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1、第六节第六节 目的基因的获得目的基因的获得 （基因克隆）（基因克隆）定义：定义：基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新物质（品系），为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出可用于克隆的相关基因，这样的基因通常称之为目的基因，目的基因主要是结构基因。目的基因可以是完整的基因（包括转录启动子、基因编码区和转录终止子），也可以是基因的部分片断。作为一个能转录和翻译的结构基因必须包括转 录启动子、基因编码区和转录终止子。启动子：是DNA上RNA聚合酶识别、结合和 促进转录的一段核苷酸序列。基因编码区：包括起译码ATG、开放阅读框和 休止码TAA(TAG、TGA).终止
2、子：是一个能提供转录停止信息的核苷酸 序列。编码区：编码区：原核生物的基因多数以操作子形式存在，完成同类功能的多个基因聚集在一起，处于同一个启动子的调控之下，下游同具一个终止子。原核生物基因在起译码ATG上游约10bp处，有一个富含嘌呤核苷酸的SD保守序列区保守序列区，一般为AGGA,由此区转录的序列是翻译时核糖体识别、结合mRNA的位置，核糖体由此位置向前移动，寻找起译码AUG.启动子：启动子：原核生物的启动子含35序列保守区序列保守区5TTGACA3提供RNA聚合酶识别的信号；10序列保守区序列保守区5TATAAT3，DNA双链从此解开双链转录。操纵子除了启动子以外，还有一些调控转录的其他
3、因子，如调节因子和操纵因子等.终止子：终止子：原核生物基因转录终止之前有一段回文序列结构回文序列结构，使RNA聚合酶减缓移动或停止RNA的合成。基因编码区：基因编码区：真核生物染色体基因组的基因是单独存在的，并且两个基因之间有很长的间隔序列区（内含子）；启动子：启动子：真核生物结构基因的启动子通常包含3个保守序个保守序列区列区：在20至至30序列区有一个序列区有一个TATA框框，DNA双链在此处开始解开；在75序列区有一个序列区有一个CAAT框框，其作用是与RNA聚合酶结合有关；在更上游处有一个GC框框，是某些转录调控因子结合的序列；终止子：终止子：高等真核生物结构基因休止码序列下游有一保守的
4、AATAAA序列提供转录产物的释放信号；真核生物染色图基因组的结构基因不具有SD序列区，核糖体与转录的mRNA的结合靠mRNA 5端添加的“帽”结构；质粒基因组病毒（噬菌体）基因组线粒体基因叶绿体基因组1.PCR技术获取目的基因技术获取目的基因n反转录反转录PCRPCR反转录反转录反转录反转录PCRPCR，即，即，即，即RTRTPCRPCR（Reverse Transcription Reverse Transcription PCRPCR），是），是），是），是将逆转录与将逆转录与将逆转录与将逆转录与PCRPCR相结合的技术。可分为两步：相结合的技术。可分为两步：相结合的技术。可分为两步：相
5、结合的技术。可分为两步：逆转录：引物可以是逆转录：引物可以是逆转录：引物可以是逆转录：引物可以是Oligo(dT)Oligo(dT)12-1812-18或基因特异引物，模板或基因特异引物，模板或基因特异引物，模板或基因特异引物，模板是总是总是总是总RNARNA或或或或mRNAmRNA；PCRPCR：以：以：以：以mRNAmRNA逆转录合成逆转录合成逆转录合成逆转录合成cDNAcDNA第一条链为模板，引物第一条链为模板，引物第一条链为模板，引物第一条链为模板，引物用基因特异引物或从蛋白质序列设计的简并引物群以及用基因特异引物或从蛋白质序列设计的简并引物群以及用基因特异引物或从蛋白质序列设计的简并
6、引物群以及用基因特异引物或从蛋白质序列设计的简并引物群以及Oligo(dT)Oligo(dT)12-1812-18等。等。等。等。p已知目的基因序列的已知目的基因序列的RT-PCR根据目的基因的编码区序列两侧设计正反引物，一个是逆根据目的基因的编码区序列两侧设计正反引物，一个是逆根据目的基因的编码区序列两侧设计正反引物，一个是逆根据目的基因的编码区序列两侧设计正反引物，一个是逆转录引物作为反义引物，另一个是基因特异正向引物，两转录引物作为反义引物，另一个是基因特异正向引物，两转录引物作为反义引物，另一个是基因特异正向引物，两转录引物作为反义引物，另一个是基因特异正向引物，两个引物必须保证能扩增
7、出基因的编码区序列。个引物必须保证能扩增出基因的编码区序列。个引物必须保证能扩增出基因的编码区序列。个引物必须保证能扩增出基因的编码区序列。已知目的基因蛋白产物的已知目的基因蛋白产物的已知目的基因蛋白产物的已知目的基因蛋白产物的N N端部分氨基酸序列信息时，端部分氨基酸序列信息时，端部分氨基酸序列信息时，端部分氨基酸序列信息时，就可以以此设计特异引物，就可以以此设计特异引物，就可以以此设计特异引物，就可以以此设计特异引物，RNARNA从中通过从中通过从中通过从中通过RT-PCRRT-PCR获得目的基因。首先获得目的基因。首先获得目的基因。首先获得目的基因。首先Oligo(dT)Oligo(dT
8、)12-1812-18反转录第一链，接反转录第一链，接反转录第一链，接反转录第一链，接着以着以着以着以N N端部分氨基酸序列反推的端部分氨基酸序列反推的端部分氨基酸序列反推的端部分氨基酸序列反推的简并引物简并引物简并引物简并引物为正向引为正向引为正向引为正向引物，物，物，物，Oligo(dT)Oligo(dT)12-1812-18为反向引物进行扩增。为反向引物进行扩增。为反向引物进行扩增。为反向引物进行扩增。p从基因编码部分氨基酸序列出发的从基因编码部分氨基酸序列出发的RT-PCRn依据部分序列信息获得基因全长依据部分序列信息获得基因全长序列序列如果获得的目的基因的如果获得的目的基因的如果获得
9、的目的基因的如果获得的目的基因的DNADNA片断是不完整的，那片断是不完整的，那片断是不完整的，那片断是不完整的，那么基因有必要根据已知的序列获得么基因有必要根据已知的序列获得么基因有必要根据已知的序列获得么基因有必要根据已知的序列获得目的基因全长目的基因全长目的基因全长目的基因全长的序列的序列的序列的序列。目的基因完整序列的获得对目的基因完整序列的获得对目的基因完整序列的获得对目的基因完整序列的获得对基因结构分析、蛋白基因结构分析、蛋白基因结构分析、蛋白基因结构分析、蛋白表达及基因功能的研究至关重要表达及基因功能的研究至关重要表达及基因功能的研究至关重要表达及基因功能的研究至关重要。p反向反
10、向PCR反向反向反向反向PCRPCR是一种根据已知是一种根据已知是一种根据已知是一种根据已知DNADNA区的区的区的区的序列设计引物，以包含已知区和未序列设计引物，以包含已知区和未序列设计引物，以包含已知区和未序列设计引物，以包含已知区和未知区的环化知区的环化知区的环化知区的环化DNADNA分子为模板来扩增分子为模板来扩增分子为模板来扩增分子为模板来扩增未知未知未知未知DNADNA区序列的区序列的区序列的区序列的PCRPCR技术；技术；技术；技术；首先提取基因组首先提取基因组首先提取基因组首先提取基因组DNADNA，用一种在已，用一种在已，用一种在已，用一种在已知知知知DNADNA区没有识别位
11、点的限制酶切区没有识别位点的限制酶切区没有识别位点的限制酶切区没有识别位点的限制酶切割，产生含割，产生含割，产生含割，产生含上、下游上、下游上、下游上、下游未知区域未知区域未知区域未知区域DNADNA片断，然后通过片断，然后通过片断，然后通过片断，然后通过T T4 4DNADNA连接酶处理连接酶处理连接酶处理连接酶处理形成首尾相连的双链环状形成首尾相连的双链环状形成首尾相连的双链环状形成首尾相连的双链环状DNADNA。根。根。根。根据已知区域设计两套巢式引物即外据已知区域设计两套巢式引物即外据已知区域设计两套巢式引物即外据已知区域设计两套巢式引物即外测引物测引物测引物测引物S1S1、A1A1和
12、内侧引物和内侧引物和内侧引物和内侧引物S2S2、A2A2进行巢式进行巢式进行巢式进行巢式PCRPCR，获得特异，获得特异，获得特异，获得特异PCRPCR产物。产物。产物。产物。测序后获得已知序列。较小的环化测序后获得已知序列。较小的环化测序后获得已知序列。较小的环化测序后获得已知序列。较小的环化DNADNA分子，扩增效率高。分子，扩增效率高。分子，扩增效率高。分子，扩增效率高。p盒式盒式PCR盒式盒式盒式盒式PCRPCR是利用是利用是利用是利用cassettecassette（人工合成的带有适当限制性酶的黏性末端较（人工合成的带有适当限制性酶的黏性末端较（人工合成的带有适当限制性酶的黏性末端较
13、（人工合成的带有适当限制性酶的黏性末端较长的双链长的双链长的双链长的双链DNADNA分子）盒分子）盒分子）盒分子）盒cassettecassette上的引物，特异性扩增目的基因组上的引物，特异性扩增目的基因组上的引物，特异性扩增目的基因组上的引物，特异性扩增目的基因组DNADNA未知区域的一种有效的方法。未知区域的一种有效的方法。未知区域的一种有效的方法。未知区域的一种有效的方法。首先用适当的在已知首先用适当的在已知首先用适当的在已知首先用适当的在已知DNADNA区没有识别位点的限制酶切，产生含上、下区没有识别位点的限制酶切，产生含上、下区没有识别位点的限制酶切，产生含上、下区没有识别位点的限
14、制酶切，产生含上、下游未知区域游未知区域游未知区域游未知区域DNADNA分子然后与含有对应限制酶切位点的分子然后与含有对应限制酶切位点的分子然后与含有对应限制酶切位点的分子然后与含有对应限制酶切位点的cassettecassette进行连进行连进行连进行连接。接着用接。接着用接。接着用接。接着用cassettecassette引物引物引物引物1 1（C1C1）盒根据已知区域设计的特异反向引物）盒根据已知区域设计的特异反向引物）盒根据已知区域设计的特异反向引物）盒根据已知区域设计的特异反向引物1(ASP1)1(ASP1)配对，配对，配对，配对，cassettecassette引物引物引物引物2
15、2（C2C2）和根据已知区域设计的特异反向）和根据已知区域设计的特异反向）和根据已知区域设计的特异反向）和根据已知区域设计的特异反向引物引物引物引物2(antisense primer2,ASP2)2(antisense primer2,ASP2)配对配对配对配对,进行巢式进行巢式进行巢式进行巢式PCRPCR来扩增基因的上来扩增基因的上来扩增基因的上来扩增基因的上游未知区。同样用根据已知区域设计的特异正向引物游未知区。同样用根据已知区域设计的特异正向引物游未知区。同样用根据已知区域设计的特异正向引物游未知区。同样用根据已知区域设计的特异正向引物1(sense primer 1(sense pr
16、imer 1,SP1)1,SP1)和引物和引物和引物和引物C1C1配对配对配对配对,特异正义引物特异正义引物特异正义引物特异正义引物2(sense primer2,SP2)2(sense primer2,SP2)和和和和C2C2配配配配对对对对,通过巢式通过巢式通过巢式通过巢式PCRPCR来扩增基因的下游未知区。（图）来扩增基因的下游未知区。（图）来扩增基因的下游未知区。（图）来扩增基因的下游未知区。（图）pRACE技术技术 l lRACERACE是一种通过是一种通过是一种通过是一种通过PCRPCR进行进行进行进行cDNAcDNA末端快速克隆的技术末端快速克隆的技术末端快速克隆的技术末端快速克
17、隆的技术,是以是以是以是以mRNAmRNA为模板逆转录成为模板逆转录成为模板逆转录成为模板逆转录成DNADNA第一条链后用第一条链后用第一条链后用第一条链后用PCRPCR技术技术技术技术扩增出某个特异位点到扩增出某个特异位点到扩增出某个特异位点到扩增出某个特异位点到33或或或或55之间的未知序列的方法之间的未知序列的方法之间的未知序列的方法之间的未知序列的方法,分分分分别称别称别称别称3-RACE3-RACE或或或或5-RACE5-RACE；l l锚定锚定锚定锚定PCR(anchored PCR,PCR(anchored PCR,即序列未知的单链模板即序列未知的单链模板即序列未知的单链模板即序
18、列未知的单链模板33一末一末一末一末端添加同聚物尾巴从而获得与尾巴互补的引物结合位置端添加同聚物尾巴从而获得与尾巴互补的引物结合位置端添加同聚物尾巴从而获得与尾巴互补的引物结合位置端添加同聚物尾巴从而获得与尾巴互补的引物结合位置的的的的PCRPCR方法方法方法方法)和反向和反向和反向和反向PCRPCR都可以用于都可以用于都可以用于都可以用于RACERACE技技技技 。经典。经典。经典。经典RACERACE就是基于锚定就是基于锚定就是基于锚定就是基于锚定PCRPCR技术原理设计的，而高特异性技术原理设计的，而高特异性技术原理设计的，而高特异性技术原理设计的，而高特异性的的的的RACERACE则借
19、助于反向则借助于反向则借助于反向则借助于反向PCRPCR2.筛选基因文库获取目的基因筛选基因文库获取目的基因n基因文库的概念基因文库的概念所谓基因文库所谓基因文库所谓基因文库所谓基因文库,通俗地讲就是通过克隆的方法将某一基因组所通俗地讲就是通过克隆的方法将某一基因组所通俗地讲就是通过克隆的方法将某一基因组所通俗地讲就是通过克隆的方法将某一基因组所有有有有DNADNA或或或或mRNAmRNA，利用适当的载体保存于适当宿主菌或噬菌，利用适当的载体保存于适当宿主菌或噬菌，利用适当的载体保存于适当宿主菌或噬菌，利用适当的载体保存于适当宿主菌或噬菌体中形成的转化子群体中形成的转化子群体中形成的转化子群体
20、中形成的转化子群,所有重组所有重组所有重组所有重组DNADNA序列总和代表基因组的序列总和代表基因组的序列总和代表基因组的序列总和代表基因组的DNADNA全序列；基因文库包括基因组文库全序列；基因文库包括基因组文库全序列；基因文库包括基因组文库全序列；基因文库包括基因组文库(genomic library)(genomic library)和和和和cDNAcDNA文库文库文库文库(cDNA bank)(cDNA bank)；构建基因文库的目的不仅仅是将生物的遗传信息以稳定的克构建基因文库的目的不仅仅是将生物的遗传信息以稳定的克构建基因文库的目的不仅仅是将生物的遗传信息以稳定的克构建基因文库的目
21、的不仅仅是将生物的遗传信息以稳定的克隆形式存储起来，更为重要的是还能成为分离目地基因的主隆形式存储起来，更为重要的是还能成为分离目地基因的主隆形式存储起来，更为重要的是还能成为分离目地基因的主隆形式存储起来，更为重要的是还能成为分离目地基因的主要途径和基础；要途径和基础；要途径和基础；要途径和基础；基因文库的容量基因文库的容量基因文库的容量基因文库的容量 ：物种的基因组越大，目的基因在基因组中：物种的基因组越大，目的基因在基因组中：物种的基因组越大，目的基因在基因组中：物种的基因组越大，目的基因在基因组中的拷贝数越少；克隆载体容量越小，所需克隆的数目就越多；的拷贝数越少；克隆载体容量越小，所需
22、克隆的数目就越多；的拷贝数越少；克隆载体容量越小，所需克隆的数目就越多；的拷贝数越少；克隆载体容量越小，所需克隆的数目就越多；目的基因在基因组中的拷贝数越多，越容易筛选到该基因。目的基因在基因组中的拷贝数越多，越容易筛选到该基因。目的基因在基因组中的拷贝数越多，越容易筛选到该基因。目的基因在基因组中的拷贝数越多，越容易筛选到该基因。p基因组文库的构建过程基因组文库的构建过程 l l基因组文库的构建实际就是基因组片段的克隆过程。基基因组文库的构建实际就是基因组片段的克隆过程。基基因组文库的构建实际就是基因组片段的克隆过程。基基因组文库的构建实际就是基因组片段的克隆过程。基因文库的构建过程如下：因
23、文库的构建过程如下：因文库的构建过程如下：因文库的构建过程如下：生物基因组生物基因组生物基因组生物基因组DNADNA的提取和片的提取和片的提取和片的提取和片段化（制备成适合克隆长度和相应末端的片断段化（制备成适合克隆长度和相应末端的片断段化（制备成适合克隆长度和相应末端的片断段化（制备成适合克隆长度和相应末端的片断DNADNA）；）；）；）；载体选择和制备；载体选择和制备；载体选择和制备；载体选择和制备；DNADNA片段和载体的连接；片段和载体的连接；片段和载体的连接；片段和载体的连接；重组重组重组重组体转化宿主细胞（大肠埃细菌或酵母等）体转化宿主细胞（大肠埃细菌或酵母等）体转化宿主细胞（大肠
24、埃细菌或酵母等）体转化宿主细胞（大肠埃细菌或酵母等）DNADNA；初库初库初库初库的扩增。的扩增。的扩增。的扩增。pcDNA文库的构建文库的构建高等真核生物的基因组一般都很大（高等真核生物的基因组一般都很大（高等真核生物的基因组一般都很大（高等真核生物的基因组一般都很大（10104 410107 7kbkb）从真核生）从真核生）从真核生）从真核生物基因组文库中筛选目的基的工作量十分繁重；物基因组文库中筛选目的基的工作量十分繁重；物基因组文库中筛选目的基的工作量十分繁重；物基因组文库中筛选目的基的工作量十分繁重；真核物基因中往往含内含子，即使分离出来，也不能在原核真核物基因中往往含内含子，即使分
25、离出来，也不能在原核真核物基因中往往含内含子，即使分离出来，也不能在原核真核物基因中往往含内含子，即使分离出来，也不能在原核表达系统中表达目的基因，因为原核缺乏真核生物表达系统中表达目的基因，因为原核缺乏真核生物表达系统中表达目的基因，因为原核缺乏真核生物表达系统中表达目的基因，因为原核缺乏真核生物mRNAmRNA转转转转录后剪接系统不能完成的加工和拼接；录后剪接系统不能完成的加工和拼接；录后剪接系统不能完成的加工和拼接；录后剪接系统不能完成的加工和拼接；cDNAcDNA文库是从特定时空条件下表达的典型的真核生物细胞文库是从特定时空条件下表达的典型的真核生物细胞文库是从特定时空条件下表达的典型
26、的真核生物细胞文库是从特定时空条件下表达的典型的真核生物细胞mRNAmRNA（典型的真核生物细胞有（典型的真核生物细胞有（典型的真核生物细胞有（典型的真核生物细胞有1000-30 0001000-30 000个不同种类的个不同种类的个不同种类的个不同种类的mRNAmRNA序列），经逆转录形成的序列），经逆转录形成的序列），经逆转录形成的序列），经逆转录形成的cDNAcDNA克隆构建克隆构建克隆构建克隆构建的。通过的。通过的。通过的。通过筛筛筛筛选以直接获得编码区序列。这些序列因为不含选以直接获得编码区序列。这些序列因为不含选以直接获得编码区序列。这些序列因为不含选以直接获得编码区序列。这些序列
27、因为不含55端调控序列端调控序列端调控序列端调控序列和内含子，显得和内含子，显得和内含子，显得和内含子，显得“纯净纯净纯净纯净”这是它的个优点。这是它的个优点。这是它的个优点。这是它的个优点。总的提取总的提取总的提取总的提取RNARNA分离纯化分离纯化分离纯化分离纯化mRNAmRNA逆转录合成双链的克逆转录合成双链的克逆转录合成双链的克逆转录合成双链的克隆隆隆隆cDNAcDNAcDNAcDNA克隆克隆克隆克隆Two Libraries：cDNA Library vs Genomic LibrarymRNAcDNAReverse transcriptionChromosomal DNARestr
28、iction digestionGenes in expressionTotal GeneComplete geneGene fragmentsSmallerLibraryLarger LibraryVector:Plasmid or phageVector:PlasmidJuang RH(2004)BCbasicsp筛选基因文库获取目的基因筛选基因文库获取目的基因常用的筛选方法有核酸分子杂交法和免疫学筛选法。将常用的筛选方法有核酸分子杂交法和免疫学筛选法。将常用的筛选方法有核酸分子杂交法和免疫学筛选法。将常用的筛选方法有核酸分子杂交法和免疫学筛选法。将构建好保存起来的基因组文库或文库铺平板形
29、成含不同构建好保存起来的基因组文库或文库铺平板形成含不同构建好保存起来的基因组文库或文库铺平板形成含不同构建好保存起来的基因组文库或文库铺平板形成含不同外源外源外源外源cDNAcDNA重组子转化于菌落或噬菌斑；重组子转化于菌落或噬菌斑；重组子转化于菌落或噬菌斑；重组子转化于菌落或噬菌斑；用菌落或噬菌斑原位杂交法可以筛选出含目的基因阳性用菌落或噬菌斑原位杂交法可以筛选出含目的基因阳性用菌落或噬菌斑原位杂交法可以筛选出含目的基因阳性用菌落或噬菌斑原位杂交法可以筛选出含目的基因阳性克隆；克隆；克隆；克隆；如果构建了表达型如果构建了表达型如果构建了表达型如果构建了表达型cDNAcDNA文库，可以用免疫
30、学方法来筛文库，可以用免疫学方法来筛文库，可以用免疫学方法来筛文库，可以用免疫学方法来筛选目的基因。选目的基因。选目的基因。选目的基因。三三.图位克隆获得目的基因图位克隆获得目的基因 n图位克隆（图位克隆（图位克隆（图位克隆（mapbased cloningmapbased cloning）又称定位克隆：）又称定位克隆：）又称定位克隆：）又称定位克隆：通通通通过分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上过分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上过分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上过分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上,结合大容量载体构建的基因组文库结合大容量载体构建的基因组文库
31、结合大容量载体构建的基因组文库结合大容量载体构建的基因组文库(如如如如YACYAC文库、文库、文库、文库、BACBAC文库文库文库文库)，用分子标记的特异，用分子标记的特异，用分子标记的特异，用分子标记的特异DNADNA片段为探针，片段为探针，片段为探针，片段为探针，可以通过染色体步移可以通过染色体步移可以通过染色体步移可以通过染色体步移(chromosome walking)(chromosome walking)或染色或染色或染色或染色体登陆体登陆体登陆体登陆(chromosome landing)(chromosome landing)获得目的基因。获得目的基因。获得目的基因。获得目的基
32、因。p染色体步移染色体步移p染色体登陆染色体登陆 染色体步移往往因为得不到重叠克隆而被打断染色体步移往往因为得不到重叠克隆而被打断染色体步移往往因为得不到重叠克隆而被打断染色体步移往往因为得不到重叠克隆而被打断造成前功尽弃造成前功尽弃造成前功尽弃造成前功尽弃,或因为基因组的复杂性高而遇到或因为基因组的复杂性高而遇到或因为基因组的复杂性高而遇到或因为基因组的复杂性高而遇到重复序列改变步移方向误入歧途。重复序列改变步移方向误入歧途。重复序列改变步移方向误入歧途。重复序列改变步移方向误入歧途。构建插入片构建插入片构建插入片构建插入片段平均长度大于目的基因与其紧密连锁的分子段平均长度大于目的基因与其紧
33、密连锁的分子段平均长度大于目的基因与其紧密连锁的分子段平均长度大于目的基因与其紧密连锁的分子标记之间距离的基因组文库，标记之间距离的基因组文库，标记之间距离的基因组文库，标记之间距离的基因组文库，就可以通过筛库就可以通过筛库就可以通过筛库就可以通过筛库直接获得含目的基因的大直接获得含目的基因的大直接获得含目的基因的大直接获得含目的基因的大克隆，接着克隆，接着克隆，接着克隆，接着从中分离从中分离从中分离从中分离出目的基因。这样就完全避开了步移的弊端，出目的基因。这样就完全避开了步移的弊端，出目的基因。这样就完全避开了步移的弊端，出目的基因。这样就完全避开了步移的弊端，这种方法称为这种方法称为这种
34、方法称为这种方法称为染色体登陆。染色体登陆。染色体登陆。染色体登陆。四四.mRNA差别显示技术获得差异差别显示技术获得差异表达的基因表达的基因 绝大多数真核生物绝大多数真核生物绝大多数真核生物绝大多数真核生物mRNAmRNA具有具有具有具有poly(A)poly(A)尾，用尾，用尾，用尾，用Oligo(dT)Oligo(dT)1212MNMN（共（共（共（共1212种种种种(4(4种种种种M3M3种种种种N)N)）逆转录锚定引物，可以将所有的）逆转录锚定引物，可以将所有的）逆转录锚定引物，可以将所有的）逆转录锚定引物，可以将所有的mRNAmRNA逆转录成为大致相等但逆转录成为大致相等但逆转录成
35、为大致相等但逆转录成为大致相等但结构不同的结构不同的结构不同的结构不同的1212份份份份cDNAcDNA亚库亚库亚库亚库,这个过程叫做这个过程叫做这个过程叫做这个过程叫做差异显示逆转录即差异显示逆转录即差异显示逆转录即差异显示逆转录即DDRTDDRT。PCRPCR所用的所用的所用的所用的55端引物为端引物为端引物为端引物为10 mer10 mer的随机引物的随机引物的随机引物的随机引物,选择不同种的选择不同种的选择不同种的选择不同种的55端随机引物可只端随机引物可只端随机引物可只端随机引物可只扩增总扩增总扩增总扩增总cDNAcDNA中的部分中的部分中的部分中的部分cDNAcDNA链。通常采用链
36、。通常采用链。通常采用链。通常采用1212种反转录锚定引物和种反转录锚定引物和种反转录锚定引物和种反转录锚定引物和2020种种种种55端端端端随机引物进行随机引物进行随机引物进行随机引物进行240240组组组组PCRPCR扩增扩增扩增扩增,可以得到可以得到可以得到可以得到20 00020 000条左右的条左右的条左右的条左右的DNADNA条带条带条带条带,每一条都每一条都每一条都每一条都代表一种特定的代表一种特定的代表一种特定的代表一种特定的mRNA,mRNA,基本重盖了总基本重盖了总基本重盖了总基本重盖了总mRNAmRNA的的的的96%96%。扩增产物经过变性的聚丙烯酷肢凝胶电泳可以显示扩增
37、产物经过变性的聚丙烯酷肢凝胶电泳可以显示扩增产物经过变性的聚丙烯酷肢凝胶电泳可以显示扩增产物经过变性的聚丙烯酷肢凝胶电泳可以显示5050100100条长度在条长度在条长度在条长度在l00l00500bp500bp之间的条带。如果将之间的条带。如果将之间的条带。如果将之间的条带。如果将对照和诱导对照和诱导对照和诱导对照和诱导同时进行同时进行同时进行同时进行DDRT-PCR,DDRT-PCR,电泳结果在同电泳结果在同电泳结果在同电泳结果在同一位置的条带的有无可能显示基因表达的一位置的条带的有无可能显示基因表达的一位置的条带的有无可能显示基因表达的一位置的条带的有无可能显示基因表达的”开开开开”与与
38、与与”关关关关”即基因的特异表即基因的特异表即基因的特异表即基因的特异表达。达。达。达。nmRNA差别显示技术原理差别显示技术原理 五五.酵母双杂交系统分离目的基因酵母双杂交系统分离目的基因 n酵母双杂交技术的基本原理酵母双杂交技术的基本原理 pp酵母双杂交体系基于许多真核生物转录激活蛋白因子酵母双杂交体系基于许多真核生物转录激活蛋白因子酵母双杂交体系基于许多真核生物转录激活蛋白因子酵母双杂交体系基于许多真核生物转录激活蛋白因子(transcriptional(transcriptional activator)activator)都是由两个结构上可以分开且功能上独立的结构域都是由两个结构上可
39、以分开且功能上独立的结构域都是由两个结构上可以分开且功能上独立的结构域都是由两个结构上可以分开且功能上独立的结构域(domain)(domain)组组组组成：成：成：成：一个是与一个是与一个是与一个是与DNADNA调控序列结合的调控序列结合的调控序列结合的调控序列结合的 DNADNA结构域结构域结构域结构域(DNA-binding domain,DNA-(DNA-binding domain,DNA-BD)BD)另外一个是与基本转录复合物相互作用启动转录的另外一个是与基本转录复合物相互作用启动转录的另外一个是与基本转录复合物相互作用启动转录的另外一个是与基本转录复合物相互作用启动转录的转录激活
40、结构域转录激活结构域转录激活结构域转录激活结构域(transcriptional activation domain,AD)(transcriptional activation domain,AD)。二者单独都不能激活及引发转。二者单独都不能激活及引发转。二者单独都不能激活及引发转。二者单独都不能激活及引发转录。录。录。录。如果通过如果通过如果通过如果通过DNADNA重组技术将两个结构域编码区分别克隆在不同的质粒载体重组技术将两个结构域编码区分别克隆在不同的质粒载体重组技术将两个结构域编码区分别克隆在不同的质粒载体重组技术将两个结构域编码区分别克隆在不同的质粒载体上：上：上：上：DNA-DN
41、A-结合结构域与已知的诱饵蛋白结合结构域与已知的诱饵蛋白结合结构域与已知的诱饵蛋白结合结构域与已知的诱饵蛋白X X组成融合蛋白组成融合蛋白组成融合蛋白组成融合蛋白,激活结构域与另激活结构域与另激活结构域与另激活结构域与另外未知的蛋白外未知的蛋白外未知的蛋白外未知的蛋白Y Y形成融合蛋白形成融合蛋白形成融合蛋白形成融合蛋白.这两种载体共转化进酿酒酵母细胞中表达。这两种载体共转化进酿酒酵母细胞中表达。这两种载体共转化进酿酒酵母细胞中表达。这两种载体共转化进酿酒酵母细胞中表达。显然显然显然显然,如果未知靶蛋白如果未知靶蛋白如果未知靶蛋白如果未知靶蛋白Y Y能与已知的诱饵蛋白能与已知的诱饵蛋白能与已知
42、的诱饵蛋白能与已知的诱饵蛋白X X相互作用就会使相互作用就会使相互作用就会使相互作用就会使GAUGAU的的的的DNADNA一结合结构域和激活结构域空间上比较接近一结合结构域和激活结构域空间上比较接近一结合结构域和激活结构域空间上比较接近一结合结构域和激活结构域空间上比较接近,2,2现完整的现完整的现完整的现完整的GAL4GAL4转录因转录因转录因转录因子活性子活性子活性子活性,从而启动下游的报告基因的表达。常用的报告基因为从而启动下游的报告基因的表达。常用的报告基因为从而启动下游的报告基因的表达。常用的报告基因为从而启动下游的报告基因的表达。常用的报告基因为LacZ LacZ 基因和基因和基因
43、和基因和His3His3基因。基因。基因。基因。六六.T-DNA标签法标签法获得目的基因获得目的基因 七七.生物信息技术分离和鉴定目的基因生物信息技术分离和鉴定目的基因 n利用利用EST数据库发现新基因数据库发现新基因 基因表达序列标签（基因表达序列标签（基因表达序列标签（基因表达序列标签（Expressed Sequence Tag,ESTExpressed Sequence Tag,EST）是从）是从）是从）是从cDNAcDNA文库中随机挑取单克隆进行测序，所获得的序列片文库中随机挑取单克隆进行测序，所获得的序列片文库中随机挑取单克隆进行测序，所获得的序列片文库中随机挑取单克隆进行测序，所
44、获得的序列片段长度一般约为段长度一般约为段长度一般约为段长度一般约为60-500bp60-500bp。这一方法也称这一方法也称这一方法也称这一方法也称电子克隆电子克隆电子克隆电子克隆(electronic cloning)EST(expressed(electronic cloning)EST(expressed sequence tags)sequence tags)是基因表达短的是基因表达短的是基因表达短的是基因表达短的cDNAcDNA序列序列序列序列,包含基因编码区包含基因编码区包含基因编码区包含基因编码区的部分信息的部分信息的部分信息的部分信息,因此称为表达序列标签。随着因此称为表达序
45、列标签。随着因此称为表达序列标签。随着因此称为表达序列标签。随着ESTEST数据库的快数据库的快数据库的快数据库的快速增长速增长速增长速增长,增加了发现新基因的可能性增加了发现新基因的可能性增加了发现新基因的可能性增加了发现新基因的可能性,特别是从实验获得的特别是从实验获得的特别是从实验获得的特别是从实验获得的与某一功能相联系的新的与某一功能相联系的新的与某一功能相联系的新的与某一功能相联系的新的ESTEST出发出发出发出发,发现新基因的几率更大。发现新基因的几率更大。发现新基因的几率更大。发现新基因的几率更大。利用利用利用利用ESTEST数据库发现新基因的具体过程。数据库发现新基因的具体过程
46、。数据库发现新基因的具体过程。数据库发现新基因的具体过程。n通过蛋白家族的保守性分离目的基因通过蛋白家族的保守性分离目的基因 功能相近的蛋白质往往构成一个蛋白家族或超级家族，在功能相近的蛋白质往往构成一个蛋白家族或超级家族，在功能相近的蛋白质往往构成一个蛋白家族或超级家族，在功能相近的蛋白质往往构成一个蛋白家族或超级家族，在进化上形成高度保守的氨基酸序列区域。因此可以以同源进化上形成高度保守的氨基酸序列区域。因此可以以同源进化上形成高度保守的氨基酸序列区域。因此可以以同源进化上形成高度保守的氨基酸序列区域。因此可以以同源保守区设计引物，通过保守区设计引物，通过保守区设计引物，通过保守区设计引物
47、，通过PCRPCR的方法获得相关物种中这个蛋的方法获得相关物种中这个蛋的方法获得相关物种中这个蛋的方法获得相关物种中这个蛋白家族的其他成员，也可以通过检索和比对发现克隆的特白家族的其他成员，也可以通过检索和比对发现克隆的特白家族的其他成员，也可以通过检索和比对发现克隆的特白家族的其他成员，也可以通过检索和比对发现克隆的特定蛋白质与某一蛋白质家族达到统计学相关的标准，则认定蛋白质与某一蛋白质家族达到统计学相关的标准，则认定蛋白质与某一蛋白质家族达到统计学相关的标准，则认定蛋白质与某一蛋白质家族达到统计学相关的标准，则认为是该家族的成员，除非有别的证据否定这个推论。需要为是该家族的成员，除非有别的
48、证据否定这个推论。需要为是该家族的成员，除非有别的证据否定这个推论。需要为是该家族的成员，除非有别的证据否定这个推论。需要说明的是，一个序列可能被指定为一个以上的蛋白家族说明的是，一个序列可能被指定为一个以上的蛋白家族说明的是，一个序列可能被指定为一个以上的蛋白家族说明的是，一个序列可能被指定为一个以上的蛋白家族,而而而而蛋白的相似性只局限在某个区域或结构域。蛋白的相似性只局限在某个区域或结构域。蛋白的相似性只局限在某个区域或结构域。蛋白的相似性只局限在某个区域或结构域。八八.获取目的基因方法的选择策略获取目的基因方法的选择策略 类类类类型型型型已知的信息已知的信息已知的信息已知的信息获得目的
49、基因的方法获得目的基因的方法获得目的基因的方法获得目的基因的方法1 1已知目的基因的部分序列或其他物已知目的基因的部分序列或其他物已知目的基因的部分序列或其他物已知目的基因的部分序列或其他物种中同源基因的保守序列种中同源基因的保守序列种中同源基因的保守序列种中同源基因的保守序列PCRPCR相关的技术简便、快速地获得全长的目的相关的技术简便、快速地获得全长的目的相关的技术简便、快速地获得全长的目的相关的技术简便、快速地获得全长的目的基因基因基因基因已知的目的基因部分片段为探针从基因文库中筛已知的目的基因部分片段为探针从基因文库中筛已知的目的基因部分片段为探针从基因文库中筛已知的目的基因部分片段为
50、探针从基因文库中筛选。选。选。选。2 2已知基因表达的蛋白产物已知基因表达的蛋白产物已知基因表达的蛋白产物已知基因表达的蛋白产物制备抗体通过免疫学方法筛选表达型制备抗体通过免疫学方法筛选表达型制备抗体通过免疫学方法筛选表达型制备抗体通过免疫学方法筛选表达型cDNAcDNA文库文库文库文库对蛋白对蛋白对蛋白对蛋白N N端测序后端测序后端测序后端测序后,以氨基酸序列反推核昔酸序列以氨基酸序列反推核昔酸序列以氨基酸序列反推核昔酸序列以氨基酸序列反推核昔酸序列,或标记为寡聚核昔酸探针筛选基因文库或设计简或标记为寡聚核昔酸探针筛选基因文库或设计简或标记为寡聚核昔酸探针筛选基因文库或设计简或标记为寡聚核昔