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1、1第七章第七章重组重组DNADNA技术技术(Recombination DNA Technology)2第一节第一节 基基 本本 概概 念念3重组重组DNADNA技术：技术：是指在基因水平上，将是指在基因水平上，将目目的的DNADNA在体外在体外重组重组于能自我复制于能自我复制的的载体载体DNADNA分子分子上，然后将重组上，然后将重组DNADNA导入宿主细胞中进行增生，导入宿主细胞中进行增生，以获得大量的目的以获得大量的目的DNADNA片段，或片段，或以此为基础，通过基因的诱导以此为基础，通过基因的诱导表达，得到大量相应蛋白质产表达，得到大量相应蛋白质产物的过程。物的过程。又称为又称为分子克
2、隆技术分子克隆技术或或基基因工程技术因工程技术4第二节第二节 重组重组DNADNA技术的发展史技术的发展史5基因工程的诞生基因工程的诞生1 1、BergBerg的开创性实验的开创性实验第一个实现第一个实现DNADNA重组重组1980年年Nobel化学奖化学奖猴病毒猴病毒SV40SV40的的DNA+DNA+噬菌体的噬菌体的DNADNA2 2 2 2、Boyer-CohenBoyer-CohenBoyer-CohenBoyer-Cohen实验实验实验实验第一个取得基因工程成功第一个取得基因工程成功19731973年构建年构建双重抗药性重组质粒双重抗药性重组质粒19731973年是基因工程诞生的元年
3、年是基因工程诞生的元年6第三节第三节 工具酶工具酶7Werner Arber Werner Arber 理论预见限制酶理论预见限制酶Hamilton O.Smith Hamilton O.Smith 得到第一个限制酶得到第一个限制酶Daniel Nathans Daniel Nathans 用限制酶切得用限制酶切得SV40 SV40 DNADNA片断片断19781978年年NobelNobel生理或医学奖生理或医学奖81.1.定义：定义：能识别双链能识别双链DNADNA分子中某分子中某特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列，并，并 在识别序列内或附近切割在识别序列内或附近切割DNADNA双链结构的一
4、类核双链结构的一类核 酸内切酶（酸内切酶（在核酸分子链的在核酸分子链的内部内部制造切口的酶）制造切口的酶）。2.2.来源来源：原核生物原核生物9型酶、型酶、型酶：型酶：具具有有限限制制切切割割与与甲甲基基化化修修饰饰活活性性。型型和和型型酶酶都都没没有多大的实用价值。有多大的实用价值。型酶：型酶：应用广泛，能在应用广泛，能在DNADNA分子内部的特异位点，识别和切分子内部的特异位点，识别和切割双链割双链DNADNA，其切割位点的序列可知、固定。其切割位点的序列可知、固定。通常所说的限制性内切酶就是指通常所说的限制性内切酶就是指型酶。型酶。3.分类分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。：根据结
5、构、作用特点不同，分为三类。10识别位点：识别位点：即为即为型酶识别的特殊型酶识别的特殊DNADNA序列。序列。通常是通常是4 48 8个碱基对、具有个碱基对、具有回文序列回文序列的的DNADNA片段片段 5 G A A T T C-3 3 C T T A A G-54.识别和切割位点：识别和切割位点：11 5 5突出粘性末端突出粘性末端 3 3突出粘性末端突出粘性末端 平头（钝性末端）平头（钝性末端）1255突出黏性末端突出黏性末端(EcoR)：33突出黏性末端突出黏性末端(Pst)：平端缺口（钝性末端）平端缺口（钝性末端）(Sma）5-5-G GAATTC-3 5-G AATTC-3 AA
6、TTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAA 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5G-5 3-CTTAA G-5+5-5-CTGCACTGCAG-3 5-CTGCA G-3G-3 5-CTGCA G-33-G3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5ACGTC-5 3-G ACGTC-5+5-5-CCCCCCGGG-3 5-CCC GGG-3GGG-3 5-CCC GGG-33-GGG3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5CCC-5 3-GGG CCC-5+切割方式：切割方式：对对dsDNA 2条链同时切割产生条链同时切割产生3种种不同缺口不同缺口13 催化催化DNADN
7、A中相邻的中相邻的55端磷酸基和端磷酸基和3-3-OHOH末端之间形成末端之间形成3535磷酸二酯键。磷酸二酯键。大肠杆菌连接酶大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，只能连接粘性末端，T4T4噬菌体连接酶噬菌体连接酶不不但能连接粘性末端，但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。还能连接齐平末端。ACG-OH P-AATTCGTTACTTAA-P OH-GCA -ACGAATTCGT-TGCTTAAGCA14具有具有5353聚合活性、聚合活性、5353外切酶活性、外切酶活性、3535外切酶活性。外切酶活性。可用于合成双链可用于合成双链cDNAcDNA分子或片断连接，探针制备，序列分析等。分子或片断连接，
8、探针制备，序列分析等。（1 1）耐热）耐热TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 最适反应温度为最适反应温度为75758080 具有具有5353外切酶活性，不具有外切酶活性，不具有3535外切酶活性外切酶活性（3 3）T4 DNAT4 DNA聚合酶：主要用于聚合酶：主要用于DNADNA的末端的标记。的末端的标记。（4 4）T7 DANT7 DAN聚合酶聚合酶 长模板长模板DNADNA引物的延伸反应，标记引物的延伸反应，标记DNADNA。（2 2）逆转录酶）逆转录酶15（5 5）DNADNA聚合酶聚合酶大片段（大片段（Klenow Klenow 片段）片段）为为DNADNA聚合酶聚合酶I I用
9、枯草杆菌蛋白酶裂解后产生的大片段，分用枯草杆菌蛋白酶裂解后产生的大片段，分子量为子量为76 76 kDkD，这个片段也称为这个片段也称为KlenowKlenow片段片段（Klenow Klenow fragmentfragment）它除了保留它除了保留5353聚合酶活性及聚合酶活性及3535外切酶活性外，外切酶活性外，失去了失去了5353外切酶活性。外切酶活性。常用于常用于cDNAcDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA DNA 33端标记等。端标记等。16 （1 1）5 5端标记端标记 （2 2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体
10、自身 连接，提高重组效率。连接，提高重组效率。碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAPBAP）和牛小肠碱性磷酸和牛小肠碱性磷酸 酶（酶（CIPCIP）。）。CIPCIP能在能在 1%1%SDSSDS溶液中溶液中68 68 加热加热15 15 minmin而而 失活，故失活，故CIPCIP较为常用。较为常用。去除去除DNA、RNA、dNTP和和NTP 5端的磷酸根。端的磷酸根。17催化单脱氧核苷酸转移到催化单脱氧核苷酸转移到DNA3-DNA3-端羟基上。端羟基上。应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。催化多聚核苷酸催化多
11、聚核苷酸55羟基末端磷酸化。羟基末端磷酸化。用途：用途：放射性标记放射性标记DNADNA的的55端端 使缺少使缺少5-5-磷酸基的磷酸基的DNADNA磷酸化用于连接反应。磷酸化用于连接反应。单链核酸内切酶，降解单链单链核酸内切酶，降解单链DNADNA或或RNARNA。18第四节第四节 重组重组DNADNA技术常用载体技术常用载体19 是指能携带目的基因进入宿主细胞进行是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增扩增和和表达表达的一的一类类DNADNA分子。分子。分类：分类：克隆载体：克隆载体：用于在宿主细胞中用于在宿主细胞中克隆克隆和和扩增扩增外外 源源DNADNA片段。片段。表达载体：表达载体：用
12、于在宿主细胞中获得外源基因用于在宿主细胞中获得外源基因 表达表达产物。产物。201 1、具备复制能力。、具备复制能力。2 2、具备一个或多个筛选标志。、具备一个或多个筛选标志。3 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。4 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位 点，点，MCSMCS）。）。5 5、具有较高的遗传稳定性。、具有较高的遗传稳定性。21 这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一予一些
13、新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。的限制酶切点等。质粒质粒DNADNA、噬菌体、噬菌体DNADNA、病毒、病毒DNADNA、酵母、酵母DNADNA221 1、质粒（、质粒（plasmidplasmid）:质粒为细菌染色体之外一些能质粒为细菌染色体之外一些能独立复制独立复制并保持并保持稳定遗传稳定遗传的的复制子。结构上，它是一种复制子。结构上，它是一种双链闭合环状双链闭合环状的的DNADNA分子分子。23pBR322pBR322质粒载体质粒载体相对分子质量小，相对分子质量小，长度为长度为4.34.3kbkb。含有氨苄青霉素和四环素的抗性含有氨苄青霉素和四环素的抗性基因基因
14、(AmpAmpr r和和TetTetr r)。有有2424种限制性内切酶位点。种限制性内切酶位点。有一个复制起始点（有一个复制起始点（oriori）及与及与DNADNA复制有关的序列，赋予该质粒复制有关的序列，赋予该质粒复制子特性。复制子特性。为松弛型复制子。为松弛型复制子。24 是感染细菌的一类病毒，是感染细菌的一类病毒，寄生于细菌中，并能溶解细菌寄生于细菌中，并能溶解细菌细胞，故称噬菌体。细胞，故称噬菌体。2 2、噬菌体（、噬菌体（bacteriophage,phagebacteriophage,phage)25噬噬菌菌体体生生活活周周期期26274 4、病毒、病毒3 3、酵母、酵母酵母人
15、工染色体（酵母人工染色体（YACYAC）：用于大片段：用于大片段DNADNA的克隆。的克隆。28第五节第五节 重组重组DNADNA技术技术29目的基因的获取目的基因的获取重组重组DNADNA导入受体菌导入受体菌目的基因与载体目的基因与载体连接连接成重组成重组DNADNA克隆载体的选择克隆载体的选择重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 30（1 1）化学合成：）化学合成：已知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列或或根据基因产物的氨基酸序根据基因产物的氨基酸序列推导出相应基因列推导出相应基因DNADNA碱基序列。碱基序列。目前使用目前使用DNADNA合成仪合成的片段长度有限
16、，一般用于小合成仪合成的片段长度有限，一般用于小分子活性多肽基因的合成，较长的链则须分段合成，然后用分子活性多肽基因的合成，较长的链则须分段合成，然后用连接酶加以连接。连接酶加以连接。31（2 2）构建基因组）构建基因组DNADNA文库：文库：将某种生物细胞的将某种生物细胞的整个基整个基因组因组DNADNA用物理或酶学的方法用物理或酶学的方法切割成预期大小的切割成预期大小的片断片断，并将，并将所有这些片断都与适当的载体所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。保存和扩增。理论上讲，这些重组载体理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基上带有了
17、该生物体的全部基因，称为因，称为基因文库基因文库。32(3)(3)构建构建cDNAcDNA文库：文库：33(5)(5)直接用限制性内切酶切取、分离：直接用限制性内切酶切取、分离：对一些物理图谱已经确定，背景资料清楚的对一些物理图谱已经确定，背景资料清楚的原核生物、噬菌体及病毒等基因组，可直接用限原核生物、噬菌体及病毒等基因组，可直接用限制性内切酶消化后，通过分离获得目的基因。制性内切酶消化后，通过分离获得目的基因。(4)(4)聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）已知目的基因的基因序列，用已知目的基因的基因序列，用PCRPCR从基因组从基因组DNADNA中获得目的基因，或用逆转录中获得目的
18、基因，或用逆转录PCRPCR方法直接从方法直接从mRNAmRNA获得特定基因的获得特定基因的cDNAcDNA。34 用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的噬菌体噬菌体和黏性质粒；和黏性质粒；cDNAcDNA文库和克隆较小文库和克隆较小DNADNA片段通常选片段通常选pUCpUC系列质粒；系列质粒；待测待测DNADNA序列使用序列使用M13M13噬菌体。噬菌体。35 由同一种限制酶切由同一种限制酶切割或不同的限制酶切割割或不同的限制酶切割形成形成互补的黏性末端互补的黏性末端。经退火后，由经退火后，由DNADNA连接连接酶连接。酶连接。粘性末端连接：粘
19、性末端连接：36 平端平端 DNADNA片段可以在片段可以在T4 DNAT4 DNA连接酶的作用连接酶的作用下相连接，但连接效率较低。为提高连接效率下相连接，但连接效率较低。为提高连接效率,所用的所用的ATPATP及及T4 DNAT4 DNA连接酶的浓度比粘性末端连接酶的浓度比粘性末端连接要高些。连接要高些。（2 2）平端连接）平端连接：37（3 3）定向连接：）定向连接：Eco Eco RR切割位点切割位点BgBg ll切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4T4 DNADNA连接酶连接酶重组体重组体38（4 4）同聚物加尾连接：）同聚物加尾连接：
20、39（5 5）人工接头连接：）人工接头连接：接头接头是指含有某些是指含有某些限制性内切酶切点的寡限制性内切酶切点的寡核苷酸片段。核苷酸片段。CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R40将重组将重组DNADNA或其他外源或其他外源DNADNA导入宿主细胞的常用方法：导入宿主细胞的常用方法：转化、感染、转染、显微注射、电穿孔等。转化、感染、转染、显微注射、电穿孔等。转化（转化（transformationtransformation）：是指将重组质粒是指将重组质粒DNADNA导入受体细胞。导入受体细胞。转转染染（transfectiontransfection）：将将重重组组噬噬菌
21、菌体体DNADNA直直接接引引入入受受体体细细胞胞的过程。的过程。转导（转导（transductiontransduction）：重组噬菌体重组噬菌体DNADNA分子，在体外经过包分子，在体外经过包装成具有感染能力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为载体，将装成具有感染能力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为载体，将重组重组DNADNA导入受体细胞内的过程，也称为感染（导入受体细胞内的过程，也称为感染（infection）。）。41 筛选是指通过某些特定方法，从被转化的细筛选是指通过某些特定方法，从被转化的细胞群体或基因文库中，鉴别出真正的阳性重组子胞群体或基因文库中，鉴别出真正的阳性重组子的过程。的过程。4
22、2 （一）根据遗传表型进行筛选的方法（一）根据遗传表型进行筛选的方法 （1 1）抗生素抗性筛选）抗生素抗性筛选 （2 2）-半乳糖苷酶系统筛选半乳糖苷酶系统筛选（二）（二）根据重组子结构特征进行筛选的方法根据重组子结构特征进行筛选的方法方法：方法：43（1 1）抗生素抗性筛选）抗生素抗性筛选:大多数载体均带有抗生素抗性基因大多数载体均带有抗生素抗性基因b.b.插入失活法插入失活法:外源基因插入到一个抗性基因位点，使外源基因插入到一个抗性基因位点，使 此种抗生素抗性消失，重组体转化的细菌不能在含有此种抗生素抗性消失，重组体转化的细菌不能在含有 这种抗生素的培养基中生长。这种抗生素的培养基中生长。
23、a.a.构建重组体时，保留了抗性基因活性，所转化的细胞构建重组体时，保留了抗性基因活性，所转化的细胞 就能在含此种抗生素的培养基中生长就能在含此种抗生素的培养基中生长,未转化的细胞未转化的细胞 则不能生长。则不能生长。44(插插入入失失活活法法)抗抗生生素素抗抗性性筛筛选选45（2 2）-半乳糖苷酶系统筛选半乳糖苷酶系统筛选4647（1 1）快速裂解菌落并鉴定分子大小）快速裂解菌落并鉴定分子大小（2 2）内切酶酶切图谱鉴定）内切酶酶切图谱鉴定（3 3）分子杂交）分子杂交（4 4）PCRPCR（5 5）核酸序列测定）核酸序列测定48原原位位杂杂交交49（一）（一）原核表达体系原核表达体系 （E.
24、coliE.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）利用利用原核细胞原核细胞（大肠杆菌为主）作受体细胞，经培养、（大肠杆菌为主）作受体细胞，经培养、诱导表达外源目的基因。诱导表达外源目的基因。50（二）真核表达体系（二）真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）利用利用真核细胞真核细胞作为受体细胞，诱导表达外源基因作为受体细胞，诱导表达外源基因51（1 1）分分离离：提取和：提取和获得目的基因获得目的基因和载体和载体（2 2）切切割割：分别对：分别对目的基因目的基因和载体和载体DNADNA 酶切；酶切；（3 3）连连接接：目的基因与载体连接，形成目的基因与载体连接，形成 新的重组新的重组 DNADNA分子；分子；（4 4）转转化化：用重组用重组DNADNA分子转化受体细分子转化受体细 胞胞；（5 5）筛筛选选：筛选筛选转化成功的细胞克隆转化成功的细胞克隆（6 6）表表达：达：培养获得外源基因的细胞或培养获得外源基因的细胞或 生物体，获得所需的遗传性生物体，获得所需的遗传性 状或表达出所需要的产物。状或表达出所需要的产物。小结：小结：52第六节第六节 重组重组DNADNA技术的在医学上的应用技术的在医学上的应用 （自学）（自学）53谢谢 谢谢！