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1、发酵工艺项目五：无菌空气的制备电子课件项目五项目五 无菌空气的制备无菌空气的制备一、无菌空气一、无菌空气无菌空气是指自然界中的空气通过除菌处理后其含菌量降低到一个极限百分数的净化空气。从而能控制发酵污染至极小机会，此种空气称为“无菌空气”。一般按染菌机率为10-3来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许12次染菌。无菌空气的制备是指通过物理或者化学的方法除去或杀死空气中的微生物，使其达到发酵时无菌要求的过程。（一）无菌空气的概念（一）无菌空气的概念空气中常见的微生物种类有芽孢杆菌、变形杆菌、产气杆菌、酵母菌和病毒等 空气中常见的微生物种类及大小空气中常见的微生物种类及大小微生物宽/m长
2、/m产气杆菌1.01.51.02.5蜡状芽孢杆菌1.32.08.125.8普通变形杆菌0.51.01.03.0地衣芽孢杆菌0.50.61.83.3枯草芽孢杆菌0.51.11.64.8巨大芽孢杆菌0.92.12.010.0霉状分枝杆菌0.61.61.613.6金黄色小球菌0.51.0 酵母菌3.05.05.019.0病毒0.00150.2250.00150.28不同的发酵过程中，由于培养基的性质、微不同的发酵过程中，由于培养基的性质、微生物的生长繁殖能力、发酵周期及生物的生长繁殖能力、发酵周期及pH等的差等的差异，对无菌空气的要求也各不相同，所以对异，对无菌空气的要求也各不相同，所以对空气除菌的
3、要求应根据具体情况而定。空气除菌的要求应根据具体情况而定。一般来说，发酵周期短、一般来说，发酵周期短、pH较低的发酵工艺较低的发酵工艺对空气的无菌要求低，发酵周期长，微生物对空气的无菌要求低，发酵周期长，微生物的生长繁殖速度慢，对空气的无菌要求高一的生长繁殖速度慢，对空气的无菌要求高一些。些。（二）发酵对空气无菌程度的要求洁净度洁净度 发酵工业中所指的发酵工业中所指的“无菌空气无菌空气”是指通过除菌处理后压缩空气是指通过除菌处理后压缩空气中含菌量降低到零或达到洁净度中含菌量降低到零或达到洁净度100级的洁净空气，它已能满足级的洁净空气，它已能满足发酵工业的要求。发酵工业的要求。空气流量空气流量
4、 生产中要求连续提供一定流量的压缩空气。发酵用无菌空气的设生产中要求连续提供一定流量的压缩空气。发酵用无菌空气的设计和操作中空气用量用通气比。计和操作中空气用量用通气比。（三）无菌空气的质量标准（三）无菌空气的质量标准空气压强空气压强 一般要求空气压缩机出口的空气压强控制在一般要求空气压缩机出口的空气压强控制在0.20.35MPa（表压）（表压）温度温度 无菌空气的温度的要求对不同发酵工艺是不同的，应无菌空气的温度的要求对不同发酵工艺是不同的，应根据具体情况确定。一般控制进发酵罐压缩空气的温根据具体情况确定。一般控制进发酵罐压缩空气的温度比发酵温度高出度比发酵温度高出10左右。左右。相对湿度相
5、对湿度 气体的相对湿度对发酵的过程也有影响，相对湿度大，气体的相对湿度对发酵的过程也有影响，相对湿度大，容易导致杂菌繁殖容易导致杂菌繁殖（三）无菌空气的质量标准（三）无菌空气的质量标准辐射灭菌辐射灭菌加热灭菌加热灭菌静电除菌静电除菌过滤除菌过滤除菌二、空气除菌方法二、空气除菌方法射线、x射线、射线、射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物质，从而起到杀菌作用。应用比较广泛是紫外线，不过紫外线杀菌效率较低，杀菌时间较长，一般要结合甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程度。辐射灭菌通常用于无菌室和医院手术室的灭菌，无法用于发酵工业中无菌空气的制备。辐射辐射灭菌灭菌利用空气压缩机产生的
6、压缩热进行空气灭菌的流程。空气进口温度为21，出口温度为187198，压力为0.7MPa。压缩后的空气用管道或贮气罐保温一定时间以增加空气的受热时间，促使有机体死亡。加热灭菌加热灭菌静电除菌是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘、除菌的目的。原理是：悬浮于空气中的微生物，其孢子大多带有不同的电荷，未带电荷的微粒进入高压静电场(1000v/cm2)时会被电离成带电微粒，受静电场作用，向极板移动并吸附在极板上，得到净化的气体排出除尘器外。静电除菌静电除菌装置按其对菌体微粒的作用可分成电离区和捕集区静电除菌工作原理示意图静电除尘灭菌器示意图示静电除尘灭菌器结构图1-钢丝；2-钢管；3-高压绝缘瓷瓶；
7、4-钢板近年来，静电除菌在化工、冶金、发酵等工业生产中被广泛用于除去空气中的水雾、油雾、尘埃和微生物，对1m大小的微粒去除率达99。在发酵工业上，静电除菌主要应用于超净工作台和无菌室等所需无菌空气的第一次除尘，然后配合高效过滤器使用。过滤除菌是使气体通过经高温灭菌的介质过滤层，将气体中的微生物及颗粒物阻截在介质层中，而获得无菌空气的方法。通过过滤除菌处理的空气可达到无菌要求，并有足够的压力和适宜的温度以供好氧培养之用。按除菌机制不同，可分为绝对过滤和深层介质过滤。（四）过滤除菌1.绝对过滤利用微孔滤膜（空隙小于0.5m）作为过滤介质，当空气流过介质后，由于介质之间的空隙小于细菌的直径，可以将空
8、气中的细菌全部滤除。绝对过滤具有易于控制过滤后空气质量，节约时间和能耗，操作简便等优点。在空气过滤之前应设预过滤器将空气中的油、水除去，以提高微孔滤膜的过滤效率和使用寿命。深层介质过滤除菌是指介质间空隙大于微生物直径，依靠空气气流与过滤层介质的多种相互作用而截流分离微生物等微粒获得无菌空气的除菌方法。当空气流过介质过滤层时，借助于惯性碰撞、拦截、静电吸附、布郎扩散等作用，可以将空气中的杂质阻截，从而制备得到无菌空气。深层介质过滤除菌是目前发酵工业大量制备无菌空气经常采用的方法。深层介质过滤主要设备主要设备填充床过滤器棉花：纤维直径20m，间隙约，间隙约50m玻璃纤维活性炭超细玻璃纤维纸石棉滤板
9、深层过滤介质深层过滤介质烧结材料过滤介质烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料皱褶过滤膜介质醋酸纤维酯类、聚四氟乙烯、尼龙膜新型过滤介质深层过滤所用的过滤介质棉花的纤维直径一般为1620m，填充系数为8时，棉花纤维所形成的孔隙为2050m超细玻璃纤维滤板因纤维直径很小，为11.5m，湿法抄制紧密度较大，所形成的网格孔隙为0.55m。惯性冲击作用惯性冲击作用拦截作用拦截作用布朗扩散作用布朗扩散作用重力沉降作用重力沉降作用静电吸附作用静电吸附作用 三、过滤除菌机理过滤器中的滤层交错着无数纤维，好像层层网格。以棉花纤维为例，当带有微生物的空气通过滤层时，无论顺纤维方向还是垂直于纤维方向流动，仅能从纤维的间隙通
10、过。当气流为层流时，气体中的微粒随空气做平行运动，接近纤维表面的微粒(指在空气流宽度内的微粒)被纤维捕获，而大于气流宽度的气流中的微粒绕过纤维继续前进当过滤介质层中无数纤维交错形成的网格阻碍气流前进时，气流就会不断改变运动速度和方向，这些改变引起空气中微粒的惯性冲击、拦截、扩散、重力沉降和静电吸附等作用，大大增加了微粒被纤维捕获的几率单纤维介质过滤除菌时各种除菌机理示意图g-气流速度；dp-微粒直径；df-纤维直径微粒随气流以一定速度垂直向纤维方向运动时，因纤维的阻挡，空气流突然改变方向，而微粒由于惯性作用仍然沿直线向前运动，与纤维碰撞而被吸附于纤维的表面上，称为惯性冲击作用。当微粒质量较大或
11、速度较大时，由于惯性冲击在纤维表面而沉积下来。当空气流速增至足够大时，惯性捕集则起主导作用。惯性冲击作用惯性冲击作用惯性冲击作用是空气过滤器除菌的重要作用，其大小取决于颗粒的动能和纤维的阻力，也就是取决于气流的流速。惯性力与气流流速成正比，当流速过低时，惯性捕集作用很小，甚至接近于零；当空气流速增至足够大时，惯性捕集则起主导作用。气流速度降低到惯性捕集作用接近于零时，此时的气流速度为临界速度。气流速度在临界速度以下时，微粒不能因惯性滞留于纤维上，捕集效率显著下降。但实践证明，随着气流速度的继续下降，纤维对微粒的捕集效率又回升，说明有另一种机理在起作用，这就是拦截作用。拦截作用拦截作用微生物微粒
12、直径很小，质量很轻，它随低速气微生物微粒直径很小，质量很轻，它随低速气流流动慢慢靠近纤维时，微粒所在的主导气流流动慢慢靠近纤维时，微粒所在的主导气流流线受纤维所阻，从而改变流动方向，绕流流线受纤维所阻，从而改变流动方向，绕过纤维前进，而在纤维的周边形成一层边界过纤维前进，而在纤维的周边形成一层边界滞流区。滞流区。滞流区的气流速度更慢，进到滞流区的微粒慢滞流区的气流速度更慢，进到滞流区的微粒慢惕靠近和接触纤维而被粘附滞留，称为拦截惕靠近和接触纤维而被粘附滞留，称为拦截作用。作用。直径很小的微粒在很慢的气流中能产生一种不规则的运动，称为布朗扩散。扩散运动的距离很短，在较大的气流速度和较大热纤维间隙
13、中是不起作用的，但在很慢的气流速度和较小的纤维间隙中，扩散作用大大增加了微粒与纤维的接触机会，从而被捕集。扩散作用扩散作用微粒虽小，但仍具有重力。当微粒重力超过空气作用于其上的浮力时，即发生一种沉降加速度。当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就发生沉降现象。就单一重力沉降而言，大颗粒比小颗粒作用显著，一般50m以上的颗粒沉降作用才显著。对于小颗粒只有气流速度很慢时才起作用。重力沉降作用一般是与拦截作用相配合，即在纤维的边界滞留区内。微粒的沉降作用提高了拦截捕集作用。重力沉降作用重力沉降作用悬浮在空气中的微生物大多带有不同电荷或由于摩擦作用使非导体介质具有一定电荷。当微生物和其它微粒与介
14、质电荷相反时，这些微粒就会通过静电吸附作用被介质截流捕获。此外，表面吸附也属这个范畴，如活性炭的大部分过滤效能应是表面吸附作用。静电吸附作用静电吸附作用总的来说，当气流速度较大时(约大于0.1m/s)，惯性捕集是主要的。而流速较小时，扩散作用占优势。前者的除菌效率随气流速度增加而增加，后者则相反。可能是拦截作用占优势。单元技能一单元技能一过滤器及过滤除菌过滤器及过滤除菌微孔滤膜过滤器蔡氏过滤器玻璃过滤器常见的过滤器组装、灭菌组装、灭菌p将0.22m孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌后待用（0.1Mpa，121.5，灭菌20min）。连接连接p将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以
15、无菌操作方式连接于装有待滤溶液的注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。微孔滤膜过滤器过滤除菌压滤压滤p将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拔出。p压滤时用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。无菌检查无菌检查p无菌操作吸取除菌滤液0.1mL于肉汤蛋白胨平板上，均匀涂布，置37恒温培养箱培养24h，检查是否有杂菌生长。清洗清洗p弃去塑料滤器上的微孔滤膜，将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜，组装包扎，再经灭菌后使用。四、无菌空气制备的一般工艺流程供给发酵用的无菌空气，需要克服介质阻力、发酵供给发酵用的无菌空气，需要克服介质阻力、发酵液静
16、压力和管道阻力，故一般使用液静压力和管道阻力，故一般使用空压机空压机。从大气中吸入的空气常带有灰尘、沙土、细菌等；从大气中吸入的空气常带有灰尘、沙土、细菌等；在压缩过程中，又会污染润滑油或管道中的铁锈等在压缩过程中，又会污染润滑油或管道中的铁锈等杂质，在空气进入发酵罐前，必须先行冷却。杂质，在空气进入发酵罐前，必须先行冷却。而冷却出来的油、水，又必须及时排出，严防带入而冷却出来的油、水，又必须及时排出，严防带入空气过滤器中，否则会使过滤介质空气过滤器中，否则会使过滤介质(如棉花等如棉花等)受潮，受潮，失去除菌性能，空气在进入空气过滤器前，要先经失去除菌性能，空气在进入空气过滤器前，要先经除尘、
17、除油、除水除尘、除油、除水，再经空气过滤器除菌，制备净，再经空气过滤器除菌，制备净化空气送入发酵罐，供菌体生长与代谢的需要。化空气送入发酵罐，供菌体生长与代谢的需要。两级冷却、分离、加热空气除菌流程两级冷却、分离、加热空气除菌流程1空气粗过滤器2空压机3储气罐4一级空气冷却器5旋风分离器6二级空气冷却器7丝网除沫器8加热气9总空气过滤器空空气气过过滤滤除除菌菌一一般般是是把把吸吸气气口口吸吸入入的的空空气气先先进进行行压压缩缩前前过过滤滤，然然后后进进入入空空气气压压缩缩机机。从从空空气气压压缩缩机机出出来来的的空空气气(一一般般压压力力在在0 0.2 2MMP Pa a以以上上，温温度度1
18、12 20 0 1 16 60 0)，先先冷冷却却至至适适当当温温度度(2 20 0 2 25 5)除除去去油油和和水水，再再加加热热至至3 30 0 3 35 5 ，在整个工艺过程中，各种设备系围绕两个目的：一是提高压缩前空气的质量(洁净度)；另一个是去除压缩空气中所带的油和水。目的目的方法:可采用前置高效过滤空气除菌流程。其大致流程如下高效过滤器空气压缩机储罐冷却器丝网分离器加热器过滤器主要措施是提高空气吸气口的位置和加强吸入空气的压缩前过滤空气吸气口、粗过滤器提高压缩前空气的质量粗过滤器吸入的空气在进入压缩机前先通过粗过滤器过滤，可以减少进入空气压缩机的灰尘和微生物，减少往复式空气压缩机
19、活塞和气缸的磨损，减轻介质过滤除菌的负荷。常用的粗过滤器有油浸铁丝网、泊浸铁环和泡沫塑料等。从空气压缩机出来的空气，温度120(往复式压缩机)或150(涡轮式压缩机)，其相对湿度大大降低。在此高温下就进入空气过滤器过滤，可以减少压缩空气中夹带的水分，使过滤介质不致受潮，但是一般的过滤介质耐受不了这样高的温度。去除压缩空气中所带的油和水经压缩冷却后的湿空气一般要析出过饱和的水分，另外还有从压缩机中带出的油雾杂质，如将之直接通入过滤器，空气中含有的油及水滴将污染过滤器中的介质。使过滤器很快失效或影响过滤效率。所以压缩空气在进入过滤器之前，必须进行减湿除油处理。即要有一系列冷却、分离、加热的设备来保
20、证空气的相对湿度在5060的条件下过滤。空气压缩机的作用是提供动力，以克服后续各设备的阻力。目前，国内常用的空气压缩机有往复式、离心式和螺杆式空气压缩机。目前往复式和离心式空气压缩机的使用较为广泛。往复式压缩机工作示意图一级空气冷却器用30左右的水，把从压缩机出来的120或150的空气冷却到4050左右。去除油、水的工艺过程所需设备二级空气冷却器二级空气冷却器用9冷冻水或1518地下水，把4050的空气冷却到2025。冷却后的空气，其相对湿度提高到100%，由于温度处于露点以下，其中的油、水即凝结为油滴和水滴。空气贮罐不但可以消除空气压缩机的脉动，还可以通过保温提高灭菌效率、沉淀油滴和水滴空气贮罐示意图用以分离50m以上的液滴及部分较小的液滴。旋风分离器丝网除沫器用以分离5m以上的液滴。使用丝网除沫器需控制好空气的流速，并不断去掉凝结下来的油水。在空气压力为0.2Mpa（表压）的情况下，最佳的空气流速应为12ms(空床速度)，在此操作条件下可以去掉较小的雾滴。