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1、第五章 目的基因的分离和修饰第一节 基因的基本结构特征1.基因的组成 基因：染色体上具有遗传功能的DNA片段，它包括结构基因和相关的调控序列。脱氧核糖磷酸T目的基因：决定生物的某些性状、具有应用价 值或应用前景，并被用于构建物种新特性的基因。基因结构：包括从5端mRNA转录位点开始到3端mRNA转录终止信号结束的全部功能单位。这些功能单位包括：转录启动区、核糖体识别和结合区、编码区（起始密码，开读框、终止密码）、转录终止区。1)原核生物的基因组成操纵子（Operon）：功能密切相关的基因聚 集在一起，处于同一个转录启动区的调控 之下，并具有相同的转录终止区.启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始
2、转录的一段DNA序列。SD序列：核糖体识别和结合的序列，通常位于起译密码子上游4-9bp处。序列特征为：AGGAGG,它与核糖体核糖体16S rRNA的3序列3 UCCUCC 5互补配对，从而使核糖体与mRNA结合,启动翻译过程。编码区：翻译起始密码（ATG）：位于SD序列后4-9bp 多肽链编码区：翻译终止密码（TAG，TGA,TAA）：某些基因后面只有一个终止密码，某些基因后面有两个终止密码.转录终止区终止子：原核生物基因在转录终止前的一段提供 转录终止信号的DNA序列（Terminator）.a）不依赖于终止因子的终止子（简单终止子）含有寡聚U序列和一段富含GC的序列 b）依赖于终止因子
3、（）的终止子.不含寡聚U序列，回文结构不含富GC的序列终止因子：帮助RNA聚合酶识别终止信号的 辅助因子（Termination factor）终止子发夹结构2)真核生物基因组成 真核生物基因组的一般特点 a）基因位于染色体上，基因之间存在较长 的非编码区 b）一个结构基因内有一个或多个非编码的 间隔序列转录启动区：真核生物的三类RNA(rRNA,mRNA,tRNA)分别由RNA聚合酶I、II和III进行转录.它们启动子的结构也不相同.编码蛋白质的启动子由RNA聚合酶II识别.Prediction of cis-elements in the promoter region of SIDP36
4、4s Tissue-specific expression(27)sroot,seed,pollen,etc.s Carbon metabolism(51)s Light response(19)s Abiotic stresses response(30)ssalt,cold,drought,heat shock,etc.s ABA response(15)s JA,ET,etc.s Defense related elements(6)19 30 6 27511527513330156基因区：特点：a）无类似于原核基因中的核糖体识别区 b）含有不编码的间隔序列转录终止区：含有高度保守序列A
5、ATAAA，该序列与mRNA转录后3端加poly（dA）尾有关3)其它基因组的特点病毒（噬菌体）基因组的特点 a）编码的基因位于DNA或RNA上 b）以多顺反子进行转录（SV40）c）部分基因重叠并含有内含子线粒体基因组的特点 a）DNA编码的蛋白与能量代谢有关 b）以多顺反子进行转录 c）无SD序列 d）动物线粒体基因无内含子，某些植物线粒 体基因有内含子叶绿体基因组的特点 a）DNA编码与光合作用有关的蛋白或酶 b）以多顺反子进行转录 c）含有类似于原核基因组的启动子和SD序列2.基因的排列对于大多数基因来说，基因组中的基因一个接一个排列在DNA分子上，在基因之间存在长度不等的间隔区，但某
6、些生物基因组中的基因存在重叠，重复，加倍和重排等现象1）重叠基因一个基因内包含另一个基因的现象 a）部分重叠：两个基因的序列部分重叠 b）完全重叠：一个基因完全包含在另一个基因内SV40基因组的结构2）重复序列及重复基因真核基因组的不同DNA类型的序列：1）不重复的唯一序列（仅一拷贝）2）低度重复序列（10个拷贝）3）中度重复序列（10几百个拷贝）4）高度重复序列（几百几百万个拷贝）3）加倍基因较高等的生物含倍性染色体，因此基因组是加倍的，在一个细胞内至少有两套基因本相同的基因，性染色体除外。第二节 基因组文库基因组文库(genomic library)即基因文库(gene bank)是含有某
7、种生物体全部基因的随机片断的重组DNA 克隆群体。根据基因文库的组成成分，可分为基因组文库和cDNA 文库等。构建基因文库时先提纯生物的总DNA，通过机械剪切或酶切使其成为一定大小的片段，连接到适当载体(常为 噬菌体)上，经体外包装转染细菌，得到一群含不同DNA 片段的重组噬菌体颗粒。此即是基因文库。这群DNA 片段含盖基因组全部基因。建库的目的：1.从复杂的基因组中分离单拷贝的基因。2.从来源复杂的总mRNA 的cDNA 文库中分离稀有的cDNA 克隆。3.保存某物种的全部基因。建库的关键：如何产生足够数量的重组DNA建库应注意：保证载体DNA 和靶DNA 均不被外源DNA序列污染一.原核生
8、物基因组文库的构建1)原核生物基因组DNA的提取 染色体DNA 质粒DNA pUC载体系统：制备的基因组片段 100 kb*采用常规的基因组DNA的制备方法 载体系统：制备的基因组片段200 k bp*采用常规的基因组DNA的制备方法 要求：制备的DNA的长度为100-200kb，防止在制备过程中的机械断裂2）.基因组DNA 的片段化 用限制酶片段化:单酶消化DNA，不经凝胶电泳分离,直接和载体连接的克隆 存在的问题：所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段的混合群体。以每个载体可插入1 3kbDNA 计算，基因库至少含10 30 万个重组质粒。从中筛出目的基因工作量是很大的。目的基因内部
9、可能有一个以上的酶切位点，即一个基因分载在 几个重组质粒上，筛出完整基因更不容易。所以，当酶切DNA 建库时，为防止用一种限制酶肯能够切断某个基因，应建立用不同限制酶切割或部分酶切建库。双酶消化：单酶消化的产物一般分子较大，选择双酶消化；双酶消化的产物过小时，可采用部分消化，通过蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片段群体按大小分开，得到分子量大小合适的随机DNA 片段群体。单酶不完全酶切 根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a)四个识别位点限制酶出现的几率:1/256 b)六个识别位点限制酶出现的几率:1/4096 分离目的酶切片段大小的确定 a)克隆单个基因：10 kb b)克隆基因族：20kb
10、 不完全酶切条件的确定 a)确定限制酶用量，改变酶切时间 b)固定酶切时间，改变限制酶的用量DNA的不完全酶切 随机片段化：超声波：可产生300bp 的短片段。高速搅拌：1500 转/分30 分,可切平均长度8kb 的分子群体。3）.目的基因克隆片段的富集通过蔗糖梯度离心或凝胶电泳可得到分子量大小合适的随机DNA 片段群体。如已知含目的基因克隆片段的大小范围，可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳将DNA群体按大小分部分离。酶切片段的分离与纯化a）低熔点琼脂糖回收目的片段b）试剂盒回收目的片段4)酶切片段与克隆载体连接酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择 a）质粒载体可承载10 kb片段 b
11、）载体可承载20 kb DNA片段 c）Cosmid 载体可承载40 kb DNA片段5)重组转化受体细胞根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞常见的宿主细胞：DH5:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株，可与pUC编码的半乳糖苷酶氨基端实现互补。HB101:用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高JM101:可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌JM109:支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌MZ-1:温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体启动子质粒载体的宿主菌基因组大小酶切片段大小文库克隆子数的关系克隆数的确定任一DNA 序列在文库中出现的概率：N:该序列需要克隆的总
12、数；p:待克隆DNA 序列在文库中设定的出现概率，一般为99；I：待克隆DNA 片段的长度，假定为17kb;G:基因组DNA 的总长度，如人类为3109bp 将数据代入上式=8.1105N 的含义是克隆大小为17kb 的人类DNA 时，所构建的基因文库数必须在 8.1105 以上时，才能以99 的概率得到此克隆。6)基因组文库克隆子的保存 基因文库的保存 影印膜滤保存法文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终浓度为25%的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或
13、过少。保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70 oC或-25 oC下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大二.真核生物基因组文库的构建1)真核生物基因组DNA的制备 大片段DNA的获得。2)真核基因组DNA一级文库的构建（YAC文库或BAC文库）YAC载体系统：制备的基因组片段 10Mb*染色体分带技术将各个染色体分离 BAC载体系统：制备的基因组片段200kb*采用常规的基因组DNA的制备方法YAC 三：cDNA 文库的构建 cDNA 文库(cDNA library)：克隆的重组
14、cDNA 的总和，通常是在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个物种特定时期或器官的所有mRNA 制备得到的cDNA。cDNA 分子克隆(cDNA clone)：将cDNA 片段装在载体上转化细菌,扩增出多克隆的过程，最终可建立cDNA 文库。cDNA 文库的优点(1)使遗传物质为RNA 病毒可建立文库；(2)因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选；(3)从分化特异的细胞的cDNA 文库中可分离到特异表达的基因。(4)建库时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。(5)cDNA 文库可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。但应注意：(1)细胞中不同mRNA 的丰度不同，低丰度的mRNA 要求很高的克隆数。
15、(2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA 并非易事。用不同发育阶段，或不同组织细胞中的mRNA 制备的cDNA 文库会包含一些共同和特异序列。这可用于分离差异表达的基因。(3)cDNA 文 库 的DNA 无 内 含 子、调 节 元 件 和基 因 间DNA。不 能 用 于 基 因 结 构 和 调 节 的 研究。一 个 基 因 经 不 同 的 剪 接 可 产 生 不 同 的 部分重叠的cDNA 克隆。制备cDNA 文库 首 先 要 分 离 代 表 细 胞 中 的mRNA。mRNA 的提取可以通过多胸腺嘧啶的柱子分离。然后被反转录。cDNA 第一链的合成用oligo(dT)引物。第 二
16、链cDNA 的 合 成 是 用 自 身 引 物 的，一个 更 有 效 的 方 法 是 在cDNA 第 一 链 加 尾(如 多聚 胞 嘧 啶)，然 后 用oligo(G)为 引 物 起 始 第 二链的合成。双 链cDNA 与 载 体 的 连 接，可 以 通 过 加 接 头 或同聚尾巴插入载体。1)制备用于克隆cDNA的mRNAa)mRNA的制备 动物细胞mRNA的制备 植物细胞mRNA的制备b)mRNA的来源 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等 方法提高mRNA的含量c)mRNA完整性的检测*mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量 蛋白质的能力利用哺乳动物细胞提取的poly(A)+RN
17、A合成cDNALane 1:-HindIII-EcoRI;Lane 2:the first chain of cDNA;Lane 3:the second chain of cDNA;Lane 4:-HindIIId)mRNA在细胞中的丰度*高丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA 量的50-90%,该类mRNA在合成和克隆cDNA之 前不需进一步纯化特定mRNA.*低丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA 量的0.5%以下.2)mRNA的富集典型的哺乳动物细胞含有10 000-30 000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只
18、有一个拷贝 mRNA的丰度与文库克隆子数的关系 N=ln(1-P)ln(1-1/n)N:所需克隆数;P:要求的概率;n:一种 mRNA在总mRNA中的相对比例a)按大小对mRNA进行分级分离*通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分 子，该方法的分离效果最好，但从凝胶中回 收的得率较低.*蔗糖梯度离心：加入破坏RNA二级结构的变 性剂如氢氧化甲基汞等，再进行蔗糖梯度离 心以分离不同分子量的mRNA.b)cDNA的分级分离 mRNA通过反转录形成cDNA，在插入到克隆载 体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的 cDNA分子分离开来.优点：*避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解*增加了获
19、得全长cDNA克隆的概率*获得更准确的分级分离效果（分子量）3)cDNA第一链的合成利用反转录酶合成cDNA的第一链4)cDNA第二链的合成a)自身引导合成法：单链cDNA的3端能够形成 发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第 二链.自身引导法合成双链cDNAb)置换合成法原理：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链.优点：a）合成cDNA的效率高 b）直接利用第一链的反应产物，不纯化 c）避免使用
20、S1核酸酶来切割双链cDNA置换法合成cDNA的第二链c)引物-衔接头法5)双链cDNA分子的克隆a)同聚物加尾法 利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒 载体的3端都加上一个互补的同聚片段，通 过退火使两个片段连接成重组质粒，再将重 组质粒转化受体细胞同聚物加尾法克隆双链cDNAb)接头-衔接头法质粒载体构建cDNA 文库第三节 目的基因的分离与制备 结构、位置 差异表达、结构 蛋白 差异表达、结构、功能 生物信息、合成、扩增、一、根据蛋白质的性质分离目的基因1)根据蛋白质氨基酸序列分离目的基因 对于未知功能的蛋白质基因，其目的基因的分离可从蛋白质开始，通过蛋白质的分离纯化、蛋白质氨基酸
21、序列的测定、相对应的基因片断序列的设计，制备PCR扩增引物或合成DNA探针，从总DNA中分离目的基因片断。根据特异性蛋白质制备特异性抗体，然后从表达文库中筛选克隆子红树植物秋茄根蛋白双向电泳对比图谱 A B 盐胁迫秋茄(kandelia candel)根蛋白双向电泳对比图秋茄胚轴经过0mM Nacl(A样品)300mM Nacl(B 样品）处理30h后差异蛋白红树植物秋茄根蛋白双向电泳对比图谱 A B盐胁迫秋茄(kandelia candel)根蛋白双向电泳对比图秋茄胚轴经过0mM Nacl(A样品)300mM Nacl(B 样品）胁迫30h后差异蛋白盐胁迫相关蛋白的酶切及质谱分析1、挖取差异
22、蛋白质点用trypsin作胶内酶切2、将酶切形成的小肽段进行MALDI-TOF质谱分析无瓣海桑(Sonneratia apetala)盐胁迫相关蛋白的肽指纹图谱差异蛋白肽指纹图谱的数据库比对将差异蛋白肽指纹图谱与Mascot数据库比对,发现有2个为未知新蛋白。四个蛋白分别与丝氨酸乙醛酸氨基转移酶 或者冷刺激诱导LEA/RAB相关蛋白有一定的同源片段无瓣海桑(Sonneratia apetala)盐胁迫相关蛋白的 肽指纹图谱的数据库比对情况2)根据蛋白质的功能目的基因 从某一基因组中提取总DNA，经限制性内切酶不完全酶切后，与克隆载体连接，转化一种与目的基因功能互补的缺陷型受体细胞。当含有目的基
23、因片断的重组质粒进入受体细胞后，细胞才能生长，从而很方便地将含目的基因的克隆子挑选出来。必须氨基酸的合成 结构、位置 差异表达、结构 蛋白 差异表达、结构、功能 生物信息、合成、扩增、二、利用mRNA分离目的基因1)差别杂交(diffential hybridization)1.差别杂交要拥有两种细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，而另细胞群体中目的基因不表达。2.制备两种不同的mRNA 提取物。一种含一定比例目的基因mRNA 的总mRNA;另一种不含目的基因mRNA 的总mRNA;3.通过这两种总mRNA 为探针的平行杂交对目的基因cDNA 克隆文库进行筛选。2)扣除杂交 差别杂交的
24、缺点：(1)灵敏度低(2)重复性差(3)需用大量的杂交膜，工作量大，费时，费钱 故可用扣除杂交来筛选，扣除杂交也可用来分析缺失突变基因.3).差别显示 DDRT PCR4）表达序列标签表达序列标签（expressed sequence tag,EST)是指基因序列中一段弄特异地标签或表征基因的序列，通常它含有足够的结构信息以显示该基因与其他基因的差异，长度为100500bp，利用EST寻找新基因的一种策略就是表达序列标签法，也有称之为cDNA测序法，它是由M.D.Adam 于1991年创立的。5）基因表达系列分析法基因表达系列分析法（serial analysis of gene expres
25、sion,SAGE）是V.E.Velculsen等报道的一种快速分离新基因及分析多种基因表达的方法。其原理是从转录物某一特定位置上分离一段9-19bp的核苷酸序列标签（sequence tag,ST），然后将多个ST能以锚定酶识别位点序列相隔连成双标签序列的多连体；再将其克隆的载体进行序列分析和计算机处理。二代测序。结构、位置 差异表达、结构 蛋白 差异表达、结构、功能 生物信息、合成、扩增、三、基因定位克隆 基因定位克隆(map-based cloning)是根据基因在图谱位置，分离未知结构的目的基因。从理论上说，任何已鉴别的突变基因都可用这种方法分离出来。条件是：1）图谱；2）与目的基因紧
26、密连锁的标记(已知基因或分子标记)。基因定位localize：是对基因于染色体上或其他载体上所在位置、线形排列顺序及距离的测定，并绘制出遗传图。基因定位对于研究基因的结构、功能和相互作用有重要意义，并可应用于基因工程中的重组体DNA 操作。分子标记 molecular marker定义：又称做遗传标记，是在染色体上有可以确定的物理位置的DNA 片段，它有一定的遗传特征。标记可以是一个基因，也可以是未知功能的DNA 片段。因为DNA 片段在染色体上相互接近因而能同时遗传，标记通常是一种被用作为跟踪未被确定但大致位置已知的基因的遗传形式的间接方式。分子标记1.简单序列长度多态性(simple se
27、quence length polimorphism SSRPs),短的串联重复多态性(short tandem repeats polimorphism STRPs),同向重复序列可变数(variable number of tandem repeats VNTR)简单重复序列(simple sequence repeats SSR)2.随机PCR(random amplified polymorphic DNA,RAPD)以 短 片 断(10Nt)随 机 引 物 扩 增DNA，其PCR 产 物 大 小 不 同，经 电 泳 可 显 示 出“条 形 码”，RAPD 可 用 来 鉴 别 个 体，
28、常规 遗 传 学 分 析，群 体 遗 传 的 研 究。多 用于植物基因组作图。3.限制性片断长度多态性(restriction fragment length polimorphism,RFLP)限制性片断长度的多态性：在群体中不同个体基因的侧翼顺序不同，但可稳定遗传。若用限制性酶来切可得到很多不同长度的酶切片断，它们可作为一种标记。遗传图谱(genetic map)又称遗传连锁图谱或连锁图谱(linkage map):连锁linkage：位于同一染色体上的基因之间的关系。连锁图谱（Linkage Map）：染色体上两个遗传位点之间相对位置的关系。两个位点之间的距离依据它们共同遗传的概率来确定
29、。厘摩(cM)：一种度量重组概率的单位。在生殖细胞形成的减数分裂过程中，常常会发生同源染色体之间的交叉现象，如果两个标记之间发生交叉的概率为1，那么它们之间的距离就定义为1cM。对人类来说，1cM 大致相当于1Mbp。经典遗传学时代的遗传连锁图谱主要是以家系分析或不同性状个体间杂交为基础，根据同源染色体上等位基因的变化，通过计算重组率，确定染色体上基因座位的顺序和距离，构建基因的连锁 图谱。现代遗传遗传图谱是指用基因组内的基因以及多态性DNA 标记位点构成的图谱。物理图谱（Physics Map）：物理图谱描绘DNA 上可以识别的标记的位置和相互之间的距离(以碱基对的数目为衡量单位)，这些可以
30、识别的标记包括限制性内切酶的酶切位点，基因等。物理图谱不考虑两个标记共同遗传的概率等信息。对于人类基因组来说，最粗的物理图谱是染色体的条带染色模式，最精细的图谱是测出DNA 的完整碱基序列。染色体体步移法(chromosome walking)(1)方法：在人类和其它动物的定位克隆可用染色体体步移法：用邻近的标记为探针，在基因组文库中筛选重叠克隆。直到目的基因被克隆出。(2)步移的方向和进度可通过中期染色体原位分子杂交来确定。(3)大范围染色体步移有困难，因存在重复顺序而不能进行分子杂交。(4)此可通过染色体跳跃(chromosome jumping)来克服。基因定位候选法克隆目的基因 原理：
31、利用染色体的表达图谱，直接寻找与某一功能密切相关的目的基因。步骤：1)将疾病相关基因定位于染色体的精细区段 2)通过数据库查找已定位该区段的各候选基因表达图谱。3)通过对基因编码的蛋白质进行功能分析，找出最可能的候选基因。4)对候选基因进行突变分析，确定目的基因。水稻抗白叶枯病基因Xa26MDJ8/MH631 2 3 4 5Rb17MH63MDJ8IR24IRBB31 2 3 4Rb18u 编码LRR受体激酶u 粳稻背景能更好发挥Xa3/Xa26基因的功能u 超量表达Xa3/Xa26可进一步增强水稻的抗性、扩大抗谱RM224aA13aP16aP4 M44-28 R1506 M196-1 3/7
32、A-10Y6855RA42A476P1443K223H831B6 3/7A-802 2 2 0 0 14 14 14 0About 300 kbXa26Sun et al.2004 Plant J.四、标签法 Gene Tagging 突变体库就是由某种方法产生的、包含各种不同基因突变的群体。饱和突变体库是指理论上该基因组的每个基因都发生了突变的突变体库。利用-插入突变,在拟南芥()中已经建立了接近饱和的插入突变体库,该突变体库包含超过225000 个独立的-插入株系,在预测的29454 个基因中有21700 个基因发生了插入突变。水稻大型突变体库数据库的建立 数据库网址为：http:/数据库
33、信息包括 突变体的编号 突变表型（图片）报告基因的表达（图片）突变体的T-DNA拷贝数 侧翼序列 种子有无、供种信息 实行动态管理 数据库已在Nucleic Acids Research公布Expression patterns detected in the enhancer trap lines五、从文库中筛选分离目的基因 筛选DNA 文库是分离目的基因常用的方法；在成千上万的克隆中仅极少数含目的基因，且大多数基因的产物不具有可选择的表型特征，因此可采用以下策略来进行筛选：基因文库的筛选 表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选 分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选 免疫筛选法：利用多肽
34、等作为抗原进行原位杂交筛选 PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段 一）.表型筛选法 根据功能筛选文库二）.分子杂交法 概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。核酸分子杂交的基本原理 核酸分子杂交的基本方法 探针的标记核酸分子杂交的基本原理 DNA变性方法 热变性：90100 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 DNA复性或杂交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法
35、液相杂交Southern 印迹杂交 1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测ii)电转移法:电转移仪结构图iii)真空转移法真空转移仪结构探针的标记 探针的种类 cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RN
36、A探针 标记物核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等杂交 A）预杂交：在预杂交缓冲液中加入足够浓度 的载体DNA或（鲑鱼精DNA）以封闭膜上 可能与探针分子结合的位点。B）杂交：经预杂交的膜与含探针分子的杂交 缓冲液中进行杂交。显影或显色放射性自显影：将X射线底片置于杂交处 理的滤膜上于暗室中暴光1-3d，然后进行 显影和定影。Northern 印迹杂交(Northern bloting)检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同靶核酸：RNA RNA电泳转膜：不需变性斑点印迹杂交(dot bloting)将
37、RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样品原位杂交(in situ hybridization)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态核酸原位杂交的基本步骤 细胞或组织的固定：载玻片 组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测三）.免疫筛选法 在筛选一些表达文库时，常选用一些多克隆、滴度高的Ig G类且能与天然和变性蛋白质上不依赖于构象的表位均能高
38、度特异结合的抗体.1.制备用于筛选的菌落 平板培养。2.诱导表达目的基因产物 1）于37 oC温育，菌体生长直至出现1-2 mm的菌落 2）诱导带噬菌体启动子PR的表达载体 表 达基因产物3.然后转移到硝酸纤维素膜上 或尼龙膜上，表达产物与特异性抗体蛋白杂交；4.二抗与特异抗体杂交；5.杂交结果检测（放射自显影）。四）PCR筛选法 根据目的基因的已知序列或保守序列合成引物，利用载体序列设计PCR引物 文库分组 菌体PCR 扩增产物分析六、通过生物信息获得基因序列，然后合成或扩增基因。第四节 基因突变与修饰 体外诱变:是指对克隆化基因进行诱变处理，改变其核甘酸序列，获得突变基因以用于研究基因结构
39、与功能的技术。体外诱变分为随机诱变和定点突变一 随机诱变 随机诱变是指在克隆化的基因序列中随机的产生各种突变类型，主要用于诱变基因的编码区，改变氨基酸序列，获得需要的蛋白质。方法：1）盒式诱变 利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段取代目的基因中的相应序列，故也称DNA 片段取代法。2）化学诱变 常用的化学诱变剂有：亚硝酸、羟胺、肼、亚硫酸氢盐等 3)易错PCR诱变 通过改变PCR 反应条件来来提高PCR反应中的突变频率，得到随机突变的DNA 群体经转化、筛选和鉴定后确定期望重组子的过程4）嵌套缺失诱变 利用核酸酶逐步从目的DNA 的一端或两端删除多个寡核苷酸，得到一套终末端长短不一的嵌
40、套缺失突变群里，与合适的质粒载体重组后转化大肠杆菌细胞，获得渐次截短文库，从中筛选和鉴定缺失突变体。BAL31酶降解法 该酶能渐进地降解双链DNA,并从3端释放出单核苷酸,从而得到一系列较短的DNA片段.利用BAL31产生嵌套突变体二 定点诱变*体外特异性地改变目的DNA序列中某个碱基的技术。基因定点突变技术是蛋白质工程的核心技术之一。*蛋白质工程技术：在DNA分子水平上位点专一性地改变结构基因编码的氨基酸残基序列，使之表达出比天然蛋白质性能更为优异的突变蛋白；或通过基因的化学合成，设计制造出自然界不存在的全新工程蛋白质。蛋白质工程的过程不同单基因有不同的碱基排列顺序 1 atgagtaaag
41、 gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 61 gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 121 aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 181 gtcactactt tgacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaaacgg 241 catgactttt tcaagagtgc catgcccga
42、a ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 301 aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 361 aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 421 ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 481 atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgt
43、tca actagcagac 541 cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 601 ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 661 cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa不同单基因有不同的碱基排列顺序 1 atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attaga
44、tggt 61 gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 121 aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 181 gtcactactt tgacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaaacgg 241 catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 301 aaagatgacg g
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49、tctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 661 cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa1.PCR介导的定点诱变1）重叠延伸PCR法 2）大引物PCR法2 基因编码技术 lDNA 同源重组(Homologous recombination，HR)l 重组酶系统Cre/LoxP Cyclization recombination protein/locus of crossing-over(X)in P1 l 锌指核酸酶 ZFN(Zinc fing
50、er nucleases)l 转录激活因子样效应物核酸酶 TALEN(Transcription activator-like effector ucleases)lCRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated)噬菌体P1的Cre/Loxp系统 Cre(causes recombination)是来源于P1 噬菌体，由343 个氨基酸组成蛋白质，它不仅具有催化活性，而且识别特异的DNA 序列，并在其上催化断裂和重组从而产生精确的DNA 重组的一类重组酶。Lox