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1、微生物实验二微生物实验二(2)1内内 容容 提提 要要 一一.内毒素（内毒素（LPSLPS）的检测）的检测 二二.肠道致病菌的分离培养肠道致病菌的分离培养 三三.细菌在自然界的分布及理化因素对细菌生长的影响细菌在自然界的分布及理化因素对细菌生长的影响v方法：方法：（每（每4个人一组，两支鲎试剂，一支实验一支对照）个人一组，两支鲎试剂，一支实验一支对照）1.1.取两支鲎试剂打开，分别加入取两支鲎试剂打开，分别加入0.1ml 0.1ml 鲎试剂溶鲎试剂溶解水，使之溶解解水，使之溶解 2.2.其中一支加入其中一支加入0.1ml0.1ml内毒素，标记上实验组，内毒素，标记上实验组，另一支加入另一支加入
2、0.1ml0.1ml溶解水，作为对照溶解水，作为对照 3.3.垂直放入垂直放入3737温箱，温箱，20-3020-30分钟观察结果分钟观察结果v结果：结果：实验组出现凝固，对照组不出现凝固实验组出现凝固，对照组不出现凝固v内毒素检测的应用：内毒素检测的应用：v （1 1）检测输液用品或生物制品中是否检测输液用品或生物制品中是否v 含有内毒素含有内毒素v （2 2）临床上检测患者是否有革兰氏阴性临床上检测患者是否有革兰氏阴性v 菌感染引起的内毒素血症（内毒素菌感染引起的内毒素血症（内毒素v 休克）等休克）等二二.肠道致病菌的分离培养肠道致病菌的分离培养2学时学时 一一.常见培养基的特性及用途常见
3、培养基的特性及用途二二.致病性肠道杆菌的生物学性状致病性肠道杆菌的生物学性状三三.分离培养方法分离培养方法 肠道细菌的分离培养肠道细菌的分离培养一、培养基一、培养基 概念概念:是人工配制的专供微生物生长繁殖的混合营养物是人工配制的专供微生物生长繁殖的混合营养物 制品。制品。成分：成分：充足的营养物质（水分、碳源、氮源、无机充足的营养物质（水分、碳源、氮源、无机 盐）；合适的盐）；合适的 PH PH，适宜的温度；适宜的气体，适宜的温度；适宜的气体 环境。环境。用途：用途：用于微生物的繁殖及分离接种，传代或保存，用于微生物的繁殖及分离接种，传代或保存，鉴别微生的类属，研究微生物的生理及生化特鉴别微
4、生的类属，研究微生物的生理及生化特 性，制造菌苗、疫苗或其他微生物制剂等。性，制造菌苗、疫苗或其他微生物制剂等。二、分类主要用于增菌用于检测动力及保存菌种用于分离鉴定细菌双糖铁培养基S-S培养基普通琼脂培养基血液琼脂培养基 庖肉培养基培养基的制备程序培养基的制备程序v调配调配 过滤过滤 矫正矫正pH（7.0-7.6）分装过滤分装过滤 灭菌（灭菌（121.3，20-30分钟）分钟）鉴定是否有菌鉴定是否有菌 放入冰放入冰箱冷藏备用箱冷藏备用v因高压之后因高压之后pH值会下降值会下降0.1左右，所以矫正左右，所以矫正pH时应比所需的时应比所需的pH高高v鉴定是否有菌可将培养基置于鉴定是否有菌可将培养
5、基置于37 培养培养24小小时，然后观察时，然后观察肉汤培养基制作方法肉汤培养基制作方法v1.将已去筋膜及脂肪并经绞碎的鲜牛肉将已去筋膜及脂肪并经绞碎的鲜牛肉50克，克，加蒸馏水加蒸馏水100ml，放入冰箱中过夜。，放入冰箱中过夜。v2.加热煮沸半小时至一小时后，用数层纱布加热煮沸半小时至一小时后，用数层纱布或滤纸过滤，或滤纸过滤，滤液用蒸馏水补足其量为滤液用蒸馏水补足其量为100 ml。v3.于滤液中加入氯化钠于滤液中加入氯化钠0.5克，蛋白胨克，蛋白胨1克，克，磷酸氢二钾磷酸氢二钾0.1克，加热使之完全溶化。克，加热使之完全溶化。v4.测定酸碱度并测定酸碱度并调至调至pH7.6，必要时用滤
6、纸过必要时用滤纸过滤。滤。v5.按需要分装于试管或烧瓶内，加棉塞，置按需要分装于试管或烧瓶内，加棉塞，置高压蒸汽灭菌器内，高压蒸汽灭菌器内，经经121.3、20-30分钟分钟灭菌。灭菌。v6.灭菌后置灭菌后置37温箱孵育温箱孵育24小时，小时，无杂菌生无杂菌生长，长，即可应用或放冰箱备用。即可应用或放冰箱备用。v液体培养基加入液体培养基加入1-2%的琼脂为固体培养基，的琼脂为固体培养基，加入加入0.5%琼脂为半固体培养基。固体培养基琼脂为半固体培养基。固体培养基加入血液即为血平板（营养培养基）。加入血液即为血平板（营养培养基）。血液琼脂培养基（血平板血液琼脂培养基（血平板）v在普通琼脂培养基的
7、基在普通琼脂培养基的基础上础上加入血液加入血液制备而成制备而成,是最常用的营养培养基是最常用的营养培养基,可供营养要求较高的细可供营养要求较高的细菌生长菌生长.v常用于分离培养常用于分离培养和溶血和溶血现象观察现象观察.v含有胆酸盐抑制含有胆酸盐抑制G+,G+,枸橼酸钠和煌枸橼酸钠和煌绿能抑制大肠杆菌绿能抑制大肠杆菌,致病的沙门菌和志致病的沙门菌和志贺菌能大量生长贺菌能大量生长.v含有中性红指示剂含有中性红指示剂和乳糖和乳糖,中性红遇中性红遇酸变粉红酸变粉红.v常用于培养肠道致常用于培养肠道致病菌病菌.SSSS培养基培养基（Salmonella-Shigella MediunSalmonell
8、a-Shigella Mediun）SS培养基培养基肠道杆菌的生物学性状肠道杆菌的生物学性状埃希菌属：大肠埃希菌埃希菌属：大肠埃希菌沙门菌属：伤寒沙门菌沙门菌属：伤寒沙门菌 甲型、乙型副伤寒沙门菌甲型、乙型副伤寒沙门菌志贺菌属：痢疾志贺菌志贺菌属：痢疾志贺菌肠杆菌科重要菌属及代表菌种肠杆菌科重要菌属及代表菌种1 大肠杆菌大肠杆菌:生物学性状生物学性状:G-镜下为杆状，镜下为杆状，多数菌株有周鞭毛，菌毛，多数菌株有周鞭毛，菌毛，无芽孢，兼性厌氧无芽孢，兼性厌氧 营养要求不高营养要求不高,可在普通琼可在普通琼脂培养基上生长，发酵葡萄脂培养基上生长，发酵葡萄糖等糖等,产酸产气产酸产气 最适宜温度为最
9、适宜温度为37度度,最适宜最适宜pH为为7.4肠道杆菌的生物学性状肠道杆菌的生物学性状菌落特点：菌落特点：v 圆形，凸起，灰白色，表面光滑，湿润，直径2-3mm肠产毒型大肠杆菌（轻度腹泻，肠毒素，肠产毒型大肠杆菌（轻度腹泻，肠毒素，定植因子）定植因子）肠侵袭型大肠杆菌（与志贺菌相关，与菌痢相似肠侵袭型大肠杆菌（与志贺菌相关，与菌痢相似 里急后重，里急后重，不产生肠毒素）不产生肠毒素）肠致病型大肠杆菌（最早发现的引起腹泻的肠致病型大肠杆菌（最早发现的引起腹泻的 大肠杆菌，婴幼儿）大肠杆菌，婴幼儿）肠出血型大肠杆菌（出血性结肠炎和溶血性肠出血型大肠杆菌（出血性结肠炎和溶血性 尿毒综合征的病原体，尿
10、毒综合征的病原体，轻轻 度水泻伴剧烈腹痛血便，度水泻伴剧烈腹痛血便，常见食品污染）常见食品污染）肠集聚型大肠杆菌（婴儿和旅行者持续水样腹泻肠集聚型大肠杆菌（婴儿和旅行者持续水样腹泻 偶有血便，不侵袭细胞，偶有血便，不侵袭细胞，在细胞表面自动聚集，形成在细胞表面自动聚集，形成 砖样排列）砖样排列）分类：（胃肠炎）分类：（胃肠炎）（2）伤寒杆菌）伤寒杆菌v生物学特性生物学特性:G-G-v镜下为镜下为杆状杆状,有菌毛，除个有菌毛，除个别外都有周鞭毛，一般无荚别外都有周鞭毛，一般无荚膜，均无芽孢。膜，均无芽孢。v兼性厌氧，兼性厌氧，营养要求不高营养要求不高,不发酵乳糖或者蔗糖，对葡不发酵乳糖或者蔗糖，
11、对葡萄糖，麦芽糖，甘露糖发酵，萄糖，麦芽糖，甘露糖发酵，产酸不产气，其他沙门菌产产酸不产气，其他沙门菌产酸产气，可在普通琼脂培养酸产气，可在普通琼脂培养基上生长基上生长v最适宜温度为最适宜温度为3737度度,最适宜最适宜pHpH为为7.47.4v菌落特点菌落特点:v 圆形圆形,凸起凸起,无色，细小，半透明无色，细小，半透明,表面光滑表面光滑,湿润湿润,直径直径2-3mm.2-3mm.1 1、相似的形态染色、相似的形态染色从形态上无法区别从形态上无法区别从形态上无法区别从形态上无法区别 中等大小的中等大小的中等大小的中等大小的G G G G-杆菌杆菌杆菌杆菌 多多多多有有有有鞭鞭鞭鞭毛毛毛毛、菌
12、菌菌菌毛毛毛毛肠道杆菌的生物学性状肠道杆菌的生物学性状2 2、活泼的生化反应、活泼的生化反应肠道杆菌的生物学性状肠道杆菌的生物学性状乳糖发酵试验乳糖发酵试验初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌肠道致病菌肠道致病菌肠道非致病菌肠道非致病菌多数不发酵乳糖多数不发酵乳糖 多数发酵乳糖多数发酵乳糖肠道杆菌的生物学性状肠道杆菌的生物学性状 -/+-+伤寒杆菌 -+痢疾杆菌 -大肠杆菌硫化氢乳糖葡萄糖菌名v 将粪便标本以分区划线法接种到将粪便标本以分区划线法接种到SSSS培养基。培养基。(每个实验室每个实验室8 8个平板）个平板）(接种好后，做好标记，用胶布按班绑好接种好后，做
13、好标记，用胶布按班绑好)v 放入放入37温箱中培养温箱中培养24小时。取出放小时。取出放4冰冰 箱箱中保存备用。中保存备用。分离培养方法分离培养方法三、消毒灭菌三、消毒灭菌（2 2学时）学时）1.1.细菌在自然界的分布及理化因素细菌在自然界的分布及理化因素 对细菌的影响对细菌的影响2.2.高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法空气中细菌的检查（空气中细菌的检查（每个班每个班1 1个平皿个平皿）原理：原理：根据空气中携带有微生物气溶胶（以固体或液根据空气中携带有微生物气溶胶（以固体或液体微小颗粒分散于空气中的分散体系称为气溶胶，其中的气体微小颗粒分散于空气中的分散体系称为气溶胶，其中的气体是分散介质）粒子
14、在地心引力的作用下，以垂直的自然方体是分散介质）粒子在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到琼脂培养基上。式沉降到琼脂培养基上。方法：方法：在室内选择一处放一个平皿。揭开皿盖，皿盖在室内选择一处放一个平皿。揭开皿盖，皿盖扣置于皿底下，暴露放置扣置于皿底下，暴露放置15min15min，即盖上皿盖，放入，即盖上皿盖，放入37 37 培养培养2424小时，观察结果。小时，观察结果。1.1 1.1 细菌在自然界的分布细菌在自然界的分布v1.2.1紫外线对细菌的影响（紫外线对细菌的影响（每个实验室每个实验室1个培养皿）个培养皿）vv 原理：原理：原理：原理：紫外线主要作用于紫外线主要作用于紫外线主要
15、作用于紫外线主要作用于DNADNADNADNA，使一条，使一条，使一条，使一条DNADNADNADNA链上的两个相链上的两个相链上的两个相链上的两个相邻胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰邻胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰邻胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰邻胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰DNADNADNADNA的复制与的复制与的复制与的复制与转录导致细菌变异或死亡。转录导致细菌变异或死亡。转录导致细菌变异或死亡。转录导致细菌变异或死亡。对病毒也有破坏作用。对病毒也有破坏作用。v 紫外线杀菌作用紫外线杀菌作用强强，而穿透能力，而穿透能力弱弱。普通玻璃普通玻璃、纸张纸张、水蒸
16、气水蒸气、尘埃等均能阻挡。尘埃等均能阻挡。v 紫外线中波长为紫外线中波长为240-300nm240-300nm者具有杀菌能力，其中者具有杀菌能力，其中265-265-266nm266nm的杀菌作用最强。的杀菌作用最强。v 常用于消毒物体表面，手术室无菌实验室，传染病房的常用于消毒物体表面，手术室无菌实验室，传染病房的空气消毒及不耐热物品消毒。空气消毒及不耐热物品消毒。1.21.2理化因素对细菌的影响理化因素对细菌的影响紫外线对细菌的影响紫外线对细菌的影响 取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，然后按图所示揭开平皿盖，置于紫外线下中，然后按图所示揭开平皿
17、盖，置于紫外线下照射照射3030分钟，然后盖好盖子，置分钟，然后盖好盖子，置3737培养培养24h24h后后取出观察结果。取出观察结果。1 1 促进菌体蛋白质变性或凝固。促进菌体蛋白质变性或凝固。2 2 干扰细菌酶系统和代谢。干扰细菌酶系统和代谢。3 3 损伤细菌的细胞膜，影响细菌的化学组成，物理损伤细菌的细胞膜，影响细菌的化学组成，物理 结构和生理活动，从而发挥防腐、消毒至灭菌作用。结构和生理活动，从而发挥防腐、消毒至灭菌作用。1.2.21.2.2化学消毒剂对细菌的影响化学消毒剂对细菌的影响v 有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物，有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物，称为称为化学消毒剂化学
18、消毒剂；v 浓度低时能抑制细菌生长，称为浓度低时能抑制细菌生长，称为防腐剂防腐剂；（只能外用，对细菌的敏感性不同）（只能外用，对细菌的敏感性不同）化学消毒剂对细菌的影响化学消毒剂对细菌的影响化学消毒剂分类v1 1 高效消毒剂：杀灭细菌芽孢在内的所有微生物，适用于不高效消毒剂：杀灭细菌芽孢在内的所有微生物，适用于不 耐热力灭菌但要进入人体内部的物品，如内耐热力灭菌但要进入人体内部的物品，如内 窥镜等。窥镜等。次氯酸钠、过氧化氢、甲醛、环氧乙烷等次氯酸钠、过氧化氢、甲醛、环氧乙烷等v2 2 中效消毒剂：不能杀灭芽孢，但能杀灭繁殖体（包括结核中效消毒剂：不能杀灭芽孢，但能杀灭繁殖体（包括结核 杆菌）
19、，真菌和大多病毒，如喉镜，麻醉器材杆菌），真菌和大多病毒，如喉镜，麻醉器材 碘酊、乙醇等碘酊、乙醇等v3 3 低效消毒剂：能杀灭大多细菌繁殖体，但不能杀灭芽孢，低效消毒剂：能杀灭大多细菌繁殖体，但不能杀灭芽孢，结核杆菌及某些抵抗力强的真菌和病毒。结核杆菌及某些抵抗力强的真菌和病毒。新洁尔灭、洗必泰、高锰酸钾等新洁尔灭、洗必泰、高锰酸钾等影响消毒灭菌的因素影响消毒灭菌的因素v1 1 微生物的种类微生物的种类v2 2 微生物的污染程度微生物的污染程度v3 3 环境中的有机物环境中的有机物v4 4 消毒剂的性质、浓度与作用时间消毒剂的性质、浓度与作用时间v5 5 温度、湿度、酸碱度温度、湿度、酸碱度
20、v6 6 化学拮抗物化学拮抗物化学消毒剂对细菌的影响化学消毒剂对细菌的影响方法方法：取一普通平皿培养基，取一普通平皿培养基，一部分写上一部分写上“前前”，另一部分，另一部分写上写上“后后”，然后将手指在写，然后将手指在写有有“前前”的部分沾一下，再将的部分沾一下，再将手指用酒精进行消毒，在写手指用酒精进行消毒，在写有有“后后”的部分沾一下。放入的部分沾一下。放入3737温箱培养温箱培养2424小时小时后观察。后观察。（每个实验室每个实验室2 2个平皿个平皿）方法：方法：用用“打咳法打咳法”进行检查。进行检查。取一个血琼脂平皿培养基（咽喉部多为葡萄球取一个血琼脂平皿培养基（咽喉部多为葡萄球菌），
21、打开平皿盖，对着平皿咳嗽几次（口腔前约菌），打开平皿盖，对着平皿咳嗽几次（口腔前约1010厘米），然后放入厘米），然后放入3737温箱培养温箱培养2424小时小时后观察菌后观察菌落数量及特征。落数量及特征。咽喉部细菌的检查咽喉部细菌的检查v2 2 高压蒸气灭菌法高压蒸气灭菌法v 原理：蒸汽被限制在密闭容器内，随着原理：蒸汽被限制在密闭容器内，随着热力的作用压力不断升高，蒸汽的温度也相热力的作用压力不断升高，蒸汽的温度也相应升高，在应升高，在103.4kPa103.4kPa蒸汽压力下时，温度可蒸汽压力下时，温度可达达121.3121.3。维持。维持15201520分钟后分钟后可杀死细菌包可杀死细
22、菌包括芽孢在内的所有微生物。括芽孢在内的所有微生物。高压蒸气灭菌器高压蒸气灭菌器v1)构造构造v 高压蒸气灭菌器是一个双层的金属圆筒，两层高压蒸气灭菌器是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水，外层坚厚，其上或前方有金属厚盖。盖之间盛水，外层坚厚，其上或前方有金属厚盖。盖旁附有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸气不能外溢。旁附有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸气不能外溢。v 高压蒸气灭菌器上装有排气阀、安全阀，以调高压蒸气灭菌器上装有排气阀、安全阀，以调节器内压力，装有的温度计及压力表以示内部温度节器内压力，装有的温度计及压力表以示内部温度和压力。和压力。v 器内装有带孔的金属搁板，用以放置欲灭菌对象。器内装有带孔的
23、金属搁板，用以放置欲灭菌对象。高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法压力：压力：1.05kg/或103.425KPa温度温度:121.3时间：时间：15-20min完全杀灭细菌的繁殖体和芽孢完全杀灭细菌的繁殖体和芽孢用途：适用于耐高温、高压，不怕潮湿的物品，用途：适用于耐高温、高压，不怕潮湿的物品，如敷料、如敷料、手术器械、药品、细菌培养基等手术器械、药品、细菌培养基等全全自自动动高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌锅锅 Systec D-200 2D Systec D-200 2D 双门高压灭菌器双门高压灭菌器双门高压灭菌器双门高压灭菌器电热卧式圆形压力蒸汽灭菌器电热卧式圆形压力蒸汽灭菌器电热卧式圆形压力蒸汽灭菌
24、器电热卧式圆形压力蒸汽灭菌器(型号型号型号型号YXQ-WY21-600)YXQ-WY21-600)台式蒸汽灭菌器台式蒸汽灭菌器台式蒸汽灭菌器台式蒸汽灭菌器 BA-30 BA-30全自动喷淋式高温高压调理杀菌锅全自动喷淋式高温高压调理杀菌锅全自动喷淋式高温高压调理杀菌锅全自动喷淋式高温高压调理杀菌锅 电电电电脑脑脑脑全全全全自自自自动动动动水水水水浴浴浴浴式式式式串串串串联联联联杀杀杀杀菌菌菌菌锅锅锅锅v2)2)使用方法使用方法v 加水至锅内达规定的水平面，放人欲灭菌物品，加水至锅内达规定的水平面，放人欲灭菌物品，把锅盖按对称的螺旋先后对称用力（切勿单个依次）把锅盖按对称的螺旋先后对称用力（切勿
25、单个依次）扭紧，使锅盖确实均匀密闭。扭紧，使锅盖确实均匀密闭。v 用电炉加热，同时打开排气阀门，使器内冷空用电炉加热，同时打开排气阀门，使器内冷空气逸出，保证器内温度和压力表所示一致。待空气全气逸出，保证器内温度和压力表所示一致。待空气全部排出后，关闭排气阀。部排出后，关闭排气阀。v 继续加热注视压力表，器内压力又逐渐升高，继续加热注视压力表，器内压力又逐渐升高，直到压力表指在所需数字（例如直到压力表指在所需数字（例如1515磅）即调节热源，磅）即调节热源，维持维持202030min30min可完全杀死细菌的繁殖体和芽胞。可完全杀死细菌的繁殖体和芽胞。v 灭菌时间到达后，停止加热，待压力自行下
26、降灭菌时间到达后，停止加热，待压力自行下降至零时方可徐徐开放排气阀，排尽余气，打开锅盖，至零时方可徐徐开放排气阀，排尽余气，打开锅盖，取出灭菌物品。取出灭菌物品。v3)注意事项注意事项v 检查排气活塞及安全阀门，特别是压力表检查排气活塞及安全阀门，特别是压力表的性能是否正常，以免发生危险。的性能是否正常，以免发生危险。v 灭菌物品不应放置过挤，妨碍蒸气流通，灭菌物品不应放置过挤，妨碍蒸气流通，影响灭菌效果。影响灭菌效果。v 灭菌开始时必须将器内冷空气完全排除，灭菌开始时必须将器内冷空气完全排除，否则压力表上所示压力并非全部是蒸气压力，否则压力表上所示压力并非全部是蒸气压力，灭菌将不彻底。灭菌将不彻底。v 灭菌过程中及灭菌完毕，灭菌过程中及灭菌完毕，灭菌后灭菌后切不可切不可排排气过急，气过急，突然打开排气阀门放气减压，以免瓶突然打开排气阀门放气减压，以免瓶内液体外溢或者破裂。内液体外溢或者破裂。v第二天观察结果第二天观察结果v本次试验不写试验报告，下周一起写肠道杆本次试验不写试验报告，下周一起写肠道杆菌的分离鉴定依据和结果菌的分离鉴定依据和结果v预习下周内容：肠道杆菌的鉴定、药敏实验预习下周内容：肠道杆菌的鉴定、药敏实验 抗酸染色抗酸染色