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1、组织培养细胞染色体的制备组织培养细胞染色体的制备实验五实验五n实验目的实验目的n实验原理实验原理n实验试剂与仪器实验试剂与仪器n实验步骤实验步骤n注意事项注意事项n了解组织细胞的培养方法。了解组织细胞的培养方法。n掌握染色体标本的制备方法。掌握染色体标本的制备方法。一、实验目的一、实验目的 二、实验原理二、实验原理 二、实验原理二、实验原理 n处处于于指指数数生生长长期期的的细细胞胞，经经过过短短期期培培养养后后，用用秋秋水水仙仙素素处处理理，可可把把细细胞胞分分裂裂阻阻截截在在中中期期，再再经经过过低低渗渗、固固定定、滴滴片片和和染染色色，就就可可获获得得大大量量中中期期分分裂裂相相的的细细
2、胞胞，制制片片后后可可以清楚地对染色体进行观察。以清楚地对染色体进行观察。n材材料料：具具有有很很强强生生长长分分裂裂能能力力的的细细胞胞系系（Hela细细胞胞、白血病白血病K562细胞、细胞、C2C12，BHK细胞等）细胞等）n仪器：仪器：恒温培养箱、离心机、显微镜恒温培养箱、离心机、显微镜 培养瓶、移液管、载玻片培养瓶、移液管、载玻片n试试剂剂：培培养养液液（RPMI1640、M199、DMEM等等）、胎胎牛牛血血清清、双双抗抗、NaHCO3、生生理理盐盐水水、肝肝素素、1.0g/L秋秋水水仙仙素素溶溶液液（0.1%）、低低渗渗液液（0.075M/L KCl）、固定液）、固定液(甲醇：冰醋
3、酸甲醇：冰醋酸=3：1)、Giemsa染液染液三、实验试剂及仪器三、实验试剂及仪器 1.秋水仙素秋水仙素 阻止微管组装，破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂。阻止微管组装，破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂。使染色体收缩成一定的形状。使染色体收缩成一定的形状。目的目的:获得大量的中期分裂相细胞。获得大量的中期分裂相细胞。2.Carnoy固定液固定液 新配置的甲醇新配置的甲醇：冰醋酸混合液：冰醋酸混合液(3:1)。能能迅迅速速穿穿透透细细胞胞，将将其其固固定定并并维维持持染染色色体体结结构构的的完完整整性性，还还能能够够增增强强染染色色体体的的嗜嗜碱碱性性，达达到到优优良良染色效果染色效果 3.低渗液（低渗液（0
4、.075M/L KCl）低渗的目的是低渗的目的是凭借反渗透作用使细胞膨胀（但不凭借反渗透作用使细胞膨胀（但不破裂）染色体铺展，同时可使粘附于染色体的破裂）染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态染色体形态 4.染料染料（Giemsa）不不是是一一种种单单一一染染料料，而而是是天天青青、伊伊红红、甘甘油油和和甲醇的混合物，配制后原液储存，甲醇的混合物，配制后原液储存，染色后，染色质呈红色，细胞核是蓝色。染色后，染色质呈红色，细胞核是蓝色。四、实验步骤四、实验步骤 培养液培养液4ml胎牛血清胎牛血清1ml培养培养2
5、4小时小时每每ml培养液培养液加加1ug继续培养继续培养3-5小时小时培养培养秋水仙素秋水仙素培养瓶培养瓶取样取样 取取1ml培养液于培养液于10ml离心管离心管1.1000rpm离心离心5分钟分钟弃上清弃上清离心离心2.加加KCl 8ml混匀混匀37处理处理20分钟分钟低渗低渗3.预固定预固定固定固定加加3-4滴固定液，滴固定液，轻轻吹打后，离轻轻吹打后，离心去上清心去上清二次固定二次固定4.5.6.加加3ml固定液，固定液，2min后轻轻吹后轻轻吹打后，固定打后，固定10min,离心去离心去上清上清加加3ml固定液，轻固定液，轻轻吹打后，固定轻吹打后，固定10min后，离心去后，离心去上清
6、上清三次固定三次固定（同（同6）制片制片预冷冰片预冷冰片距离距离20cm以上以上玻片倾斜玻片倾斜30迅速吹气迅速吹气过火焰过火焰3-5次次7.8.9.空空 气干燥气干燥Giemsa染色染色10min细水流冲洗细水流冲洗染色染色10.11.12.吹干吹干镜检镜检13.14.1 1）秋秋水水仙仙素素处处理理时时间间要要把把握握好好，时时间间过过长长，分分裂裂细细胞胞多多，染色体短小；反之，则少而细长染色体短小；反之，则少而细长2 2）低低渗渗之之后后，要要细细心心、温温柔柔混混匀匀细细胞胞，防防止止细细胞胞膜膜破破裂裂、染色体散失；染色体散失；3)3)离离心心前前配配平平，离离心心速速度度过过高高
7、，细细胞胞团团不不易易打打散散；反反之之，细胞易丢失；细胞易丢失；4)4)载玻片要洁净，预冷；滴片时确定将材料滴在玻片上；载玻片要洁净，预冷；滴片时确定将材料滴在玻片上；五、注意事项五、注意事项 实验步骤实验步骤1.秋水仙素预处理秋水仙素预处理:收集生长旺盛的细胞收集生长旺盛的细胞1ml，轻轻吹，轻轻吹打散，加入秋水仙素打散，加入秋水仙素1ul，继续培养，继续培养6-8小时（小时（已完成已完成）；2.预处理后的细胞，以预处理后的细胞，以1000rpm离心离心5min，去上清；，去上清；3.低渗处理低渗处理：加入：加入1ml低渗液，轻轻吹打，使细胞重悬，低渗液，轻轻吹打，使细胞重悬，然后补加然后
8、补加7ml低渗液，室温下静置低渗液，室温下静置20min4.预固定：预固定：加入加入3-4滴固定液后，轻轻混匀，避免粘滴固定液后，轻轻混匀，避免粘连，连，1000rpm离心离心5min，去上清；，去上清；5.固定：固定：沿管壁慢慢加入沿管壁慢慢加入3ml固定液，固定液，2min后用吸后用吸管轻轻吹打，使细胞分散，固定管轻轻吹打，使细胞分散，固定10min后，后，1000rpm离心离心5min，去上清；，去上清；6.二次固定：二次固定：加加3ml固定液，吹打均匀，固定固定液，吹打均匀，固定10min后，后，1000rpm离心离心5min，去上清；，去上清；7.三次固定：三次固定：重复第重复第6步
9、；步；8.制悬液：制悬液：去上清后剩去上清后剩0.5ml固定液，用吸管轻轻吹固定液，用吸管轻轻吹打使其成为细胞悬液；打使其成为细胞悬液；9.滴片：滴片：将冰冷的载玻片倾斜将冰冷的载玻片倾斜30，吸取细胞悬液，吸取细胞悬液距离载玻片至少距离载玻片至少1m滴于载玻片上，吹散，空气干滴于载玻片上，吹散，空气干燥；燥；10.染色：染色：在干燥的载玻片上滴在干燥的载玻片上滴Giemsa，染色，染色10min，细水冲洗后，空气干燥；，细水冲洗后，空气干燥；11.镜检：镜检：在低倍镜下寻找染色体分散良好、染色在低倍镜下寻找染色体分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。适中的分裂相，油镜下观察
10、染色体形态并计数。小鼠中期小鼠中期细细胞染色体胞染色体（2N=40）小鼠染色体核型分析小鼠染色体核型分析人类慢性骨髓性白血病（chronic myelogenous leukemia）Chr9和Chr22相互易位 使得Chr9上的c-abl oncogene和Chr22上的bcr gene相连，形成融合基因。其产物是一个融合蛋白 这个融合蛋白使细胞不受细胞周期的控制，导致白血病。只要一个细胞带有这种易位Chr，就会致病。猫叫综合征（猫叫综合征（Cat cry syndrome）临床表现：喉部发育不良，哭声似猫叫身体与智能发育不全，小头畸形，满月形脸，眼距宽，低耳位，高鼻梁在婴儿期或幼儿期夭折病因：5号染色体短臂缺失，5p-综合征