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1、2023/1/26PCR法获取目的基因1第五章第五章 PCR法获取目的基因法获取目的基因目目 录录PCR技术的创建PCR技术的原理 PCR的反应体系和条件PCR的类型和应用PCR法获取目的基因2023/1/262PCR法获取目的基因2023/1/26PCR法获取目的基因3DNA，生命的蓝图生命的蓝图2023/1/26PCR法获取目的基因4PCR技术技术Polymerase Chain Reaction多聚酶链式反应一、PCR技术的创建Kary B.MullisKary B.Mullis1.Khorana1.Khorana等等19711971年提出在体外经年提出在体外经DNADNA变性、变性、与
2、适当引物杂交、再用与适当引物杂交、再用DNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸,克隆克隆DNADNA的设想。的设想。2.19832.1983年年,Mullis,Mullis发明了发明了PCRPCR技术技术,使使KhoranaKhorana的设想得到实现。的设想得到实现。3.19883.1988年年SaikiSaiki等将耐热等将耐热DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq）引入了）引入了PCRPCR技术。技术。4.19884.1988年，第一台年，第一台PCRPCR仪问世。仪问世。5.19895.1989年美国年美国ScienceScience杂志比喻杂志比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸年
3、爆炸年,Mullis,Mullis荣荣获获19931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。6.19916.1991年，年，Hoffman LaRocheHoffman LaRoche以以3 3亿美元的代价从亿美元的代价从CetusCetus公司获得全公司获得全权开发权。权开发权。2023/1/265PCR法获取目的基因2023/1/26PCR法获取目的基因6Kary B.Mullis（1944）三篇重要论文三篇重要论文The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction(Scientific American,The Unusual Ori
4、gin of the Polymerase Chain Reaction(Scientific American,1990,262(4):56-61,64-5)1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase(Science,1988,239(4839):487-91Polymerase(Scie
5、nce,1988,239(4839):487-91)Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction(Methods in Enzymology,1987,155:335-50)Reaction(Methods in Enzymology,1987,155:335-50)DNADNA聚合酶聚合酶引物引物引物引物引物引物引物引物1977年Sanger的测序技术
6、M13M13噬菌体噬菌体引物引物DNADNA聚合酶聚合酶2023/1/267PCR法获取目的基因1983年Mullis的构思9494949455555555373737372023/1/268PCR法获取目的基因1983年春夏之交的一个晚上，年春夏之交的一个晚上，Mullis开车去乡下别墅的路上萌发了用开车去乡下别墅的路上萌发了用两个两个两个两个引物去扩增模板引物去扩增模板DNA 的想法。他开车时的想法。他开车时,感觉两排路灯就是感觉两排路灯就是DNA的两条链，的两条链，自己的车和对面开来的车象是自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成聚合酶，面对面地合成DNA。缺点缺点:DNA聚
7、合酶不能耐受高温，每个循环需额外添加聚合酶不能耐受高温，每个循环需额外添加DNA聚合酶。聚合酶。TaqTaq DNADNA聚合酶（来自于聚合酶（来自于Thermus aquaticusThermus aquaticus，水生栖热菌，水生栖热菌)1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术2023/1/269PCR法获取目的基因2023/1/26PCR法获取目的基因10二、PCR技术的原理 1.PCR技术的原理在微量离心管中在微量离心管中,加入适加入适量的量的缓冲液缓冲液,微量的微量的模板模板DNADNA,四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸,耐耐热性热性DNADNA聚合酶聚合酶,
8、一对合一对合成成DNADNA的引物的引物,通过通过高温变性、低温退火和中和中温延伸三个阶段的循环合三个阶段的循环合成成DNADNA，每一次循环使，每一次循环使特异区段的基因拷贝数特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经放大一倍。一般样品经过过3030次循环次循环,可使基因的可使基因的拷贝数达到数百万。拷贝数达到数百万。（1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物 （2）PCR过程：由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成 变性：94左右，使双链DNA模板解离成为单链；复性：55左右，引物与模板DNA单链互补配对结合；延伸：72左右，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以dN
9、TP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链 （3）重复“变性-退火-延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。2023/1/2611PCR法获取目的基因加热加热变变 性性复复性性复温2.PCR技术依赖于DNA的变性和复性DNADNA的变性：的变性：加热或强酸、碱性加热或强酸、碱性作用可以使作用可以使DNADNA双螺旋的氢键断双螺旋的氢键断裂裂,双链解离双链解离,形成单链形成单链DNADNADNADNA的复性（退火）：的复性（退火）：解除变性解除变性的条件后的条件
10、后,变性的单链变性的单链DNADNA可以可以重新结合起来重新结合起来,形成双链形成双链,其原有其原有的特性和活性可以恢复的特性和活性可以恢复 2023/1/2612PCR法获取目的基因3.PCR技术的特点1 1）速度快，灵敏度高速度快，灵敏度高：经过：经过3030轮循环，理论上目的产物的轮循环，理论上目的产物的 扩增量达扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝）拷贝）2 2）特异性特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCRPCR反应结果的关键；引物设计的原则是最大限度地提高扩增效反应结果的关键；引物设计的原则是最大限度地提高扩增
11、效率和特异性，尽可能减少非特异性扩增。率和特异性，尽可能减少非特异性扩增。3 3）操作简便易行操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出：只需要数小时就可以用电泳法检出1g1g基基因组因组DNADNA中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。4 4）用途广泛用途广泛：生命学科、医学工程、遗传工程、疾病诊断、：生命学科、医学工程、遗传工程、疾病诊断、法医学、考古学法医学、考古学2023/1/2613PCR法获取目的基因三、PCR技术的反应体系和条件H H2 2OO3535 L L10PCR10PCR反应缓冲液反应缓冲液 5 5 L L25mmol/LMgCl25mmol/LMgCl2
12、 2 4 4 L L4 4种种dNTPdNTP4 4 L L上游引物（引物）上游引物（引物）0.50.5 L L下游引物（引物）下游引物（引物）0.50.5 L L模板模板DNADNA(约约1ng)1ng)0.50.5 L LTaqTaq酶酶0.50.5 L L 1.反应体系（总体积：50 L）2023/1/2614PCR法获取目的基因PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程(1)(1)模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBufferMgMg2+2+预变性预变性模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffe
13、rMgMg2+2+TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶9494 5min 5min2.基本程序2023/1/2615PCR法获取目的基因PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程(2)(2)Taq Taq 酶酶酶酶模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBufferMgMg2+2+循循环环仪仪949455 55 72 72 72 72 5 57 min7 min循环2535次2023/1/2616PCR法获取目的基因Taq Taq 酶酶酶酶模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBufferMgMg2+2
14、+PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程(3)(3)琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳2023/1/2617PCR法获取目的基因2023/1/26PCR法获取目的基因18注意事项注意事项1.EB是是强强诱诱变变剂剂并并有有中中等等毒毒性性，配配制制和和使使用用时时都都应应戴戴手手套套,并并且且不不要要把把EB洒洒到到桌桌面面或或地地面面上上。凡凡是是沾沾污污了了EB的的容容器器或或物物品品必必须须经经专专门门处处理理后后才才能能清清洗洗。沾沾染染了了EB的的实实验验垃垃圾圾需需专专门门回回收收处理。处理。2.观观察察DNA离离不不开开紫紫外外透透射射仪仪，可可是是紫紫外外光光对对DNA分分子子有有
15、切切割割作作用用。从从胶胶上上回回收收DNA时时，应应尽尽量量缩缩短短光光照照时时间间并并采采用用长长波波长长紫外灯紫外灯(300-360nm），以减少紫外光切割），以减少紫外光切割DNA。3.每每加加完完一一个个样样品品要要更更换换tip头头，以以防防止止互互相相污污染染，注注意意上上样样时时要要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。（1 1 1 1）PCRPCRPCRPCR反应成分反应成分反应成分反应成分n n模板模板（TemplateTemplate）DNADNA模板模板浓度：一般浓度：一般为为1 1 g/mg/mL L左右；左右；单
16、、双链单、双链DNADNA；线状DNA分子、环状DNA分子均可；DNADNA模板不能混有蛋白酶、核酸酶、模板不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制剂等；聚合酶抑制剂等；模板的浓度和纯度是影响PCR的重要因素：模板过多可能增加非特异性产物；纯度不高会影响PCR的效率，甚至得不到产物。3.PCR反应条件2023/1/2619PCR法获取目的基因2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因2020n n引物（引物（PrimerPrimer）uu浓度：浓度：0.1-0.50.1-0.5 mol/Lmol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，浓度过高易导致模板与引物
17、错配,反应特异反应特异性下降。性下降。uuPCRPCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是的好坏往往是PCRPCR成败的关键。引物设计可遵循下列原成败的关键。引物设计可遵循下列原则：则：引物长度引物长度：约：约16-30bp16-30bp，太短影响引物与模板的配对；，太短影响引物与模板的配对；四四种种碱碱基基随随机机分分布布，在在33端端不不存存在在连连续续3 3个个G G或或C C，这这样易导致错误引发（样易导致错误引发（falseprimingfalsepriming）；）；引引物物中中G+CG+C含含量量：通通常常为为40-
18、60%40-60%，可可按按下下式式粗粗略略估估计引物的解链温度计引物的解链温度TmTm4(G+C)+2(A+T)4(G+C)+2(A+T)；引引物物33端端：关关键键碱碱基基，必必须须与与模模板板完完全全配配对对，最最好好对对应应密密码码子子的的第第一一或或第第二二位位核核苷苷酸酸，以以减减少少由由于于密密码码子子摆摆动动产生的不配对。产生的不配对。2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因2121引引物物内内部部：尤尤其其在在33端端，不不存存在在发发夹夹结结构构（HairpinHairpin）、二二聚体（聚体（DimerDimer）；）；两两引引物物之之
19、间间：尤尤其其在在33端端，不不能能互互补补以以防防出出现现引引物物二二聚聚体体（crosscrossdimerdimer），减减少少产产量量；两两引引物物间间最最好好不不存存在在4 4个个连连续碱基的同源性或互补性；续碱基的同源性或互补性；引引物物55端端：对对扩扩增增特特异异性性影影响响不不大大，可可在在引引物物设设计计时时加加上上限限制制酶酶位位点点、核核糖糖体体结结合合位位点点、起起始始密密码码子子、缺缺失失或或插插入入突突变变位位点点以以及及标标记记生生物物素素、荧荧光光素素、地地高高辛辛等等。通通常常应应在在55端限制酶位点外再加端限制酶位点外再加3-43-4个个保护碱基保护碱基；
20、引引物物不不产产生生falsefalseprimingpriming：不不与与模模板板结结合合位位点点以以外外的的序序列列互补，避免错误引发互补，避免错误引发PCRPCR扩增。扩增。3355355限制性内切酶的识别序列、启动子序列、定点突变、探针标记限制性内切酶的识别序列、启动子序列、定点突变、探针标记限制性内切酶的识别序列、启动子序列、定点突变、探针标记限制性内切酶的识别序列、启动子序列、定点突变、探针标记nTaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)浓度浓度：0.5-2.5U/50L体系，所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减，酶量增加使反应特异性下降，酶量过
21、少影响反应产量；TaqDNA聚合酶活性的半衰期半衰期：92.5130min；9540min；975min；TaqDNA聚合酶的酶活性单位酶活性单位定义：74下，30min，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量；TaqDNA聚合酶的出错率出错率：一般PCR中出错率为110-5/bp，在利用PCR克隆和进行序列分析时应注意。类型：TaqDNA聚合酶普通型，PCR产物末端为A；PfuDNA聚合酶(Pyrococcusfuriosus)高保真，出错率为110-6/bp，PCR产物为平末端。2023/1/2622PCR法获取目的基因2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因
22、法获取目的基因2323n反应缓冲液（PCRbuffer）组分：一般含10-50mmol/LTrisCl(20下pH8.3-8.8)、50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+；TrisCl：在20时pH为，但在实际PCR反应中,pH为；50mmol/L的KCl：有利于引物的退火；Buffer中加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100g/mL的牛血清白蛋白(BSA)，可稳定酶活性；加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长的DNA片段有利；各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。nMg2+浓度：0.5mmol/L-2mmol/L，Mg2+浓度过低会降低Taq酶活性；Mg2+浓度过
23、高影响反应特异性。对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的梯度进行Mg2+预备实验,选出最适的浓度；Mg2+的作用：DNA聚合酶的激活剂，可影响酶的活性和真实性,还影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团（如磷酸基团、EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质），以保证最适Mg2+浓度；dNTP可与Mg2+结合：使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。2023/1/2624PCR法获取目的基因ndNTP（4种三磷酸脱氧核苷酸）浓度：20-200mol/L，dNTP浓度取决于扩增片段的长度，浓度
24、过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量；理论上4种dNTP各20mol/L,就足以在100L反应中合成2.6g的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性；四种dNTP浓度应相等，以减少合成中由于某种dNTP不足而导致的掺入错误；dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。dNTP制备：应用NaOH将dNTP溶液的pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装，-20贮存。2023/1/2625PCR法获取目的基因2023/1/26PCR法获取目的基因26（2 2 2 2）循
25、环参数循环参数循环参数循环参数预变性：945min变性：9420s-45s（使双链DNA解链为单链）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间为45s左右。提高温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度可增加反应的灵敏性。延伸：一般为一般为7272，时间由扩增片段长度决定。，时间由扩增片段长度决定。循环次数：主要取决于模板主要取决于模板DNADNA的浓度，一般为的浓度，一般为25-3525-35次次。次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入。次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入 率增加。到达平台期率增加。到达平台期(Plateau)(Plateau)所需循环次数取所需循环次数取 决于样品中模板的拷
26、贝数。决于样品中模板的拷贝数。延伸补齐：7272，5min10min2023/1/2627PCR法获取目的基因2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因28282023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因29294.注意事项n nPCRPCR应该在一个没有脱氧核糖核酸污染的干净环境中进行，应该在一个没有脱氧核糖核酸污染的干净环境中进行，应该在一个没有脱氧核糖核酸污染的干净环境中进行，应该在一个没有脱氧核糖核酸污染的干净环境中进行，最好设立一个专用的最好设立一个专用的最好设立一个专用的最好设立一个专用的PCRPCR实验空间。实验空
27、间。实验空间。实验空间。n n纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。n n所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均所有试剂都应该
28、没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。应戴手套。应戴手套。应戴手套。n nPCRPCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22m0.22m滤膜过滤除菌或高压灭菌。滤膜过滤除菌或高压灭菌。滤膜过滤除菌或高压灭菌。滤膜过滤除菌或高压灭菌。n n试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，
29、从而确保实验与实验之间的连成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。续性。续性。续性。n n试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。n nPCRPCR的样品应在冰浴上融解，并且要充分混匀。的
30、样品应在冰浴上融解，并且要充分混匀。的样品应在冰浴上融解，并且要充分混匀。的样品应在冰浴上融解，并且要充分混匀。2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因3030uu阳性对照阳性对照阳性对照阳性对照:在建立在建立在建立在建立PCRPCR反应实验室及一般的检验单反应实验室及一般的检验单反应实验室及一般的检验单反应实验室及一般的检验单位都应设有位都应设有位都应设有位都应设有PCRPCR阳性对照，它是阳性对照，它是阳性对照，它是阳性对照，它是PCRPCR反应是否成功、反应是否成功、反应是否成功、反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要产物条带位置及
31、大小是否合乎理论要求的一个重要产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。的参考标志。的参考标志。的参考标志。uu阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高含量宜低不宜高含量宜低不宜高含量宜低不宜高(100(100个拷贝
32、以下个拷贝以下个拷贝以下个拷贝以下)。但阳性对照尤其但阳性对照尤其但阳性对照尤其但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，对检测或扩增样品是重组质粒及高浓度阳性标本，对检测或扩增样品是重组质粒及高浓度阳性标本，对检测或扩增样品是重组质粒及高浓度阳性标本，对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一污染的可能性很大。因而当某一污染的可能性很大。因而当某一污染的可能性很大。因而当某一PCRPCR试剂经自己使试剂经自己使试剂经自己使试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可用稳定，检验人员心中有数时
33、，在以后的实验中可免设阳性对照。免设阳性对照。免设阳性对照。免设阳性对照。2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因3131n n阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照:每次每次每次每次PCRPCR实验务必做阴性对照。实验务必做阴性对照。实验务必做阴性对照。实验务必做阴性对照。它包括它包括它包括它包括标本对照标本对照标本对照标本对照:经确认的阴性标本经确认的阴性标本经确认的阴性标本经确认的阴性标本n n试剂对照试剂对照试剂对照试剂对照:在在在在PCRPCR反应混合物中不加模板，进行反应混合物中不加模板，进行反应混合物中不加模板，进行反应混合物中不加模板，进行PCRP
34、CR扩增，以监测试剂是否污染（能控制贮存试扩增，以监测试剂是否污染（能控制贮存试扩增，以监测试剂是否污染（能控制贮存试扩增，以监测试剂是否污染（能控制贮存试剂可能出现的污染或加样器被剂可能出现的污染或加样器被剂可能出现的污染或加样器被剂可能出现的污染或加样器被DNADNA模板的气溶胶模板的气溶胶模板的气溶胶模板的气溶胶污染）。污染）。污染）。污染）。2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因32325.防止污染的方法n n合理分隔实验室合理分隔实验室合理分隔实验室合理分隔实验室:将样品的处理、配制将样品的处理、配制将样品的处理、配制将样品的处理、配制PCRPC
35、R反应液、反应液、反应液、反应液、PCRPCR循环扩增及循环扩增及循环扩增及循环扩增及PCRPCR产物的鉴定等步骤分区或分产物的鉴定等步骤分区或分产物的鉴定等步骤分区或分产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及室进行，特别注意样本处理及室进行，特别注意样本处理及室进行，特别注意样本处理及PCRPCR产物的鉴定应产物的鉴定应产物的鉴定应产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分与其它步骤严格分开。最好能划分与其它步骤严格分开。最好能划分与其它步骤严格分开。最好能划分标本处理区标本处理区标本处理区标本处理区;PCRPCR反应液制备区反应液制备区反应液制备区反应液制备区;PCRPCR循环扩
36、增区循环扩增区循环扩增区循环扩增区;PCRPCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNADNA或或或或RNARNA。n n吸样枪吸样枪吸样枪吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板吸入枪内
37、或粘上枪头是操作时不慎将样品或模板吸入枪内或粘上枪头是操作时不慎将样品或模板吸入枪内或粘上枪头是操作时不慎将样品或模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板时要十一个严重的污染源，因而加样或吸取模板时要十一个严重的污染源，因而加样或吸取模板时要十一个严重的污染源，因而加样或吸取模板时要十分小心。吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌分小心。吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌分小心。吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌分小心。吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。多次抽
38、吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因3333n n预混和分装预混和分装预混和分装预混和分装PCRPCR试剂试剂试剂试剂:所有的所有的所有的所有的PCRPCR试剂都应小量分试剂都应小量分试剂都应小量分试剂都应小量分装，如有可能，装，如有可能，装，如有可能，装，如有可能，PCRPCR反应液应预先配制好，然后反应液应预先配制好，然后反应液应预先配制好，然后反应液应预先配制好，然后小量分装，小量分装，小量分装，小量分装，-20-20保存。以减少重复加样次数，避保存。以减少重复加样次数，避保存。以减少重复加样次数，避保存。以减少重
39、复加样次数，避免污染机会。另外，免污染机会。另外，免污染机会。另外，免污染机会。另外，PCRPCR试剂，试剂，试剂，试剂，PCRPCR反应液应与反应液应与反应液应与反应液应与样品及样品及样品及样品及PCRPCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或产物分开保存，不应放于同一冰盒或产物分开保存，不应放于同一冰盒或产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。同一冰箱。同一冰箱。同一冰箱。n n防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头，小防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头，小防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头，小防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头，小离心管应一次性使用。离心管应一次性使用。离心管应
40、一次性使用。离心管应一次性使用。n n设立适当的阳性对照和阴性对照。设立适当的阳性对照和阴性对照。设立适当的阳性对照和阴性对照。设立适当的阳性对照和阴性对照。2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因3434n n减少减少减少减少PCRPCR循环次数，循环次数，循环次数，循环次数，只要只要只要只要PCRPCR产物达到检测水平产物达到检测水平产物达到检测水平产物达到检测水平就适可而止。就适可而止。就适可而止。就适可而止。n n选择质量好的选择质量好的选择质量好的选择质量好的EppendorfEppendorf管，管，管，管，以避免样本外溢及外以避免样本外溢及外以
41、避免样本外溢及外以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。防管内液体溅出。防管内液体溅出。防管内液体溅出。2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因35356.实验举例 本 实 验 以 含 有 小 鼠 基 因 T10的 质 粒pCMV-M
42、yc-T10为模板，扩增约800bp的产物。2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因3636nPCR仪仪、台台式式离离心心机机、灭灭菌菌的的微微量量离离心心管管、凝凝胶胶电泳系统等电泳系统等nTaKaRa Taq (5U/l)10PCR缓冲器缓冲器(含含Mg 2+)dNTP混合混合(各各2.5 mmol/L)模板模板(10ng，质粒，质粒)引物（引物（P1和和P2,10 mmol/L)实验仪器及材料实验仪器及材料10PCR缓冲液：(100 mmol/L Tris-HCl,pH8.3,500 mmol/L KCl,15mmol/L MgCl2)2023/1/2
43、62023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因3737InsertEcoR1Xho1pCMV-Myc-T102023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因3838P1:5TTCCAAGCTTCACCATGGCATCAATG CAGAAG C保护性碱基保护性碱基 Hind IIITm=4（GC）2（AT）41221170.P2:5TCGCGGATCCAGTGGCAGCTT GCTAATCTCATTG 保护性碱基保护性碱基 BamH I Tm=4（GC）2（AT）411213 70.2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的
44、基因3939PCR混合混合(50 l):模板模板:1 l(10ng)P1:1 l(10mmol/L)P2:1 l(10mmol/L)dNTPs:4 l(2.5mmol/L)Taq polymerase:0.5 l(5U/l)10缓冲液（缓冲液（Mg2+）:5 lddH2O:37.5 l 2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因4040PCR条件：条件：94变性变性5min后开始以下循环后开始以下循环 94变性反应变性反应45 sec；65退火反应退火反应45 sec；72延伸反应延伸反应1 min；进行进行30个循环；个循环；最后最后72反应反应7min；4
45、 冷却恒定。冷却恒定。2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因4141 PCR产物分析产物分析取取3-5l PCR产产物物，采采用用1.2琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分析析PCR产产物物的的量量，检检测测引引物物扩扩增增的的特特异异性性，并并可可根根据据标标准准脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸的的量量粗粗略略计计算算PCR产产物的总量。物的总量。PCRPCR结果：结果：脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸标标记记PCR产产品品1.0kb学生实验结果学生实验结果(4 l)1.不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物，分别称为限制性引物和非限制
46、性引物,其最佳比例一般是0.01mol/L：0.5mol/L，关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针 四、PCR的类型2023/1/2642PCR法获取目的基因 高浓度引物低浓度引物2023/1/2643PCR法获取目的基因2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因44442.降落PCR(touch-down PCR)n n 多循环的反应程序使退火温度越来越低。开始的多循环的反应程序使退火温度越来越低。开始的多循环的反应程序使退火温度越来越低。开始的多循环的反应程序使退火温度越来越低。开始的退火温度选择为高于退火温度选择为高于退火温
47、度选择为高于退火温度选择为高于TmTm值，随着循环进行，退火值，随着循环进行，退火值，随着循环进行，退火值，随着循环进行，退火温度逐渐降低到温度逐渐降低到温度逐渐降低到温度逐渐降低到TmTm值，并最终低于这个水平。值，并最终低于这个水平。值，并最终低于这个水平。值，并最终低于这个水平。n n选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的引物的引物的引物的TmTm值高出值高出值高出值高出5-105-10度，然后每个循环递减度，然后每个循环递减度，然后每个循环递减度，然后
48、每个循环递减1-21-2度。度。度。度。n n原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。特异性条带优先被扩增
49、。特异性条带优先被扩增。特异性条带优先被扩增。2023/1/262023/1/26PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因45453.热起动PCR(hot start PCR)n n 热起动热起动热起动热起动PCRPCR是除了设计好的引物之外，提高是除了设计好的引物之外，提高是除了设计好的引物之外，提高是除了设计好的引物之外，提高PCRPCR特异性最重要的方法之一。特异性最重要的方法之一。特异性最重要的方法之一。特异性最重要的方法之一。n n尽管尽管尽管尽管Taq DNATaq DNA聚合酶的最佳延伸温度在聚合酶的最佳延伸温度在聚合酶的最佳延伸温度在聚合酶的最佳延伸温度在7272，但，但，但，
50、但聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCRPCR反反反反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性产物。这些非特低于退火温度时会产生非特异性产物。这些非特低于退火温度时会产生非特异性产物。这些非特低于退火温度时会产生非特异性产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。异性产物一旦形成，就会被有效扩增。异性产物一旦形成，就会被有效扩