《《重组DNA技术交》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《重组DNA技术交》PPT课件.ppt（59页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第十四章第十四章 重组重组DNA技术技术主讲教师：张涛主讲教师：张涛重组重组DNA技术的发展简史技术的发展简史l1865年年 的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验l1944年年 的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验l1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子分子l1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医技术制造医学上重要的药物。学上重要的药物。l1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛技术
2、生产胰岛素的工厂素的工厂l1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉英国罗林研究所成功的克隆了多莉第一节第一节 重组重组 DNA技术的相关概念技术的相关概念lDNA克隆克隆l工具酶工具酶l目的基因目的基因l基因载体基因载体l宿主细胞宿主细胞一、一、克隆克隆l克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即，即无性繁殖无性繁殖。l技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动
3、物或植物）lDNA克隆克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的接合成一具有自我复制能力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而通过转化或转，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称分子，也称基因克隆基因克隆或重组或重组DNA(recombinant DN
4、A)。l重组重组DNA技术技术 实现实现DNA克隆所采用的方法及相关的工作统称为克隆所采用的方法及相关的工作统称为重组重组DNA技术或重组技术或重组DNA工艺学工艺学(recombinant DNA biotechnology)，又称为基因工程（遗传工程）。，又称为基因工程（遗传工程）。二、工具酶l 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶l DNA连接酶连接酶l 碱性磷酸酶碱性磷酸酶l DNA聚合酶聚合酶l 末端转移酶末端转移酶l Taq DNA聚合酶聚合酶l 反转录酶反转录酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切
5、割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基合成双链切除末端磷酸基合成双链DNA聚合酶聚合酶cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活
6、外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义定义限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列,并在识别位点或其并在识别位点或
7、其周围切割双链周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGl分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）l 作用作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身保护自身DNA。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属
8、属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GCGCA AT TGCGCCGCGT TA ACGCGNcoCGGTACCATGG C+CCATGGGGTACCHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口GTCCAG同功异源酶同功异源酶来来源源不不同同，但但能能识识别别和和切切割割同同一一位位点点的的限限制制酶酶，称称为为同同功功异异源源酶酶。（来来源源不不同同的的同
9、同一一种种限限制制性内切酶）性内切酶）GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割割DNA，产生相同的粘性末端，称为，产生相同的粘性末端，称为同尾酶同尾酶。这两。这两个相同的粘性末端称为个相同的粘性末端称为配伍未端配伍未端(compatible end)。同尾酶同尾酶Bam Bam Bam HHHBg Bg Bg lll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT
10、 A同裂酶（同裂酶（isoschizomer）识别同一序列，但切割位置不同，这类酶互称识别同一序列，但切割位置不同，这类酶互称为同裂酶（为同裂酶（isoschizomer）。）。XmaXma Sma Sma CCCGGG GGGCCC CCCGGG GGGCCCCGGGCC CCGGG C+CCCGGG GGG CCC第二节第二节 重组重组 DNA技术的基本原理技术的基本原理一、基本程序一、基本程序目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质
11、 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程二、重组二、重组DNA技术步骤技术步骤1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列组织或细胞染色体
12、组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合 从基因组从基因组DNA文库获取目的基因文库获取目的基因mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚
13、合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1.1.粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点
14、点连连接接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。2.平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C载体自连载体自连目的基因目的基因
15、 自连自连重组体重组体3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)
16、nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体4.4.人工接头人工接头(linker)连接连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接除产生粘性末端，而进行粘端连接。人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent)导入方式导入方式转化转化(transformation)转染转染(transfection)感染感染(infection
17、)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1.直接选择法直接选择法 (1)抗药性标记选择抗药性标记选择 (2)标志补救标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法分子杂交法 原位杂交原位杂交 Southern印迹印迹 2.免疫学方法免疫学方法 如免疫化学方法及酶联免疫检测分析等如免疫化学方法及酶联免疫检测分析等(插插入入失失活活法法)抗抗药药性性标标记记选选择择组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成DNADNA重组体重组体标标志
18、志补补救救 互补互补 互互补补的的检检测测原原位位杂杂交交Southern印迹印迹鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为：小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的
19、基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达1.原核表达体系原核表达体系（表达体系最为常用）（表达体系最为常用）标准：标准：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加
20、工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染DEAEDEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显
21、微注射显微注射 2.真核表达体系真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）酵母、昆虫、乳类动物细胞）表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱一、疾病基因的发现与克隆一、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。二、生二、生物制药物制药第三节第三节 重组重组 DNA技术与医学的关系技术与医学的关系 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞
22、生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌
23、苗预防霍乱预防霍乱基基因因诊诊断断(genetic diagnosis)是利利用用分分子子生生物物学学及及分分子子遗遗传传的的技技术术和和原原理理，在在DNA水水平平分分析析、鉴鉴定定遗遗传传疾疾病病所所涉涉及及基基因因的的置置换换、缺缺失或插入等突变。失或插入等突变。三、基因诊断三、基因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断标准标准.能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自
24、动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。四、基因治疗四、基因治疗定义定义 基基因因治治疗疗(gene therapy)是是向向有有功功能能缺缺陷陷 的的细细胞胞补补充充相相应应功功能能的的基基因因，以以纠纠正正或或补补偿偿 其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗(germ line gene therapy)1.产前诊断产前诊断2.携带者测试携带者测试3.症候前诊断症候前诊断4.遗传病易感性遗传病易感性五、遗传疾病的预防五、遗传疾病的预防1.
25、什么是什么是DNA克隆？什么是限制性核酸内克隆？什么是限制性核酸内切酶？切酶？l 应用酶学的方法，在体外将各种来源的应用酶学的方法，在体外将各种来源的DNA与与载体载体DNA接合成一具有自我复制能力的接合成一具有自我复制能力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一增提取获得大量同一DNA分子，就称分子，就称为为DNA克隆也克隆也称为基因克隆称为基因克隆 。l 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuc
26、lease,RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列,并在识并在识别位点或其周围切割双链别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。【思考题】【思考题】2.什么是基因组文库？什么是什么是基因组文库？什么是cDNA文库文库？l采用物理方法或限制性核酸内切酶将染色体采用物理方法或限制性核酸内切酶将染色体DNA切割，切割，继而将所获得的片段与适当克隆载体连接，将重组继而将所获得的片段与适当克隆载体连接，将重组DNA转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色
27、体DNA片段就涵盖了基因组全部信息，这个携带所有基片段就涵盖了基因组全部信息，这个携带所有基因组因组DNA的集合即称为基因组文库。的集合即称为基因组文库。l以细胞以细胞mRNA为模板，利用反转录酶合成与为模板，利用反转录酶合成与mRNA互互补的补的DNA，再复制成双链，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增后可获得含有相应接后转入受体菌，扩增后可获得含有相应cDNA的大的大量克隆，这些克隆就构成了量克隆，这些克隆就构成了cDNA文库。文库。3.重组重组DNA过程中所需要的酶主要有哪些？过程中所需要的酶主要有哪些？限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 DNA聚合酶聚合酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶 反转录酶反转录酶4.重组重组DNA技术的基本步骤有哪技术的基本步骤有哪些？些？分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 5.重组重组DNA技术在医学上有哪些应用？技术在医学上有哪些应用？进行致病基因的发现进行致病基因的发现进行疾病的分子诊断进行疾病的分子诊断进行基因治疗进行基因治疗用于发展生物制药用于发展生物制药