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1、原核生物基因的组成原核生物基因的组成 真核生物基因的组成真核生物基因的组成 真核生物基因的组成真核生物基因的组成 结构基因结构基因 结构基因（结构基因（Structural Structural genegene）是指一类不仅可转录成信使是指一类不仅可转录成信使RNARNA（m mRNARNA），而且可翻译成多肽链，从而构成），而且可翻译成多肽链，从而构成各种结构蛋白质（包括催化各种生化反应各种结构蛋白质（包括催化各种生化反应的酶）的基因。的酶）的基因。第一节第一节 目的基因的制备目的基因的制备 直接分离法直接分离法构建基因组文库分离法构建基因组文库分离法构建构建cDNAcDNA基因文库分离法
2、基因文库分离法聚合酶链式反应技术扩增目的基因聚合酶链式反应技术扩增目的基因基因的化学合成基因的化学合成 一、直接分离法一、直接分离法限制性核酸内切酶酶切分离法限制性核酸内切酶酶切分离法基因分离的物理化学法基因分离的物理化学法 “鸟枪法鸟枪法”二、构建基因组文库分离法二、构建基因组文库分离法1 1、基因组、基因组 DNA DNA 文库文库（genomic DNA genomic DNA librarylibrary）从生物组织细胞提取出全部从生物组织细胞提取出全部 DNADNA，用物理方法或酶法将，用物理方法或酶法将 DNA DNA 降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适降解成预期大小的片段，
3、然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组一个细胞接受了含有一个基因组 DNADNA片段与载体连接的重组片段与载体连接的重组 DNA DNA 分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各一个含有基因组各 DNA DNA 片段克隆的集合体。片段克隆的集合体。2 2、基本步骤、基本步骤细胞染色体大分子细胞染色体大分子DNADNA提取和大片段的制备；提取和大片段的制备；载体载体 DNA DNA 的制备；的制备；载体与外源大片段的连接；载体与外源大片段的连接；体外包装
4、及基因组体外包装及基因组 DNA DNA 文库的扩增；文库的扩增；重组重组 DNADNA的筛选和鉴定。的筛选和鉴定。3 3、基因组、基因组 DNA DNA 文库的特点文库的特点1975 1975 年，年，Clarke Clarke 和和CarbonCarbon提出计算重组子数目的公式：提出计算重组子数目的公式：N=lnN=ln（1-P1-P）/ln/ln（1-f1-f）三、构建三、构建cDNA基因文库分离法基因文库分离法 1 1、cDNA cDNA 基因文库概念基因文库概念 提取出组织细胞的全部提取出组织细胞的全部 mRNAmRNA，在体外反转录成，在体外反转录成 cDNAcDNA，与适当的载
5、体常用噬菌体或质粒载体连，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段接后转化受体菌，则每个细菌含有一段 cDNAcDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部 mRNAmRNA信息的信息的 cDNAcDNA克隆集合称为该组织细胞的克隆集合称为该组织细胞的 cDNA cDNA 文库。文库。2 2、构建步骤、构建步骤 细胞总细胞总 RNA RNA 的制备及的制备及 mRNA mRNA 的分离与完整性的确定；的分离与完整性的确定；cDNA cDNA 第一条链与双链第一条链与双链 cDNA cDNA 的合成及克隆；的合成及克隆；cDNA cDNA
6、 与载体的连接、噬菌体颗粒的包装及转染或质与载体的连接、噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化与鉴定等。粒的转化与鉴定等。3 3、cDNA cDNA 克隆的主要优点克隆的主要优点特别适用于某些特别适用于某些RNARNA病毒的基因组结构研究病毒的基因组结构研究筛选比较简单易行筛选比较简单易行 目的基因的选择中出现假阳性的概率比较低目的基因的选择中出现假阳性的概率比较低可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆可用于真核细胞可用于真核细胞 mRNA mRNA 的结构和功能研究的结构和功能研究 4 4、cDNA cDNA 克隆的主要缺点克隆的主要缺点cDNA cDNA 文库
7、所包含的遗传信息要远远少于基因组文库所包含的遗传信息要远远少于基因组 DNA DNA 文库文库 不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列的结构与功能方面的信息外大量的调控序列的结构与功能方面的信息 低丰度低丰度 mRNAmRNA的的 cDDNA cDDNA 克隆所占的比例比较低克隆所占的比例比较低四、聚合酶链式反应技术扩增目的基因四、聚合酶链式反应技术扩增目的基因 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain polymerase chain reactionreaction）技术简称技术简称PCRPCR技术，是一种体
8、外扩增技术，是一种体外扩增特异特异DNADNA片段的技术。片段的技术。第四节第四节 目的基因目的基因 二、分离目的基因的途径二、分离目的基因的途径4、聚合酶链式反应技术扩增目的基因、聚合酶链式反应技术扩增目的基因PCRPCR原理原理：通过温度变化控制通过温度变化控制DNADNA的变性和复性，并设计引的变性和复性，并设计引物做启动子，加入物做启动子，加入DNADNA聚合酶、聚合酶、dNTPdNTP就可以完成就可以完成特定基因的体外复制。特定基因的体外复制。1 1、PCRPCR的原理的原理 2 2、PCRPCR步骤步骤DNADNA变性（变性（90-9690-96）退火（退火（25-6525-65）
9、延伸（延伸（70-7570-75）3 3、典型的、典型的PCRPCR反应体系反应体系 五、基因的化学合成五、基因的化学合成 人工合成基因的方法主要有两条途径：人工合成基因的方法主要有两条途径：生物合成生物合成化学合成化学合成1 1、全片段酶促连接法、全片段酶促连接法2 2、酶促填充法、酶促填充法第二节第二节 核酸的制备核酸的制备 天然天然DNADNA的制备的制备天然天然RNARNA的制备的制备核酸样品的分析与检测核酸样品的分析与检测染色体染色体DNA DNA 病毒和噬菌体病毒和噬菌体DNADNA 质粒质粒DNA DNA 线粒体和叶绿体线粒体和叶绿体DNADNA 天然天然DNADNA的种类的种类 保持核酸分子一级结构的完整性保持核酸分子一级结构的完整性防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解 核酸分离、纯化原则核酸分离、纯化原则 生物材料的准备生物材料的准备 裂解细胞裂解细胞分离和抽提分离和抽提 分离提取核酸的主要步骤分离提取核酸的主要步骤