皱1.22.35.7相对湿度在40%45%时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。3.培养时间固体孢子的生长繁殖可划分为三个生理阶段：营养菌丝繁殖、气生菌丝繁殖、分生孢子繁殖。营养菌丝和气生菌丝属于繁殖体，而孢子本身是一个独立的遗传体，属于相对独立的生理阶段，内含完整的遗传物质，孢子用于传代和保存均能保持原始菌种的基本特征。一般以分生孢子进行传代和保存。一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子。4.冷藏时间 冷藏时间对孢子的生产能力也有影响，总的原则是易短不易长。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6冷藏2个月后的发酵单位比冷藏
13、1个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。5.接种量 孢子接种量大小影响种子罐液体培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。青霉素产生菌之一的球状菌孢子数量过少，进罐后长出的球状过大，影响通气效果；若孢子数量过多，则进罐后不能很好维持球状菌体。1.培养基 种子培养基要满足的要求是：营养成分适合种子培养的需要；选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高；营养成分要尽可能与发酵培养基相近。（二）影响种子质量的因素及控制（二）影响种子质量的因素及控制3.种龄 种子的培养时间称为种龄，即种子罐中培养的菌（丝）体开始移入下一级
14、种子罐或发酵罐时的培养时间。由于菌体在不同生长阶段其生理活性差别很大，种龄的控制就显得非常重要。2.培养条件温度通气量 培养过程中通气搅拌很重要，各级种子罐或者同级种子罐的不同时期的需氧量是不同的。一般前期需氧量较少，后期需氧量较多，应适当增大通气量。常见菌种种龄和培养温度常见菌种种龄和培养温度菌种培养温度/种龄/h细菌37724霉菌281650放线菌23372164酵母菌2530220通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期的中后期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。因为处于对数生长期的菌体接种有利于缩短发酵周期，对数生长期末菌体浓度相对较高，更有利于保持高的接种量。4.接种量 接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。接种量对碱性蛋白酶产生的影响无（杂菌）检查菌种稳定性的检查 控制每批生产斜面的使用时间 （三）种子质量的控制措施（三）种子质量的控制措施菌体形态 生化指标 通过测定种子液中糖、氮、磷的含量，以及pH变化来确定种子的质量 产物生成量酶活力 种子液中，某种酶的活力与目的产物的产量密切相关，因此，可以间接反映种子的质量（四）种子质量标准（四）种子质量标准