实验五 细胞染色体制备.pptx

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1、n实验目的实验目的n实验原理实验原理n实验试剂与仪器实验试剂与仪器n实验步骤实验步骤n注意事项注意事项第1页/共22页n了解组织细胞的培养方法。n掌握染色体标本的制备方法。一、实验目的 第2页/共22页二、实验原理 第3页/共22页二、实验原理 n处于指数生长期的细胞,经过短期培养后,用秋水仙素处理,可把细胞分裂阻截在中期,再经过低渗、固定、滴片和染色,就可获得大量中期分裂相的细胞,制片后可以清楚地对染色体进行观察。第4页/共22页n材料:具有很强生长分裂能力的细胞系(Hela细胞、白血病K562细胞、C2C12,BHK细胞等)n仪器:恒温培养箱、离心机、显微镜 培养瓶、移液管、载玻片n试剂:

2、培养液(RPMI1640、M199、DMEM等)、胎牛血清、双抗、NaHCO3、生理盐水、肝素、1.0g/L秋 水 仙 素 溶 液(0.1%)、低 渗 液(0.075M/L KCl)、固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)、Giemsa染液三、实验试剂及仪器 第5页/共22页1.秋水仙素 阻止微管组装,破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂。使染色体收缩成一定的形状。目的:获得大量的中期分裂相细胞。2.Carnoy固定液 新配置的甲醇:冰醋酸混合液(3:1)。能迅速穿透细胞,将其固定并维持染色体结构的完整性,还能够增强染色体的嗜碱性,达到优良染色效果 第6页/共22页3.低渗液(0.075M/L KCl)低渗的目

3、的是凭借反渗透作用使细胞膨胀(但不破裂)染色体铺展,同时可使粘附于染色体的核仁物质散开,以便能在一个平面上观察所有染色体形态 4.染料(Giemsa)不是一种单一染料,而是天青、伊红、甘油和甲醇的混合物,配制后原液储存,染色后,染色质呈红色,细胞核是蓝色。第7页/共22页四、实验步骤 培养液培养液4ml胎牛血清胎牛血清1ml培养培养24小时小时每每ml培养液培养液加加1ug继续培养继续培养3-5小时小时培养培养秋水仙素秋水仙素培养瓶培养瓶第8页/共22页取样取样 取取1ml培养液于培养液于10ml离心管离心管1.1000rpm离心离心5分钟分钟弃上清弃上清离心离心2.加加KCl 8ml混匀混匀

4、37处理处理20分钟分钟低渗低渗3.第9页/共22页预固定预固定固定固定加加3-4滴固定液,滴固定液,轻轻吹打后,离轻轻吹打后,离心去上清心去上清二次固定二次固定4.5.6.加加3ml固定液,固定液,2min后轻轻吹后轻轻吹打后,固定打后,固定10min,离心去离心去上清上清加加3ml固定液,轻固定液,轻轻吹打后,固定轻吹打后,固定10min后,离心去后,离心去上清上清第10页/共22页三次固定三次固定(同(同6)制片制片预冷冰片预冷冰片距离距离20cm以上以上玻片倾斜玻片倾斜30迅速吹气迅速吹气过火焰过火焰3-5次次7.8.9.第11页/共22页空空 气干燥气干燥Giemsa染色染色10mi

5、n细水流冲洗细水流冲洗染色染色10.11.12.第12页/共22页吹干吹干镜检镜检13.14.第13页/共22页1 1)秋水仙素处理时间要把握好,时间过长,分裂细胞多,染色体短小;反之,则少而细长2 2)低渗之后,要细心、温柔混匀细胞,防止细胞膜破裂、染色体散失;3)3)离心前配平,离心速度过高,细胞团不易打散;反之,细胞易丢失;4)4)载玻片要洁净,预冷;滴片时确定将材料滴在玻片上;五、注意事项 第14页/共22页实验步骤1.秋水仙素预处理:收集生长旺盛的细胞1ml,轻轻吹打散,加入秋水仙素1ul,继续培养6-8小时(已完成);2.预处理后的细胞,以1000rpm离心5min,去上清;3.低

6、渗处理:加入1ml低渗液,轻轻吹打,使细胞重悬,然后补加7ml低渗液,室温下静置20min第15页/共22页4.预固定:加入3-4滴固定液后,轻轻混匀,避免粘连,1000rpm离心5min,去上清;5.固定:沿管壁慢慢加入3ml固定液,2min后用吸管轻轻吹打,使细胞分散,固定10min后,1000rpm离心5min,去上清;6.二次固定:加3ml固定液,吹打均匀,固定10min后,1000rpm离心5min,去上清;7.三次固定:重复第6步;第16页/共22页8.制悬液:去上清后剩0.5ml固定液,用吸管轻轻吹打使其成为细胞悬液;9.滴片:将冰冷的载玻片倾斜30,吸取细胞悬液距离载玻片至少1

7、m滴于载玻片上,吹散,空气干燥;10.染色:在干燥的载玻片上滴Giemsa,染色10min,细水冲洗后,空气干燥;11.镜检:在低倍镜下寻找染色体分散良好、染色适中的分裂相,油镜下观察染色体形态并计数。第17页/共22页小鼠中期细胞染色体(2N=40)第18页/共22页小鼠染色体核型分析第19页/共22页人类慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)Chr9和Chr22相互易位 使得Chr9上的c-abl oncogene和Chr22上的bcr gene相连,形成融合基因。其产物是一个融合蛋白 这个融合蛋白使细胞不受细胞周期的控制,导致白血病。只要一个细胞带有这种易位Chr,就会致病。第20页/共22页猫叫综合征(Cat cry syndrome)临床表现:喉部发育不良,哭声似猫叫身体与智能发育不全,小头畸形,满月形脸,眼距宽,低耳位,高鼻梁在婴儿期或幼儿期夭折病因:5号染色体短臂缺失,5p-综合征第21页/共22页谢谢您的观看!第22页/共22页

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