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1、1.1.目的基因分离克隆目的基因分离克隆一一 目的基因的化学合成目的基因的化学合成特点：特点：3 35 5合成，合成长度合成，合成长度200bp200bp过程：过程：推出基因序列后，用推出基因序列后，用DNADNA合成仪合成合成仪合成作用：作用：合成引物合成引物二二 PCRPCR合成目的基因合成目的基因 定义：定义：分离纯化出的目的片段用分离纯化出的目的片段用PCRPCR仪扩增仪扩增 （详见主要技术）（详见主要技术）引物设计原则引物设计原则长度：长度：15-30bp15-30bp退火温度：退火温度：序列：序列：少相似，防错配少相似，防错配引物引物3 3末端：末端：避免为避免为A A（易错配）（
2、易错配）CGCG含量：含量：40%-60%40%-60%未知序列时：未知序列时：用近缘生物对应片段参考用近缘生物对应片段参考RT-PCRRT-PCR间接合成：间接合成：以以mRNAmRNA为模板逆转录出为模板逆转录出 cDNA cDNA，再以，再以cDNAcDNA为模板为模板 PCR PCRcDNAcDNA：定义：定义：以以mRNAmRNA为模板逆转录合成的无内含子为模板逆转录合成的无内含子 单链环状单链环状DNADNA特点：特点：无内含子、单链环状，无内含子、单链环状，逆转录酶属于逆转录酶属于 DNA DNA聚合酶，需引物聚合酶，需引物三三 基因文库分离目的基因基因文库分离目的基因基因组文库的建立：基因组文库的建立：cDNAcDNA文库的建立：文库的建立：四四 基因图位克隆基因图位克隆染色体步移法：染色体步移法：染色体登陆：染色体登陆：本章总结本章总结