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1、 基因重组与基因工程基因重组与基因工程 Gene recombination and genetic engineering 孙庆涛 刘华明2011.3.16 重重 组组 DNA技技 术术 又又 称称 为为 基基 因因 工工 程程（genetic engineering）或分子克隆）或分子克隆（molecular cloning）。基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：载体和目的基因的分离载体和目的基因的分离载体和目的基因的切断载体和目的基因的切断载体和目的基因的重组载体和目的基因的重组重组重组DNA的转化和扩增的转化和扩增重组重组DNA的筛选和鉴定的筛选
2、和鉴定 一、载体和目的基因的分离一、载体和目的基因的分离 为为了了进进行行基基因因重重组组，首首先先需需要要对对载载体体DNA和和目目的的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。基因分别进行分离纯化，得到其纯品。（一）载体：（一）载体：基因工程中常用的载体基因工程中常用的载体(vector)主要包括主要包括质粒质粒(plasmid)噬菌体噬菌体(phage)病毒病毒(virus)这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。一的限制酶切点等。存在于天然细
3、菌体内的一种存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的独立于细菌染色体之外的双链环双链环状状DNA，具有，具有独立复制独立复制的能力，的能力，通常带有细菌的通常带有细菌的抗药基因抗药基因。最早使用的质粒最早使用的质粒DNA是人工构建是人工构建的的pBR322，该质粒分子大小为，该质粒分子大小为，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含因，含EcoR，BamH，Hind等单一的限制酶切点。等单一的限制酶切点。2噬菌体：噬菌体：可可通通过过转转染染方方式式将将其其DNA送送入入细细菌菌体体内内进进行行增增殖殖。常常用用的的为为人人工工构构建建的的噬噬菌菌体体载载体体。噬噬
4、菌菌体体两两端端的的片片段段对对于于其其包包装装是是必必需需的的，因因而而应应予予保保留留；而而其其中中间间部部分分则则可可进进行行改改造造或或置置换换，使使之之具具有有某某种种单单一一的的限限制制酶酶切切点点。目目的的基基因因与与噬噬菌菌体体DNA进进行行重重组组时时，可可采采用用插插入入重重组组方方式式，也也可可采采用用置置换换重重组方式组方式。3病毒：病毒：常用的为常用的为SV40，通过感染方式将其，通过感染方式将其DNA送入哺乳送入哺乳动物细胞中进行增殖。动物细胞中进行增殖。（二）目的基因：（二）目的基因：目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行：目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行：
5、1直接从染色体直接从染色体DNA中分离：中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。2人工合成：人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。多肽的基因。3.从从mRNA合成合成cDNA：采采用用一一定定的的方方法法钓钓取取特特定定基基因因的的mRNA，再再通通过过逆逆转转录录酶酶催催化化合合成成其其互互补补DNA（cDNA），除除去去RNA链链后后，再再用用DNA聚聚合合酶酶合合成成其其互互补补DN
6、A链链，从从而而得得到到双双链链DNA。这这一一方方法法通通常常可可得得到到可可表表达达的的完完整基因。整基因。4从基因文库中筛选：从基因文库中筛选：将将某某一一种种基基因因DNA用用适适当当的的限限制制酶酶切切断断后后，与与载载体体DNA重重组组，再再全全部部转转化化宿宿主主细细胞胞，得得到到含含全全部部基基因因组组DNA的种群，称为的种群，称为G-文库文库(genomic DNA library)。将将某某种种细细胞胞的的全全部部mRNA通通过过逆逆转转合合成成cDNA，然然后后转转化化宿宿主主细细胞胞，得得到到含含全全部部表表达达基基因因的的种种群群，称称为为C-文库文库(cDNA li
7、brary)。C-文库具有组织细胞特异性。文库具有组织细胞特异性。5利用利用PCR合成：合成：如如已已知知目目的的基基因因两两端端的的序序列列，则则可可采采用用聚聚合合酶酶链链反反应应（polymerase chain reaction,PCR）技技术术，在在体体外外合合成成目目的的基基因因。但但此此法法可可能能会会造造成成克克隆隆的的目目的的基因碱基序列的改变。基因碱基序列的改变。PCR概述概述 PCR：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用DNA合成合成 酶和四种脱氧核酶和四种脱氧核糖核酸进行糖核酸进行DNA的体外合成反应。的体外合成反应
8、。PCR技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获得多达几百万拷贝的目的基因。内获得多达几百万拷贝的目的基因。该技术在上个世纪该技术在上个世纪80年代中期由美国发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍年代中期由美国发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用，也因此获得生技术，在很多领域中广泛使用，也因此获得1993年度的诺贝尔化学奖。年度的诺贝尔化学奖。PCR基本原理基本原理 DNA在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核
9、糖核酸聚合过程，是 DNA聚合聚合酶、酶、DNA连接酶、引发酶、连接酶、引发酶、DNA引物、四种脱氧核糖核酸、引物、四种脱氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、离子环超螺旋酶、离子环境等多成份参与的过程。境等多成份参与的过程。PCR是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的DNA复制，所以在一个复制，所以在一个PCR中必需成分是中必需成分是 1.模板模板DNA 2.DNA聚合酶聚合酶 3.四种脱氧核糖核酸四种脱氧核糖核酸 4.正向和反向两条引物正向和反向两条引物 5.适当的缓冲体系。适当的缓冲体系。1.变性：是指模板的热变性，双螺旋模版变性：是指模板的热变性，双螺旋
10、模版DNA成为单链的成为单链的DNA分子；在应用分子；在应用Taq DNA聚合聚合酶进行酶进行PCR反应时，变性往往在反应时，变性往往在9495条件下进行。这也是条件下进行。这也是Taq DNA聚合酶进行聚合酶进行30个左右的个左右的PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。2.退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低的熔解温度低510，PCR实验要对退火温度进行优化。实验要对退火温度进行优化。PCR基本步骤基本
11、步骤3.延伸：在镁离子存在条件下，延伸：在镁离子存在条件下，DNA聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加在引物的在引物的3端，使引物沿端，使引物沿53方向生成与模版方向生成与模版DNA互补的新互补的新DNA链。链。双链模版双链模版DNADNA变性变性退火退火5 53 35 53 35 55 53 33 35 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物下游引物延伸延伸3 35 55 53 33 35 55 53 3多次循环多次循环（2 2n n 拷贝）拷贝）1、目的基因的克隆、目的基因的克隆2、基因的体外突变、基因的体外
12、突变3、DNA和和RNA的微量分析的微量分析4、DNA序列测定序列测定5、基因突变分析、基因突变分析PCR的主要用途的主要用途二、载体和目的基因的切断二、载体和目的基因的切断 通通常常采采用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶(restriction endonuclease)，简简称称限限制制酶酶，分分别别对对载载体体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。和目的基因进行切断，以便于重组。限限制制酶酶目目前前已已经经发发现现400多多种种，所所识识别别的的顺顺序往往为序往往为4-8个碱基对，且有个碱基对，且有回文结构回文结构。由由限限制制酶酶切切断断后后的的末末端端可可形形成成平平端端、3-突突
13、出出粘粘性性末末端端和和5-突突出出粘粘性性末末端端三三种种情情况况。形形成成粘粘性性末末端端(cohesive end)者者较较有有利利于于载载体体DNA和目的基因的重组。和目的基因的重组。三、载体和目的基因的重组三、载体和目的基因的重组 即即将将带带有有切切口口的的载载体体与与所所获获得得的的目目的的基基因因连连接接起起来来，得得到到重重新新组组合后的合后的DNA分子。分子。（一）粘性末端连接法：（一）粘性末端连接法：当当载载体体DNA和和目目的的基基因因均均用用同同一一种种限限制制酶酶进进行行切切断断时时，二二者者即即可可带带有有相相同同的的粘粘性性末末端端。如如将将载载体体与与目目的的
14、基基因因混混合合在在一一起起，二二者者即即可可通通过过粘粘性性末末端端进进行行互互补补粘粘合合，再再加加入入DNA连连接接酶酶，即即可可封封闭闭其其缺缺口口，得得到到重重组体。组体。较较少少的的情情况况下下，对对产产生生的的平平端也可直接进行连接。端也可直接进行连接。（二）人工接尾法：（二）人工接尾法：即即同同聚聚物物加加尾尾连连接接法法。当当载载体体和和目目的的基基因因无无法法采采用用同同一一种种限限制制酶酶进进行行切切断断，无无法法得得到到相相同同得得粘粘性性末末端端时，可采用此方法。时，可采用此方法。此此法法首首先先使使用用单单链链核核酸酸酶酶将将粘粘性性末末端端切切平平，再再在在末末端
15、端核核苷苷酸酸转转移移酶酶的的催催化化下下，将将脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸添添加加于于载载体体或或目目的的基基因因的的3-端端，如如载载体体上上添添加加一一段段polyG，则则可可在在目目的的基基因因上上添添加加一一段段polyC，故故二二者者即即可可通通过过碱碱基基互补进行粘合，再由互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。连接酶连接。（三）人工接头连接法：（三）人工接头连接法：将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以同一
16、种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。互补的粘性末端。四、重组四、重组DNA导入受体细胞导入受体细胞（一）转化（一）转化（transformation）转化是指将质粒或其他外源转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌悬浮在主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌悬浮在CaCl2溶液中，并置溶液中，并置于低温（于低温（05）环境下一段时间，钙离子使细胞膜的）环境下一段时间，钙离子使细胞膜的结构发生变化，通透性增加，从而具有摄取外源结构发生变化，通透
17、性增加，从而具有摄取外源DNA的的能力，这种细胞称为感受态细胞（能力，这种细胞称为感受态细胞（competent cell）。）。(二二)感染（感染（infection）噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内繁殖。噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内繁殖。由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导（转导（transduction）。）。(三三)转染转染（tra
18、nsfection）转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段片段而获得新的表型的过程。而获得新的表型的过程。常用的方法有电穿孔法（常用的方法有电穿孔法（electroporation）、磷酸钙）、磷酸钙沉淀法、脂质体融合法等。进入细胞的沉淀法、脂质体融合法等。进入细胞的DNA可以被整合至可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在染色体外存在和表达。宿主细胞的基因组中，也可以在染色体外存在和表达。五、重组五、重组DNA的筛选和鉴定的筛选和鉴定 由由于于重重组组体体导导入入宿宿主主细细胞胞的的比比例例通通常常较较低低，因因此此需需要要对对含含有有重重组组
19、体体的的宿宿主主细细胞胞进进行行筛筛选选并并作作鉴定。可采用以下方法进行：鉴定。可采用以下方法进行：（一）根据重组体的表型进行筛选：（一）根据重组体的表型进行筛选：对对于于带带有有抗抗药药基基因因的的质质粒粒重重组组体体，可可采采用用插插入入灭灭活活法法进进行行筛筛选选。如如pBR322中中带带有有抗抗氨氨苄苄青青霉霉素素和和抗抗四四环环素素基基因因，当当将将目目的的基基因因插插入入抗抗四四环环素素基基因因后后，就就可可引引起起该该基基因因失失活活，细细菌菌对对氨氨苄苄青青霉霉素素耐耐药药，而而对对四四环环素素敏敏感感。在在含含氨氨苄苄青青霉霉素素的的培培养养基基上上能能够够生生长长，而而在在
20、含含四四环环素素的的培培养养基基上上不不能生长的细菌即为带重组体的细菌。能生长的细菌即为带重组体的细菌。插插入入灭灭活活法法筛筛选选重重组组体体（二）根据标志互补进行筛选：当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。（三）根据DNA限制酶谱进行分析：经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。（四）用核酸杂交法进行分析鉴定：（四）用核酸杂交法进行分析鉴定：为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。为阳性，即可确定重组体中带目的基因。获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质。