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1、微生物与免疫学试验（二）微生物与免疫学试验（二）实验内容实验内容1、录像：免疫标记技术、录像：免疫标记技术2、介绍：血清学反应、介绍：血清学反应3、示教：单扩、双扩、火箭电泳、示教：单扩、双扩、火箭电泳、对流免疫电泳、淋转、对流免疫电泳、淋转、E花环花环4、操作：玻片凝集、操作：玻片凝集血清学反应血清学反应抗原与相应抗体相遇可发生抗原与相应抗体相遇可发生特异性结合，在外界条件影响特异性结合，在外界条件影响下呈现肉眼可见的反应。实验下呈现肉眼可见的反应。实验所用抗体通常存在于血清中，所用抗体通常存在于血清中，故名。故名。1)1)特异性特异性2)2)可逆性可逆性3)3)结合物的可见性与结合物的可见
2、性与带现象带现象 前带现象：抗体过剩前带现象：抗体过剩 后带现象：抗原过剩后带现象：抗原过剩 比例适当：较大的晶格状比例适当：较大的晶格状 免疫复合物免疫复合物特点特点（抗原抗体反应的特点）抗原抗体反应的特点）抗原抗体反应的影响因素抗原抗体反应的影响因素 浓度与比例浓度与比例 电解质电解质 温度温度 酸碱度酸碱度血清学反应的种类血清学反应的种类 1）凝集反应（）凝集反应（agglutination）2）沉淀反应（）沉淀反应（precipitation）3）补体结合试验（）补体结合试验（complement fixation test,CFT）4）中和反应（）中和反应（neutralizatio
3、n）5）免疫标记技术）免疫标记技术抗原的分类与抗原抗体反应的分类抗原的分类与抗原抗体反应的分类颗粒性抗原颗粒性抗原 凝集反应凝集反应可溶性抗原可溶性抗原 沉淀反应沉淀反应（一）凝集反应（一）凝集反应 颗粒性抗原颗粒性抗原 可溶性抗原载体（与免疫无关）可溶性抗原载体（与免疫无关）直接凝集反应：玻片法：定性，测抗原直接凝集反应：玻片法：定性，测抗原 试管法（肥达试验）：半定量，测抗体试管法（肥达试验）：半定量，测抗体间接凝集反应间接凝集反应间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验（二）沉淀反应（二）沉淀反应概念：可溶性抗原概念：可溶性抗原+抗体抗体 沉淀物沉淀物单向琼脂扩散、火箭电泳：抗原定量试验单向琼脂
4、扩散、火箭电泳：抗原定量试验 抗体琼脂板、抗原扩散（自由、定向）抗体琼脂板、抗原扩散（自由、定向）双向琼脂扩散、对流免疫电泳：抗原分析、双向琼脂扩散、对流免疫电泳：抗原分析、抗原定性试验等抗原定性试验等 抗原、抗体同时扩散（自由、定向）抗原、抗体同时扩散（自由、定向）单向琼脂扩散单向琼脂扩散单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验是一种定量试验。是一种定量试验。将一定量已知抗体混于琼脂中，制板，在适当将一定量已知抗体混于琼脂中，制板，在适当位置打孔，将抗原加入孔中扩散，与板中抗体位置打孔，将抗原加入孔中扩散，与板中抗体相遇，在比例合适处呈现白色沉淀环，环的直相遇，在比例合适处呈现白色沉淀环，环的直径与
5、抗原含量成正比。径与抗原含量成正比。主要用于测定血清各种主要用于测定血清各种Ig和补体成分的含量和补体成分的含量单向定量免疫电泳（火箭电泳）单向定量免疫电泳（火箭电泳）将一定量已知抗体混于琼脂中，制板，在板的一端将一定量已知抗体混于琼脂中，制板，在板的一端打一排小孔，加入待检样品，置于阴极端进行电泳。打一排小孔，加入待检样品，置于阴极端进行电泳。抗原在泳动过程中与抗体在比例合适部位形成锥形抗原在泳动过程中与抗体在比例合适部位形成锥形沉淀峰，状如火箭，称火箭电泳。沉淀峰的高低与沉淀峰，状如火箭，称火箭电泳。沉淀峰的高低与抗原的浓度成正比。抗原的浓度成正比。敏感度与单扩相仿，但需时较短。敏感度与单
6、扩相仿，但需时较短。双向琼脂扩散双向琼脂扩散在琼脂板上打孔，抗原和抗体分别加到相在琼脂板上打孔，抗原和抗体分别加到相应孔中，二者自由向四周扩散，在比例合应孔中，二者自由向四周扩散，在比例合适处形成沉淀线。若同时含有若干对抗原适处形成沉淀线。若同时含有若干对抗原抗体系统，可出现多条沉淀线。抗体系统，可出现多条沉淀线。可用于分析和鉴定标本中多种抗原成分可用于分析和鉴定标本中多种抗原成分对流免疫电泳对流免疫电泳打孔：打孔：金属打孔器打两排孔，抗原孔与抗体孔间距金属打孔器打两排孔，抗原孔与抗体孔间距离为离为4毫米至毫米至5毫米。毫米。加样：抗血清加于抗体孔内；待测抗原、阳性、阴加样：抗血清加于抗体孔内
7、；待测抗原、阳性、阴性对照抗原分别加于抗原孔内性对照抗原分别加于抗原孔内电泳：将琼脂板置电泳槽，抗原孔置阴极端，抗体电泳：将琼脂板置电泳槽，抗原孔置阴极端，抗体孔置阳极端。板两端分别用湿纱布与缓冲液相连，孔置阳极端。板两端分别用湿纱布与缓冲液相连，通电通电30分钟。分钟。结果：结果：在相应抗原、抗体孔间出现沉淀线。在相应抗原、抗体孔间出现沉淀线。（三）补体结合试验（三）补体结合试验l方法：方法：待检系统：待检系统：Ag（未知）（未知）+Ab（已知）（已知）+补体补体 指示系统：绵羊红细胞（指示系统：绵羊红细胞（Ag）溶血素（）溶血素（Ab）l结果：溶血结果：溶血阴性阴性 不溶血不溶血阳性阳性（
8、四）中和反应（四）中和反应（neutralization）病毒中和试验病毒中和试验毒素中和试验毒素中和试验（五）免疫标记技术（五）免疫标记技术 将已知抗体或抗原标记显示性物质，通过检测标将已知抗体或抗原标记显示性物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。抗原或抗体。常用的标记物有：酶、荧光素、放射性同位素、常用的标记物有：酶、荧光素、放射性同位素、胶体金等胶体金等淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验转化百分率正常值为转化百分率正常值为70%左右左右分裂相：即染色体型分裂相：即染色体型母细胞：大母细胞：大4-5倍；核质疏松
9、，有倍；核质疏松，有1-3个核仁；个核仁；核周透明区；胞浆有空泡核周透明区；胞浆有空泡过渡型：略大；核质略疏松；着色较淡过渡型：略大；核质略疏松；着色较淡小淋巴细胞：核质致密；着色深；胞浆少小淋巴细胞：核质致密；着色深；胞浆少E玫瑰花环试验玫瑰花环试验T细细胞胞表表面面有有绵绵羊羊红红细细胞胞受受体体，可可在在自自然然情情况况下下与与绵绵羊羊红红细细胞胞结结合合，形形成成E玫玫瑰瑰花花环环，由由此此可区分可区分T淋巴细胞与淋巴细胞与B淋巴细胞。淋巴细胞。直接凝集反应直接凝集反应玻片凝集玻片凝集材料：玻片1张/1人，1号、2号菌落，生理盐水，诊断血清，接种环方法：取生理盐水34环，菌落12环，后加血清2环 轻摇玻片，轻摇玻片，12分钟后观察分钟后观察结果判定：出现乳白色凝集块属阳性反应*玻片扔在后面的玻片缸里生理盐水 1号菌落生理盐水+1号菌落诊断血清实验报告实验报告六张图：单扩、火箭电泳、双扩、六张图：单扩、火箭电泳、双扩、对流免疫电泳、淋转、对流免疫电泳、淋转、E花环花环原理及结果：玻片凝集（结果可用图示）原理及结果：玻片凝集（结果可用图示）