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1、第二节第二节PCR技术分离目的基因技术分离目的基因一一PCR技术技术 1PCR的含义的含义PCR（polymerasechainreaction）：）：模仿细胞内发生的模仿细胞内发生的DNA复制过复制过程，体外大量合成目的程，体外大量合成目的DNA片段，包括变性、退火、延伸三个步骤。片段，包括变性、退火、延伸三个步骤。2PCR反应程序：反应程序：（1）9095模板模板变性变性（2 2）37376060引物与模板复性（引物与模板复性（退火退火）（3 3）70707575引物引物延伸延伸，合成模板链，合成模板链DNADNA的互补链的互补链 循环循环25-3525-35次次加热加热变变性性复复性性复
2、温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使加热或强酸、碱性作用可以使加热或强酸、碱性作用可以使加热或强酸、碱性作用可以使 DNADNADNADNA双螺旋的氢键断裂双螺旋的氢键断裂双螺旋的氢键断裂双螺旋的氢键断裂,双链解离双链解离双链解离双链解离,形成形成形成形成单链单链单链单链DNA,DNA,DNA,DNA,这称为这称为这称为这称为 DNADNADNADNA的变性的变性的变性的变性。解除变性的条件后解除变性的条件后解除变性的条件后解除变性的条件后,变性的单链可变性的单链可变性的单链可变性的单链可以重新结合起来以重新结合起来以重新结合起来以重新结合起来,形成双链形成双链形成双链形成双链,其原
3、有其原有其原有其原有的特性和活性可以恢复的特性和活性可以恢复的特性和活性可以恢复的特性和活性可以恢复,这称这称这称这称DNADNADNADNA复复复复性性性性,也叫也叫也叫也叫退火退火退火退火。Kary B.Mullis（1944）http:/引物引物引物引物MullisideaDNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNA片段片段片段片段1983年Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 203PCR反应体系的组成反应体系的组成
4、1）DNA模板模板2）引物引物引物是指与待扩增的靶引物是指与待扩增的靶DNA两端序列互补的人工合成的寡聚两端序列互补的人工合成的寡聚核苷酸（核苷酸（1530bp）。）。3）dNTPs4）耐热性耐热性DNA聚合酶聚合酶5）反应缓冲液）反应缓冲液PCR引物的设计原则引物的设计原则:1.引物的特异性引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续或有连续8个互补碱基同源。个互补碱基同源。2.长度长度寡核苷酸引物长度为寡核苷酸引物长度为1530bp。3.G+C含量含量G+C含量一般为含量一般为40%60%。其。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐值
5、是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。寡核苷酸双链解链的温度。Tm值最好接近值最好接近72以使复性以使复性条件最佳。条件最佳。4.碱基础随机分布碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其其3端不应超过端不应超过3个连续的个连续的G或或C，因这样会使引物在因这样会使引物在G+C富集序列区错误富集序列区错误引发。引发。5.引物自身引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹
6、状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。6.6.引物之间引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免两引物之间不应不互补性，尤应避免33端的互补重叠以防引物二聚体的端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于形成。一对引物间不应多于4 4个连续碱基的同源性或互补性。个连续碱基的同源性或互补性。逆转录逆转录PCR(RT-PCR)将将mRNA逆转录与逆转录与PCR技术相偶联的一种基因分离技术。技术相偶联的一种基
7、因分离技术。二二PCR技术分离目的基因技术分离目的基因 逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增RACE（RapidamplificationofcDNAends）cDNA末端的快速扩增技术，是以末端的快速扩增技术，是以mRNA为模板合成为模板合成cDNA第一条链后第一条链后用用PCR技术扩增出技术扩增出某个特异位点某个特异位点到到3或或5端之间未知序列的方法。端之间未知序列的方法。3-RACE5-RACE思考题：思考题：1什么是什么是PCR？PCR包括哪三个基本步骤，各步骤的反应温包括哪三个基本步骤，各步骤的反应温度有什么特点？度有什么特点？2PCR反应体系有哪些重要组成成分
8、？什么是引物？引物有反应体系有哪些重要组成成分？什么是引物？引物有哪两种类型？哪两种类型？3什么是什么是RACE？它包括了哪两种它包括了哪两种PCR反应？反应？目的基因的分离技术：目的基因的分离技术：基因文库技术基因文库技术PCR技术技术插入突变法分离目的基因插入突变法分离目的基因图位克隆法分离目的基因图位克隆法分离目的基因（chromosomewalking）酵母双杂交技术分离目的基因酵母双杂交技术分离目的基因基因芯片技术基因芯片技术蛋白质组学技术蛋白质组学技术.第三节第三节 基因的化学合成基因的化学合成在在基基因因的的化化学学合合成成中中，首首先先要要合合成成出出有有一一定定长长度度的的、
9、具具有有特特定定序序列列结结构构的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段，然然后后再再通通过过DNADNA连连接接酶酶的的作作用用，使使它它们们按按照照一一定定的的顺顺序序共共价价地地连连接接起起来来。目目前前已已发发展展出出来来的的有有关关寡寡核核苷苷酸酸片片段段的的化化学学合合成成方方法法有有磷磷酸酸二二酯酯法法、磷磷酸酸三三酯酯法法、亚亚磷磷酸酸三三酯酯法，以及在后二者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。法，以及在后二者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。磷磷酸酸二二酯酯法法（最最早早创创立立的的DNADNA化学合成方法）化学合成方法）基基 本本 原原 理理：将将 两两 个个 在在 55或或33
10、末末端端各各带带有有适适当当保保护护基基团团的的脱脱氧氧单单核核苷苷酸酸连连接接起起来来，形形成成一一个个两两端端都都被被保保护护的的二二核核苷苷酸酸分分子子。然然后后此此分分子子脱脱保保护护（除除去去一一端端的的保保护护基基团团），再再进行新的缩合反应。进行新的缩合反应。Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法利利用用DNA聚聚合合酶酶和和双双脱脱氧氧链链终终止止物物测测定定DNA核核苷苷酸酸顺顺序序的的方方法法，是是由由英英国国剑剑桥分子生物学实验室的生物化学家桥分子生物学实验室的生物化学家F.Sanger等人于等人于1977年发明的。年发明的。它的基本原理是，利用了它的基本原理是，利用了DNA聚合酶所具有的两种酶催反应的特性：聚合酶所具有的两种酶催反应的特性：第一，第一，DNA聚合酶能够利用单链的聚合酶能够利用单链的DNA作模板，合成出准确的作模板，合成出准确的DNA互补链；互补链；第第二二，DNA聚聚合合酶酶能能够够利利用用2，3双双脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸作作底底物物，使使之之参参入入到到寡核苷酸链的寡核苷酸链的3末端，从而终止末端，从而终止DNA链的生长。链的生长。第四节第四节 DNADNA测序测序思考题思考题:Sanger双脱氧链终止测序法的基本原理是什么？此方法双脱氧链终止测序法的基本原理是什么？此方法中用到的一种重要底物是什么？中用到的一种重要底物是什么？