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1、第二十章第二十章重组重组DNADNA技术技术recombinant DNA technique 第一节第一节 重组重组DNADNA技术的基本过程技术的基本过程Basic Process of Basic Process of Recombinant DNA Technology Recombinant DNA Technology*2 一、重组一、重组DNADNA技术相关概念技术相关概念重组重组重组重组DNADNADNADNA技术（技术（技术（技术（Recombinant DNA TechnologyRecombinant DNA TechnologyRecombinant DNA Techn
2、ologyRecombinant DNA Technology）：）：）：）：是在体外将不同来源的是在体外将不同来源的特异基因特异基因特异基因特异基因或或 DNADNADNADNA片段片段片段片段插插入入载体分子载体分子载体分子载体分子，构建成，构建成重组重组重组重组 DNADNADNADNA分子分子分子分子；并将它导入到并将它导入到合适的合适的受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，使其在细胞中扩增和繁殖，筛选筛选筛选筛选出含有目的基因的转化子细胞出含有目的基因的转化子细胞出含有目的基因的转化子细胞出含有目的基因的转化子细胞；再进行扩增、；再进行扩增、获取获取获取获取大量同
3、一大量同一大量同一大量同一DNADNADNADNA分子分子分子分子。*3 亦亦称称DNADNADNADNA克克克克隆隆隆隆(DNA(DNA cloning)cloning)，或或基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆(gene(gene cloning)cloning)。克隆化克隆化克隆化克隆化(cloning)(cloning)(cloning)(cloning)：获取这类同一的获取这类同一的DNADNA分子群体、细胞群体或个体分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。群体的过程，即无性繁殖。重组重组重组重组DNA(recombinant DNA,)DNA(recombinant DNA,)
4、DNA(recombinant DNA,)DNA(recombinant DNA,)：又称嵌合又称嵌合DNADNA（chimera DNAchimera DNA），采用克隆技术把），采用克隆技术把来自不同生物的外源来自不同生物的外源 DNADNA插入载体分子所形成的杂合插入载体分子所形成的杂合DNADNA分子。分子。*4克隆克隆克隆克隆(clone)(clone)(clone)(clone)：指从同一始祖经无性繁殖传代而来的一群遗传上指从同一始祖经无性繁殖传代而来的一群遗传上同一的同一的DNADNA分子、细胞或个体；分子、细胞或个体；分分分离目的基因并进行必要的改造分离目的基因并进行必要的改造
5、切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接目的基因与载体成重组载体拼接目的基因与载体成重组载体转转将重组载体转导入受体细胞将重组载体转导入受体细胞筛筛筛选出含重组筛选出含重组DNA的细胞等的细胞等 二、二、DNADNA重组技术基本程序重组技术基本程序*5思考题思考题 1 1重组重组DNADNA技术的基本过程（技术的基本过程（1 1）*6重组重组DNADNA技术的基本过程（技术的基本过程（2 2）*7思考题思考题 1 1*8Common Enzymes Used in RecombinantDNA Technology第二节第二节重组重组DNADNA技术中常用工具酶技术中常用工具酶
6、 一、一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 （restricton Endonucleaserestricton Endonuclease）是是一一类类能能识识别别双双链链DNADNA中中的的某某些些特特特特定定定定核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸序序序序列列列列，并并由由此此切切割割DNADNA双双链链的的核核酸酸内内切切酶酶，又又称称为为限限限限制制制制酶酶酶酶（restriction restriction restriction restriction enzymeenzymeenzymeenzyme）。主主要要是是从从原原核核生生物物中分离纯化而来。中分离纯化而来。基因工程的手术刀基因工程的
7、手术刀基因工程的手术刀基因工程的手术刀-“-“-“-“切切切切”与与甲甲甲甲基基基基化化化化酶酶酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限限限制制制制修修修修饰饰饰饰系系系系统统统统，限限制外源制外源DNADNA，保护自身，保护自身DNADNA。*9第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。（一）限制酶的命名：（一）限制酶的命名：H Hinind d 属属 种种 株株
8、序序Haemophilus Haemophilus ininfluenzae fluenzae d d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌 d d株的第三种酶株的第三种酶 一、一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶*10和和型型限限制制酶酶通通常常是是相相对对分分分分子子子子量量量量较较较较大大大大的的的的多多多多亚亚亚亚基基基基蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质复复复复合合合合物物物物，同同同同时时时时具具具具有有有有内内内内切切切切酶酶酶酶和和和和甲甲甲甲基基基基化化化化酶酶酶酶活活活活性性性性，反应过程中反应过程中需有需有MgMg2+2+和和ATPATP参与参与。、和和型（基因工程技术中常用型（基因工程技术
9、中常用型）。型）。（二）限制酶的分类：（二）限制酶的分类：型型限限制制酶酶通通常常以以同同源源二二聚聚体体形形式式存存在在，只只具具有有核核酸酸内内切切酶酶活活性性而而无无甲甲基基化化酶酶活活性性，反反应应过过程程中中只需有只需有MgMg2+2+参与参与而不需有而不需有ATPATP参与。参与。*11 类酶识别序具有类酶识别序具有回文结构回文结构(palindrome)(palindrome)特点，特点，即具有即具有双重旋转对称结构双重旋转对称结构的的DNADNA反向重复双链序列。反向重复双链序列。（三）（三）型型限制酶的作用特点：限制酶的作用特点：1.1.基本特性：基本特性：大部分大部分型限制
10、酶都能识别由型限制酶都能识别由4 48 8个核苷酸组成个核苷酸组成的特定序列。的特定序列。*12思考题思考题 2 2*13图图20-3 20-3 限制酶限制酶EcoEcoRR对双链对双链DNADNA分子的切割作用分子的切割作用Bam Bam HHGGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGGTCGTCCAGCAGGACGACCTGCTG+平端切口平端切口G GCCTAGCCTAGGATCCGATCC G G+粘端切口粘端切口HinHinddGTCGACGTCGACCAGCTGCAGCTG平或钝末端（平或钝末端（blunt end)blunt end)粘性末端（粘性末端（sticky end
11、)sticky end)切口切口 ：平端切口、粘端切口：平端切口、粘端切口 *14GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst2.2.同裂酶同裂酶 来源不同但能识别相同序列，切割来源不同但能识别相同序列，切割 DNADNA后产生后产生相同的黏性末端的限制酶，又称同功异源酶。相同的黏性末端的限制酶，又称同功异源酶。*15Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A3.3.同尾酶同尾酶 识别序列不完全相同，但切割识别序
12、列不完全相同，但切割 DNADNA后，产生相同的黏后，产生相同的黏性末端的限制酶称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为性末端的限制酶称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为配伍未端配伍未端(compatible end)(compatible end)。*164.4.可变酶可变酶 识别识别DNADNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过识别序列往往超过6 6个核苷酸。为个核苷酸。为型限制酶的特例。型限制酶的特例。如：如：如：如：Bstp GGTNACC CCANTGG*17 如：如：如：如：Bbl CGGN(N)4CCG;GCC(N)4NGGC （
13、四）限制酶的应用及影响因素（四）限制酶的应用及影响因素1.1.1.1.限制酶的应用限制酶的应用限制酶的应用限制酶的应用 重组重组DNADNA技术、基因组技术、基因组DNADNA物理图谱绘制、基因组物理图谱绘制、基因组DNADNA同源性研究、切割基因组同源性研究、切割基因组DNADNA或或cDNAcDNA构建基因组文构建基因组文库或库或cDNAcDNA文库等。文库等。2.2.2.2.影响限制酶作用的因素影响限制酶作用的因素影响限制酶作用的因素影响限制酶作用的因素 DNADNA纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、时间及缓冲液体系等。时间及缓冲液体系等。*
14、18 只能封闭只能封闭DNADNA链上的链上的缺口（缺口（nicknick）,而不能封闭而不能封闭裂口（裂口（gapgap）。）。是一种能够催化在两条是一种能够催化在两条是一种能够催化在两条是一种能够催化在两条DNADNADNADNA链之间形成磷酸二酯链之间形成磷酸二酯链之间形成磷酸二酯链之间形成磷酸二酯键的酶。键的酶。键的酶。键的酶。二、二、DNADNA连接酶连接酶 (DNA ligase)(DNA ligase)基因工程的缝纫针基因工程的缝纫针基因工程的缝纫针基因工程的缝纫针 -“-“-“-“接接接接”需要在一条需要在一条DNADNA链的链的3 3 末端具有游离的羟基、末端具有游离的羟基、
15、另一条另一条DNADNA链的链的5 5 末端有磷酸基团，而且反应过程末端有磷酸基团，而且反应过程需要由需要由ATPATP提供能量。提供能量。*191.T4 DNA1.T4 DNA1.T4 DNA1.T4 DNA连接酶连接酶连接酶连接酶 连接的底物可以是两个双链连接的底物可以是两个双链DNADNA分子的互补分子的互补黏性黏性末端末端或或平末端平末端。最早是从。最早是从T4T4噬菌体感染的大肠埃希噬菌体感染的大肠埃希菌分离，易制备，应用广。菌分离，易制备，应用广。（一）（一）DNADNA连接酶的类型：连接酶的类型：2.2.2.2.大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌DNADNADNADNA连接
16、酶连接酶连接酶连接酶 只能连接具有互补只能连接具有互补黏性末端黏性末端的两个双链的两个双链DNADNA分子分子底物。需要底物。需要NADNAD+作为辅助因子。作为辅助因子。*20连接黏性末端作用模式图：连接黏性末端作用模式图：*GAATTC*CTTAAG*5353EcoR IDNA连接酶连接酶*G*C T T A A 5335OHPA A T T C*G*5335 P OH+*21连接平末端作用模式图：连接平末端作用模式图：*AGCT*TCGA*5353Alu IT4 DNA连接酶连接酶OHP5335*TC*AG5335 OHPCT*GA*+*221.DNA1.DNA连接酶应用连接酶应用 （二
17、）（二）DNADNA连接酶的应用及影响因素：连接酶的应用及影响因素：催化两个具有黏性末端或平末端的催化两个具有黏性末端或平末端的催化两个具有黏性末端或平末端的催化两个具有黏性末端或平末端的DNADNADNADNA片段形成片段形成片段形成片段形成磷酸二酯键，形成新的重组磷酸二酯键，形成新的重组磷酸二酯键，形成新的重组磷酸二酯键，形成新的重组DNADNADNADNA分子；分子；分子；分子；接合由复制叉上不连续复制链上产生的缺口；接合由复制叉上不连续复制链上产生的缺口；接合由复制叉上不连续复制链上产生的缺口；接合由复制叉上不连续复制链上产生的缺口；缝合缝合缝合缝合DNADNADNADNA损伤修复、遗
18、传重组及损伤修复、遗传重组及损伤修复、遗传重组及损伤修复、遗传重组及DNADNADNADNA链剪接中缺口。链剪接中缺口。链剪接中缺口。链剪接中缺口。*232.2.影响影响DNADNA连接酶作用的因素连接酶作用的因素 对黏性末端的连接效率远高于对平末端的连接；对黏性末端的连接效率远高于对平末端的连接；对黏性末端的连接效率远高于对平末端的连接；对黏性末端的连接效率远高于对平末端的连接；*24 连接黏性末端的温度一般在连接黏性末端的温度一般在连接黏性末端的温度一般在连接黏性末端的温度一般在4 4 4 4 15151515；连接酶的用量，平末端连接用量高；连接酶的用量，平末端连接用量高；连接酶的用量，
19、平末端连接用量高；连接酶的用量，平末端连接用量高；ATPATPATPATP浓度一般为浓度一般为浓度一般为浓度一般为0.010.010.010.01 1 mmol/L;1 mmol/L;1 mmol/L;1 mmol/L;载体分子与插入片段的摩尔数比为载体分子与插入片段的摩尔数比为载体分子与插入片段的摩尔数比为载体分子与插入片段的摩尔数比为1:101:101:101:10 1:31:31:31:3。三、三、DNADNA聚合酶聚合酶 能能够够催催化化以以DNADNA或或RNARNA为为模模板板合合成成DNADNA的的反反应应，把把脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸连连续续地地添添加加到到双双链链DNAD
20、NA分分子子或或引引物链的物链的3-OH3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。末端，催化核苷酸的聚合作用。（一）大肠埃希菌（一）大肠埃希菌DNADNA聚合酶聚合酶 （二）（二）KlenowKlenow片段片段 具有具有5 5 5 53 3 3 3 聚合酶，聚合酶，聚合酶，聚合酶，5 5 5 53 3 3 3 及及及及3 3 3 35 5 5 5 核核核核酸外切酶活性。酸外切酶活性。酸外切酶活性。酸外切酶活性。具有具有5 5 5 53 3 3 3 聚合酶，聚合酶，聚合酶，聚合酶，3 3 3 35 5 5 5 核酸外切酶活核酸外切酶活核酸外切酶活核酸外切酶活性。性。性。性。*25（三）（三）Taq
21、DNATaq DNA聚合酶聚合酶 （四）反转录酶：（四）反转录酶：依赖依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。具有具有5 5 5 53 3 3 3 聚合酶，聚合酶，聚合酶，聚合酶，5 5 5 53 3 3 3 核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶活活性性，对对MgMg2+2+浓度非常敏感。浓度非常敏感。是第一个被发现的、耐热的、依赖是第一个被发现的、耐热的、依赖DNADNA的的DNADNA聚聚合酶，合酶，最佳反应温度为最佳反应温度为最佳反应温度为最佳反应温度为70707070 75757575。普遍使用的是来源于普遍使用的是来源于AMV(鸟类成髓细胞白血鸟类成髓细胞白血病病毒病病毒
22、)及及M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒莫洛尼鼠白血病病毒)的反转录的反转录酶，酶，具有具有5 5 5 53 3 3 3 聚合酶。聚合酶。聚合酶。聚合酶。*26（一）末端脱氧核苷酸转移酶（一）末端脱氧核苷酸转移酶 （terminal deoxynucleotidyl transferaseterminal deoxynucleotidyl transferase）四、其它修饰酶四、其它修饰酶 是一种无需模板的是一种无需模板的是一种无需模板的是一种无需模板的DNADNADNADNA聚合酶，催化脱氧核糖核聚合酶，催化脱氧核糖核聚合酶，催化脱氧核糖核聚合酶，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链苷酸转移到单
23、链或双链苷酸转移到单链或双链苷酸转移到单链或双链DNADNADNADNA分子的分子的分子的分子的3-OH3-OH3-OH3-OH末端上。末端上。末端上。末端上。(1)(1)底物是底物是单链单链单链单链DNADNADNADNA或有或有3333突出末端的双链突出末端的双链突出末端的双链突出末端的双链 DNADNADNADNA。5533OHCo2+dNTPnppi5533(A/G/C/T)n)n*27(2)(2)底物是底物是3333平端平端平端平端或或3333凹端凹端凹端凹端的双链的双链DNADNA。Co2+dNTPnppi53OH53(A/G/C/T)nCo2+dNTPnppi53OH53(A/G
24、/C/T)n用途：用途：用途：用途：（1 1）主要作用是在载体或目的基因）主要作用是在载体或目的基因 33末端加上末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNADNA重组。重组。（2 2）DNA 3DNA 3末端的同位素标记。末端的同位素标记。*28（二）碱性磷酸酶（二）碱性磷酸酶（二）碱性磷酸酶（二）碱性磷酸酶 （alkaline phosphatasealkaline phosphatase）能特异地切除能特异地切除DNADNA、RNARNA和和dNTPdNTP上上5-5-磷酸基团磷酸基团。（三）多核苷酸激酶（三）多核苷酸激酶（三）多核苷酸激酶（三）
25、多核苷酸激酶 （polynuleotide kinasepolynuleotide kinase）又称又称T4T4多核苷酸激酶，能催化多核苷酸激酶，能催化ATPATP的的-磷酸基磷酸基团转移到团转移到DNADNA或或RNARNA片段的片段的5-OH5-OH末端末端。*29重组重组DNADNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工工工 具具具具 酶酶酶酶功功功功 能能能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNADNADNADNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶催化催化催化催化D
26、NADNADNADNA中相邻中相邻中相邻中相邻5555磷酸和磷酸和磷酸和磷酸和3333羟基间形成磷酸二酯键，羟基间形成磷酸二酯键，羟基间形成磷酸二酯键，羟基间形成磷酸二酯键，使使使使DNADNADNADNA切口封合或使两个切口封合或使两个切口封合或使两个切口封合或使两个DNADNADNADNA分子或片段连接分子或片段连接分子或片段连接分子或片段连接DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶缺口合成；缺口合成；缺口合成；缺口合成；双链双链双链双链cDNAcDNAcDNAcDNA分子或片段连接；分子或片段连接；分子或片段连接；分子或片段连接；平移平移平移平移制作高比活探针；制作高比活探针；制
27、作高比活探针；制作高比活探针；DNADNADNADNA序列分析；序列分析；序列分析；序列分析；填补填补填补填补3333末端末端末端末端KlenowKlenowKlenowKlenow片段片段片段片段DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I I I大片段，具有大片段，具有大片段，具有大片段，具有DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I I I的的的的5 5 5 53 3 3 3 聚聚聚聚合、合、合、合、3 3 3 35 5 5 5 外切活性，而无外切活性，而无外切活性，而无外切活性，而无5 5 5 53 3 3 3 外切活性。外切活性。外切活性。外切活性。常用于常用于
28、常用于常用于cDNAcDNAcDNAcDNA第二链合成，双链第二链合成，双链第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3DNA 3DNA 3DNA 3 末端标记末端标记末端标记末端标记反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶合成合成合成合成cDNAcDNAcDNAcDNA；替代替代替代替代DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I I I进行填补，标记或进行填补，标记或进行填补，标记或进行填补，标记或DNADNADNADNA序列分析序列分析序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5555羟基末端磷酸化，或
29、标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶末端转移酶末端转移酶在在在在3333羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基切除末端磷酸基切除末端磷酸基第三节第三节重组重组DNADNA技术中常用载体技术中常用载体 Common Vectors in Recombinant DNA Technology*31u载体（载体（vectorvector）的概念）的概念克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体 (clonin
30、g vector)(cloning vector)(cloning vector)(cloning vector)表达载体表达载体表达载体表达载体 (expression vector)(expression vector)(expression vector)(expression vector)可可可可使使使使插插插插入入入入的的的的外外外外源源源源DNADNADNADNA片片片片段段段段被被被被转转转转录录录录、翻翻翻翻译译译译成成成成多多多多肽肽肽肽链链链链的载体。的载体。的载体。的载体。是是在在克克隆隆载载体体的的基基础础上上，增增添添了了与与宿宿主主细细胞胞相相适适应应的的强强启启
31、动动子子，以以及及有有利利于于表表达达产产物物分分泌泌、分分离离或或纯纯化的元件。化的元件。含含含含有有有有复复制制起起始始点点oriCoriC，可可可可使使使使插插插插入入入入的的的的外外外外源源源源DNADNADNADNA序序序序列列列列被扩增或保存的载体。被扩增或保存的载体。被扩增或保存的载体。被扩增或保存的载体。指能携带外源指能携带外源指能携带外源指能携带外源DNADNADNADNA分子进入受体细胞进行扩增和分子进入受体细胞进行扩增和分子进入受体细胞进行扩增和分子进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具。应具备的基本条件：表达的运载工具。应具备的基本条件：表达的运载工具。应具备的基本条件：
32、表达的运载工具。应具备的基本条件：*32 含有含有含有含有复制起始点，复制起始点，具有自主复制的能力；具有自主复制的能力；具有自主复制的能力；具有自主复制的能力；具有较高的遗传稳定性。具有较高的遗传稳定性。具有较高的遗传稳定性。具有较高的遗传稳定性。拷贝数较多，易于与受体细胞的染色体拷贝数较多，易于与受体细胞的染色体拷贝数较多，易于与受体细胞的染色体拷贝数较多，易于与受体细胞的染色体DNADNADNADNA分开；分开；分开；分开；分子质量相对较小，以容纳较大的外源分子质量相对较小，以容纳较大的外源分子质量相对较小，以容纳较大的外源分子质量相对较小，以容纳较大的外源DNADNADNADNA；具有
33、一个以上的选择性遗传标记，便于重组体具有一个以上的选择性遗传标记，便于重组体具有一个以上的选择性遗传标记，便于重组体具有一个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；载体应具备的基本条件：载体应具备的基本条件：*33重组重组DNADNA技术中常用载体：技术中常用载体：一、质粒载体：一、质粒载体：一、质粒载体：一、质粒载体：最常用的目的基因最常用的目的基因克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体 粘粒粘粒粘粒
34、粘粒载体：载体：载体：载体：用于克隆大片段用于克隆大片段DNADNA(自习自习)M13 M13 M13 M13噬菌体载体：噬菌体载体：噬菌体载体：噬菌体载体：用于用于SangerSanger双脱氧双脱氧DNADNA测序测序(自自习习)二、二、二、二、噬菌体载体：噬菌体载体：噬菌体载体：噬菌体载体：构建基因组构建基因组DNADNA或或cDNAcDNA文库文库(自习自习)四、病毒载体：四、病毒载体：四、病毒载体：四、病毒载体：包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物病病 毒用于在真核细胞中表达目的蛋白毒用于在真核细胞中表达目的蛋白(自习自习)三、人工染色体载体：三、人工染色
35、体载体：三、人工染色体载体：三、人工染色体载体：用于更大用于更大DNADNA片段的克隆片段的克隆(自习自习)*34 一、质粒一、质粒 (plasmid)(plasmid)载体载体细菌培养细菌培养 质粒存在于细菌染色质以外，具有自我复制能质粒存在于细菌染色质以外，具有自我复制能质粒存在于细菌染色质以外，具有自我复制能质粒存在于细菌染色质以外，具有自我复制能力的双链环状力的双链环状力的双链环状力的双链环状DNADNADNADNA。小的约。小的约。小的约。小的约2 2 2 2 3kb,3kb,3kb,3kb,大的数百大的数百大的数百大的数百kbkbkbkb。大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌染色质染色
36、质质粒质粒质粒扩增并表达蛋白质质粒扩增并表达蛋白质质粒扩增并表达蛋白质质粒扩增并表达蛋白质 严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plaxmidstringent plaxmid）松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plaxmidrelaxed plaxmid）AmprORITetr（一）（一）pBR322pBR322质粒：一种克隆质粒质粒：一种克隆质粒ORIORI：AmpAmpAmpAmpr r r r,TetTetTetTetr r r r：两个抗性基因，用两个抗性基因，用于筛选阳性克隆。于筛选阳性克隆。PstPstPstPst I,I,I,I,BamBamBamBamH IH
37、IH IH I：两个酶切位点，用两个酶切位点，用于插入目的基因于插入目的基因分子量较小分子量较小分子量较小分子量较小拷贝数较高拷贝数较高拷贝数较高拷贝数较高复制起始点，保证高复制起始点，保证高拷贝自我复制拷贝自我复制。*36 目目的的基基因因与与 pBR322经经BamH I酶酶切切后后重重组组如如何何筛选得到阳性克隆？筛选得到阳性克隆？克隆克隆3,5,7,9,10 3,5,7,9,10 是是阳性克隆阳性克隆TetTet平板平板123456789101112123456789101112Amp*37阳性克隆阳性克隆*38AmpTetDNA连接酶连接酶重组质粒重组质粒目的基因目的基因AmprTe
38、trPst I 目目的的基基因因与与 pBR322经经Pst I酶酶切切后后进进行行重重组组如如何何筛选得到阳性克隆？筛选得到阳性克隆？课堂讨论课堂讨论*39用用Pst I酶切酶切 （二）（二）pUCpUC质粒载体系列质粒载体系列OripUC192686 bpAmprP(BLA)PlacAva I(413)BamHI(418)Eco RI(397)Hin dIII(448)Pst I(440)Sma I(415)Xma I(413)Apa LI(178)Apa LI(1121)Apa LI(2367)MCS提供多个单酶提供多个单酶切位点用于克切位点用于克隆操作隆操作Lac Z蓝白斑筛选阳蓝白斑
39、筛选阳性克隆性克隆分子量更小分子量更小分子量更小分子量更小拷贝数更高拷贝数更高拷贝数更高拷贝数更高*40 pUCpUCpUCpUC质质质质粒粒粒粒载载载载体体体体插插插插入入入入了了了了半半半半乳乳乳乳糖糖糖糖苷苷苷苷酶酶酶酶N N N N端端端端肽肽肽肽片片片片段段段段的的的的编编编编码码码码基基基基因因因因laclaclaclac Z Z Z Z；产产产产物物物物肽肽肽肽也也也也无无无无活活活活性性性性，也也也也不不不不能能能能分分分分解解解解培养基中的培养基中的培养基中的培养基中的X-galX-galX-galX-gal。蓝白斑筛选蓝白斑筛选 DH5aDH5aDH5aDH5a宿宿宿宿主主
40、主主菌菌菌菌染染染染色色色色体体体体插插插插入入入入了了了了半半半半乳乳乳乳糖糖糖糖苷苷苷苷酶酶酶酶C C C C端端端端的的的的肽肽肽肽片片片片段段段段的的的的编编编编码码码码基基基基因因因因laclaclaclacM15M15M15M15；产产产产物物物物肽肽肽肽无无无无活活活活性性性性；不不不不能分解培养基中的能分解培养基中的能分解培养基中的能分解培养基中的X-galX-galX-galX-gal。有有有有活活活活性性性性的的的的半半半半乳乳乳乳糖糖糖糖苷苷苷苷酶酶酶酶由由由由肽肽肽肽和和和和肽肽肽肽互互互互补补补补(互互互互补补补补)而而而而成成成成，可可可可使使使使培培培培养养养养基
41、基基基中中中中的的的的X-galX-galX-galX-gal分分分分解解解解形形形形成成成成蓝蓝蓝蓝色色色色化化化化合合合合物物物物而出现蓝色菌落。而出现蓝色菌落。而出现蓝色菌落。而出现蓝色菌落。*41*42X-galX-gal蓝色化合物蓝色化合物-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（+）白色白色 蓝白斑筛选：蓝白斑筛选：DH5aDH5aDH5aDH5a宿主菌宿主菌宿主菌宿主菌蓝色菌落：阴性克隆蓝色菌落：阴性克隆;白色菌落：阳性克隆白色菌落：阳性克隆*43 蓝白斑筛选蓝白斑筛选思考题思考题 3 3 （三）其它质粒载体（三）其它质粒载体1.1.能在体外转录克隆基因的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体
42、由由pUCpUC系系列列质质粒粒载载体体派派生生而而来来，带带有有来来自自噬噬菌菌体体T7T7、SP6SP6的的启启动动子子，为为RNARNA聚聚合合酶酶的的附附着着提提供供了了特特异异性识别位点。如性识别位点。如pGEM-3Z/4Z.pGEM-3Z/4Z.2.2.穿梭质粒载体（穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectorshuttle plasmid vector）是一类人工构建的，具有两种不同复制起始点是一类人工构建的，具有两种不同复制起始点和选择标记，可在两种不同的宿主细胞中存活和复和选择标记，可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。制的质粒载体。*44 （四）（四）
43、TATA克隆载体克隆载体 许多耐热的许多耐热的DNADNA聚合酶聚合酶(如如TaqTaqTaqTaq、TthTthTthTth等等)扩增时，扩增时，都在都在PCRPCR产物产物3-3-末端加上了末端加上了A A碱基。碱基。是专为克隆是专为克隆是专为克隆是专为克隆PCRPCRPCRPCR产物而设计的，在其产物而设计的，在其产物而设计的，在其产物而设计的，在其MCSMCSMCSMCS两侧的两侧的两侧的两侧的3-3-3-3-末端携带有未配对的末端携带有未配对的末端携带有未配对的末端携带有未配对的T T T T碱基的载体。碱基的载体。碱基的载体。碱基的载体。335PCR产物产物AA5Taq酶酶T载体载
44、体TT5533*45在连接酶的作用下可直接将在连接酶的作用下可直接将PCRPCR产物克隆到产物克隆到TATA载体中。载体中。二、噬菌体载体二、噬菌体载体（自习）（自习）噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体(bacteriophage,phage)(bacteriophage,phage)(bacteriophage,phage)(bacteriophage,phage)是一类细菌病毒，可用于克隆和扩增特定的是一类细菌病毒，可用于克隆和扩增特定的是一类细菌病毒，可用于克隆和扩增特定的是一类细菌病毒，可用于克隆和扩增特定的DNADNADNADNA片段，是广泛使用的基因克隆载体。片段，是广泛使用的基因克隆载体。
45、片段，是广泛使用的基因克隆载体。片段，是广泛使用的基因克隆载体。野生野生噬菌体的基因组为线状双链噬菌体的基因组为线状双链 DNADNA，两端两端为为12bp12bp彼此完全互补，称之为彼此完全互补，称之为 coscoscoscos位点位点位点位点的的5-5-5-5-单链单链单链单链突出黏性末端突出黏性末端突出黏性末端突出黏性末端；进入宿主细胞后形成坏状双链结构，；进入宿主细胞后形成坏状双链结构，按按方式及滚环方式进行复制。方式及滚环方式进行复制。感染细菌后，可进入感染细菌后，可进入溶菌生命周期溶菌生命周期溶菌生命周期溶菌生命周期及溶及溶源生命源生命源生命源生命周期周期周期周期。*46gt10/
46、11gt10/11gt10/11gt10/11系列系列系列系列 (插入型，适用于插入型，适用于插入型，适用于插入型，适用于cDNAcDNAcDNAcDNA克隆克隆克隆克隆)EMBL3/4EMBL3/4EMBL3/4EMBL3/4系列系列系列系列(置换型，适用于基因组置换型，适用于基因组置换型，适用于基因组置换型，适用于基因组DNADNADNADNA文库构建文库构建文库构建文库构建)可容纳可容纳7 kb7 kb以下以下的外源片段。的外源片段。gt10gt10gt10gt10和和和和gt11gt11gt11gt11分别分别分别分别在阻遏剂在阻遏剂CICI基因和基因和lacZlacZ基因上，有供外源
47、基因上，有供外源基因片段插入的单一内切酶位点。基因片段插入的单一内切酶位点。可容纳可容纳9 923kb23kb的外源片段。具有两个或两组内的外源片段。具有两个或两组内切酶位点，经酶切除去基因组中噬菌体正常生长非切酶位点，经酶切除去基因组中噬菌体正常生长非必需的序列，由外源基因片段取代。必需的序列，由外源基因片段取代。（一）（一）噬菌体载体噬菌体载体 可插入的外源可插入的外源 DNADNA片段大，感染效率远片段大，感染效率远高于质粒载体的转化效率。高于质粒载体的转化效率。*47EMBL3/4EMBL3/4EMBL3/4EMBL3/4系列系列系列系列(置换型，适用于基因组置换型，适用于基因组置换型
48、，适用于基因组置换型，适用于基因组DNADNADNADNA文库构建文库构建文库构建文库构建)gt10/11gt10/11gt10/11gt10/11系列系列系列系列 (插入型，适用于插入型，适用于插入型，适用于插入型，适用于cDNAcDNAcDNAcDNA克隆克隆克隆克隆)黏粒载体黏粒载体结构特点：结构特点：分子小，分子小，可插入可插入可插入可插入45 kb45 kb45 kb45 kb的外源的外源的外源的外源DNADNADNADNA片段片段片段片段；含质粒自主复制成分含质粒自主复制成分ORIORI，和耐药基因，和耐药基因AmpAmpr r；含带有一个或多个单一酶切位点的多聚物接头；含带有一个
49、或多个单一酶切位点的多聚物接头；含含 噬菌体噬菌体coscos黏性末端及与包装有关的短序列；黏性末端及与包装有关的短序列；（二）黏粒载体（二）黏粒载体 粘粒粘粒又称又称柯斯质粒柯斯质粒(cos site-carrying(cos site-carrying plasmid,cosmid),plasmid,cosmid),是由是由 噬菌体的噬菌体的coscos黏性末端黏性末端和细菌的质粒构建而成。和细菌的质粒构建而成。接上在真核细胞生活的元件，如接上在真核细胞生活的元件，如SV40SV40复制区及启复制区及启 动子，动子，可作为穿梭载体。可作为穿梭载体。可作为穿梭载体。可作为穿梭载体。*50 （
50、三）（三）M13M13噬菌体载体噬菌体载体 M13M13M13M13噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体基因组为闭环单链基因组为闭环单链DNADNA，感染雄性大，感染雄性大肠埃希菌后，在菌体内复制成相当于质粒的肠埃希菌后，在菌体内复制成相当于质粒的复制型复制型复制型复制型（RFRFRFRF）M13M13M13M13双链双链DNADNA，可用作基因克隆载体。，可用作基因克隆载体。M13mp M13mp系列系列(携带有携带有 含含MCSMCS序列的序列的lacZlacZ基因基因),),外源外源DNADNA不宜大于不宜大于1500 bp1500 bp。pBluescript KS pBluescript KS