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1、发酵工艺 项目十：固定化技术电子课件项目十项目十 固定化技术固定化技术一、细胞固定化技术概述一、细胞固定化技术概述l（一）固定化技术的发展l将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。l固定化细胞就是被限制或定位于特定空间位置而不能自由移动的细胞，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。l固定化细胞主要是利用细胞内酶和酶系，比固定化酶应用普遍。l现代固定化技术不仅包括固定化酶，还包括固定化细胞器、细胞甚至活菌体。l20世纪50年代，开始了酶固定化研究。l60年代，是固定化酶技术迅速发展的时期。l70年代，在固定化酶的基础上，研制成固定化细胞，并且用于生产。l80年代，又
2、发展了固定化原生质体技术，排除了细胞壁这一障碍。（二）固定化细胞的分类（二）固定化细胞的分类固定化增殖细胞又称固定化生长细胞，是指固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围进行生命活动的细胞，细胞固定化后仍能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢。(三）固定化细胞的依据三）固定化细胞的依据l从广义上讲，微生物细胞所具酶系统相当于被一层层具有选择透性的胞膜或质膜所包埋，这些酶本身已经是固定化酶。l既然固定化细胞本身已经是一种固定化酶，如果设法除去细胞所特有的对细胞起自溶作用的酶系统，并防止外来细胞对它的侵袭，就能使此细胞反复利用。l微生物细胞具有维持其生命活动的完整的酶系统，各酶又严格地处于各亚细胞器上，酶
3、促反应有着严格的顺序性，在制备固定化菌体细胞的过程中应尽可能完整地保持细胞的这种特定状态。（四）固定化细胞的特点（四）固定化细胞的特点l无需进行酶的分离纯化；无需进行酶的分离纯化；l细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高；回收率高；l细胞内酶比固定化酶的稳定性高；细胞内酶比固定化酶的稳定性高；l细胞内酶的辅因子可以自动再生；细胞内酶的辅因子可以自动再生；l细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应；细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应；l抗污染能力强。抗污染能力强。二、固定化微生物细胞的制备方法二、固定化微生物细胞的制备方法l固定化微生物细胞和固定化酶的
4、方法都是以酶的应用为目的，其制备方法也基本相同。l传统分类主要有吸附法、包埋法、共价结合法、交联法四大类，另外还有热处理法、无载体法等。l其中用于固定化增殖细胞的方法主要有吸附法和包埋法两大类。（一）吸附法（一）吸附法l吸附法是利用载体对细胞的亲和性或通过静电吸引将细胞直接吸附在水不溶性载体上的一种固定化方法，又叫载体结合法。（一）吸附法（一）吸附法l又叫载体结合法又叫载体结合法l利用载体对细胞的亲和性或通过静电吸引将细胞直接吸附在水不溶性载体上的一种固定化方法。l分为物理吸附和离子结合两种。l该法操作简单，固定化过程对细胞活性影响小。缺点：吸附容量小结合强度低。l供吸附细胞用的载体都是多孔性
5、物质，主要有：高岭土、硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、多孔陶瓷、多孔硅、阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯等。物理吸附法示意图（a）物理吸附；（b）离子交换吸附（a）（b）（二）包埋法（二）包埋法l将细胞定位于凝胶网格内或聚合物半透膜胶囊中的技术称为包埋法l包埋法是细胞固定化最常用的方法。可以分为凝胶包埋法和微胶囊法。l原理是将微生物细胞截流在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中。通过聚合作用或者离子网络形成，或通过沉淀作用，或改变溶剂、温度、pH值使细胞截流。凝胶聚合物的网络可以阻止细胞的泄漏，同时能让基质渗入和产物扩散出来。l（1）凝胶包埋法）凝胶包埋法 是在无菌条件下，将生物细胞
6、和胶溶液是在无菌条件下，将生物细胞和胶溶液混合在一起，然后再经过相应的造粒处理，形成直径为混合在一起，然后再经过相应的造粒处理，形成直径为14mm的胶粒。的胶粒。l（2）微胶囊法：利用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，）微胶囊法：利用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊。形成微型胶囊。包埋法示意图（a）凝胶包埋；（b）微胶囊包埋（a）（b）l以海藻酸盐为载体，建立包埋固定化微生物的方法是：l先将海藻酸钠溶于水，加热杀菌冷却，然后将海藻酸钠溶液与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀，使海藻酸钠最终浓度为2%3%，再将海藻酸钠与菌体混合液用注射器或滴管滴入5%的氯化钙溶液中，固定化78h，形成
7、球状固定化细胞胶粒，最后滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。海藻酸钙凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法l海藻酸钙凝胶固定化细胞一般用“钙盐法”生产l其原理通常是利用海藻酸钠溶于水，而其钙盐不溶于水，易形成耐热性凝胶的特性,在其钠盐溶液中加入氯化钙作为凝胶成型剂，使Ca2+与海藻酸根螯合形成不溶于水的海藻酸钙凝胶网络,从而将微生物细胞包埋固定 滴落法制备固定化细胞海藻酸钙网络形成模型（三）共价结合法（三）共价结合法l共价结合法共价结合法l利用细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基）与活化的无机或有机载体反应，形成共价键将细胞固定。用该法制备的固定化细胞一般为死细胞。l该法操作稳定性高，但由于
8、试剂的毒性，易引起细胞的破坏。（四）交联法（四）交联法l利用双功能或多功能试剂与细胞表面的反应基团（如氨基、利用双功能或多功能试剂与细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基）反应，使细胞彼此交联，形羧基、羟基、巯基、咪唑基）反应，使细胞彼此交联，形成网状结构，即成固定化细胞。成网状结构，即成固定化细胞。l常用的交联剂包括：戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双重氮联常用的交联剂包括：戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双重氮联苯胺。由于交联试剂的毒性，这一方法具有一定的局限性。苯胺。由于交联试剂的毒性，这一方法具有一定的局限性。该法可得到高细胞浓度，但机械强度低，无法再生，不适该法可得到高细胞浓度，但机械
9、强度低，无法再生，不适于实际应用。于实际应用。（五）热处理法（五）热处理法 l将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而得到固定化菌体。l将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在6065的温度下处理15min，葡萄糖异构酶将全部固定在菌体内。l只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。l可与交联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。（六）絮凝法（六）絮凝法l是利用某些微生物细胞具有自絮凝形成颗粒的能力而对细胞进行固定化的方法，又称无载体法，或自固定化法。l絮凝作用首先在酵母培养过程中观察到的，后被证实其现象是由于悬浮在
10、液体中的单细胞聚集成絮凝物或丝状物，然后出现沉淀或漂浮的结果 絮凝颗粒示意图三、固定化细胞的性质三、固定化细胞的性质l酶活力的稳定性增加。含天冬氨酸的大肠杆菌经醋酸纤维酶活力的稳定性增加。含天冬氨酸的大肠杆菌经醋酸纤维包埋后，用于生产包埋后，用于生产L-天冬氨酸，在天冬氨酸，在37运转两年后，仍保运转两年后，仍保持原活力的持原活力的97%。l 酶促效率明显提高。和固定化酶不同，菌体在固定化过程酶促效率明显提高。和固定化酶不同，菌体在固定化过程中通常不损伤细胞本身，细胞生长停滞时间短，细胞多，中通常不损伤细胞本身，细胞生长停滞时间短，细胞多，细胞内的酶系统也最大限度地保持着天然状态。细胞内的酶系
11、统也最大限度地保持着天然状态。l 具有多步酶反应的特点。可进行多酶反应，且不需添加辅具有多步酶反应的特点。可进行多酶反应，且不需添加辅助因子，固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而助因子，固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用菌体中所含的复合酶系完成一系列的催化反应，且可以利用菌体中所含的复合酶系完成一系列的催化反应，对于这种多酶系统，辅助因子再生容易；对于这种多酶系统，辅助因子再生容易；l 细胞透性和热稳定性增加。固定化细胞质膜的透性较天然细胞透性和热稳定性增加。固定化细胞质膜的透性较天然细胞增强；对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的细胞增强；对于活细胞来说，保持了酶的
12、原始状态，酶的稳定性通常也比天然细胞提高，对污染的抵抗力更强。稳定性通常也比天然细胞提高，对污染的抵抗力更强。l可连续使用可连续使用l pH。细胞经固定化后，其最适。细胞经固定化后，其最适pH因固定化方法不同而有因固定化方法不同而有一些调整。如，用聚丙烯酰胺包细胞经固定化后，其最适一些调整。如，用聚丙烯酰胺包细胞经固定化后，其最适pH因固定化方法不同而有一些调整。如，用聚丙烯酰胺包因固定化方法不同而有一些调整。如，用聚丙烯酰胺包埋的大肠杆菌中的天门冬氨酸酶和产氨短杆菌中的延胡索埋的大肠杆菌中的天门冬氨酸酶和产氨短杆菌中的延胡索酸酶的最适酸酶的最适pH向酸性范围偏移。但用同一方法包埋的大肠向酸性
13、范围偏移。但用同一方法包埋的大肠杆菌中的青霉素酰胺酶的最适杆菌中的青霉素酰胺酶的最适pH则没有变动。则没有变动。四、固定化细胞的优缺点四、固定化细胞的优缺点l固定化细胞具有以下优点：免去了破碎细胞提取酶的手续；固定化细胞具有以下优点：免去了破碎细胞提取酶的手续；酶在细胞内的稳定性较高，完整细胞固定化后酶活性损失酶在细胞内的稳定性较高，完整细胞固定化后酶活性损失少；固定化细胞制备的成本比固定化酶低；无需辅酶再生。少；固定化细胞制备的成本比固定化酶低；无需辅酶再生。l 虽然固定化细胞具有上述许多优点，但也有不足之处，具虽然固定化细胞具有上述许多优点，但也有不足之处，具体表现在：仅能利用胞内酶；必须
14、保持菌体的完整，需防体表现在：仅能利用胞内酶；必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；必须抑制细胞内蛋止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；胞内多酶的存在，会形成副产物；白酶对目的酶的分解；胞内多酶的存在，会形成副产物；载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。五、固定化细胞发酵工艺控制五、固定化细胞发酵工艺控制l（一）固定化细胞的预培养（一）固定化细胞的预培养l固定化细胞制备好后，一般要进行预培养，以利固定化细胞制备好后，一般要进行预培养，以利于固定在载体上的细胞生长繁殖，然后才用于发
15、于固定在载体上的细胞生长繁殖，然后才用于发酵生产。因此，预培养的目的就是获得活力较强酵生产。因此，预培养的目的就是获得活力较强的微生物细胞。的微生物细胞。l通常细胞的固定化生长主要有四种形式通常细胞的固定化生长主要有四种形式:包埋包埋在多孔物质中的生长；在多孔物质中的生长；附着在悬浮固体载体表附着在悬浮固体载体表面的生长；面的生长；附着在固定填料上的生长；附着在固定填料上的生长；菌体菌体絮凝成团生长。絮凝成团生长。l（二）溶氧的供给（二）溶氧的供给l溶氧的供给是固定化细胞好气性发酵的关键限制性因素之一。l固定化细胞在进行培养过程中，由于受到载体的影响，氧的溶解和传递受到一定的阻碍作用。l特别是
16、采用包埋法制备的固定化细胞，氧要通过凝胶层扩散到凝胶粒内部，才能供细胞应用，使氧的供给成为主要的限制性因素。l（三）温度的控制（三）温度的控制l固定化细胞对温度的适应范围较广，在分批发酵和半连续发酵中，温度不难控制。但在连续发酵过程中，由于稀释率较高，反应器内温度变化较大。l若只是在反应器内调节温度，则在流加的培养液温度差别较大时，难以达到要求。一般在培养液进入反应器之前，必须预先调节到适宜温度。l实验结果表明，固定化增殖酵母细胞发酵生产酒精的最适温度一般为3034，但不同菌种最适发酵温度往往是不同的，这需要通过实验进行确定。l（四）培养基成分的控制（四）培养基成分的控制l一些研究结果表明，固
17、定化增殖酵母细胞能适应较高糖浓度发酵液，其酒精生产能力可以远比游离细胞高l不过，一般培养基的浓度不宜过高，否则有可能出现底物的抑制作用。l 不同底物浓度对细胞生产酒精能力的影响不同底物浓度对细胞生产酒精能力的影响糖蜜浓度（总糖分）/%酒精生产能力/g/(Lh)固定化细胞游离细胞1013.410.11720.216.52424.014.13119.35.8六、固定化细胞反应器六、固定化细胞反应器（一）填充床反应器（一）填充床反应器l 填充床反应器，又称固定床反应器。将固定化细胞填充于填充床反应器，又称固定床反应器。将固定化细胞填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一反应器内，制成
18、稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集含定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集含产物的转化液产物的转化液l该反应器适用于各种形状的固定化细胞、黏度不大的底物该反应器适用于各种形状的固定化细胞、黏度不大的底物溶液以及有产物抑制的转化反应，是目前在固定化酶和细溶液以及有产物抑制的转化反应，是目前在固定化酶和细胞技术中使用最普遍、应用也最广泛的一种反应器，被广胞技术中使用最普遍、应用也最广泛的一种反应器，被广泛用于工业化生产。泛用于工业化生产。（二）流化床反应器（二）流化床反应器l 流化床反应器是利用底物溶液以足够大的流速，从反应器流化床反应器
19、是利用底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化细胞柱床时，便能使固定化细胞颗粒底部向上通过固定化细胞柱床时，便能使固定化细胞颗粒始终处于流化状态始终处于流化状态l该反应器具有固液混合好的优点，有利于固定化细胞的增该反应器具有固液混合好的优点，有利于固定化细胞的增殖，从而得到相对稳定的细胞数量。殖，从而得到相对稳定的细胞数量。l适用于底物是黏性或颗粒性物质，或反应需供气、排气的适用于底物是黏性或颗粒性物质，或反应需供气、排气的情况。由于底物流动速度较大，流化床反应器不适用于需情况。由于底物流动速度较大，流化床反应器不适用于需停留时间长的反应。停留时间长的反应。（三）间歇式搅拌反应器（三
20、）间歇式搅拌反应器 l 又称批量反应器（又称批量反应器（Batch Reactor，BSTR）、间歇式搅）、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。其特点是底物与酶一次性投入反应拌罐、搅拌式反应罐。其特点是底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。l优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到稳态。缺点是：操作麻烦，固定化菌体经反复很迅速达到稳态。缺点是：操作麻烦，固定化菌体经反
21、复回收使用时，易失去酶活性。回收使用时，易失去酶活性。（四）连续式搅拌反应器（四）连续式搅拌反应器l向反应器投入固定化菌体和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。l反应桶内装有搅拌器，使反应组分与固定化细胞颗粒混合均一，出口处有过滤膜，可使不断补充新鲜底物与反应液流量维持动态平衡。l优点是：在理想状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化菌体颗粒。（五）中空纤维反应器（五）中空纤维反应器l用具有半透性的空心纤维填充的反应器，空心纤维在反应器中提供很大的催化剂表面积。这种空心纤维只能让反应物和产物通过，而不让完整细胞通过。l空心纤维在反应器系统中可按不同方式排列，可以将完整细胞包埋在纤维束的外壳上，而使底物在纤维中通过，底物通过中空纤维壁扩散到细胞中去，而产物又扩散到中空纤维中来；相反，细胞可以固定在纤维中，而底物在中空纤维外通过。谢谢！