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1、第第八八章章高效液相色谱法高效液相色谱法1 1 高高 效效 液液 相相 色色 谱谱 法法（high-performance high-performance liquid liquid chromatography,chromatography,HPLCHPLC）又又称称高高压压液液相相色色谱谱法法。它它是是在在经经典典色色谱谱和和气气相相色色谱谱法法的的基基础础上上发发展展起起来来的的，在在色色谱谱理理论论方方面面没没有有本本质质的的差差别别。但但由由于于采采用用了了高高效效固固定定相相、高高压压输输液液泵泵、高高灵灵敏敏度度检检测测器器等等新新技技术术，因因而而有有了了更更高高的的效效率率
2、并并实实现了自动化。现了自动化。高压：高压：150-350*10150-350*105 5 PaPa 高效：大于高效：大于3000030000塔板塔板/米米 高灵敏：高灵敏：1010-9-9g g（紫外检测）、（紫外检测）、1010-11-11g g（荧光检测）（荧光检测）2 2 与经典色谱的比较与经典色谱的比较 一、与其它色谱方法比较一、与其它色谱方法比较经典经典LCLC：仅做为一种分离手段：仅做为一种分离手段特点特点：高压、高效、高速，是高沸点、热不稳定有：高压、高效、高速，是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。机及生化试样的高效分离分析方法。3 3与气相色谱比较与气相色谱比
3、较 以溶剂作流动相，流动相参与分离作用，以溶剂作流动相，流动相参与分离作用，分离能力强；适用范围广，气相色谱分离分析的分离能力强；适用范围广，气相色谱分离分析的化合物只占化合物的化合物只占化合物的30，而高效色谱对高沸点、，而高效色谱对高沸点、热不稳定、大分子量、离子型化合物等都有效，热不稳定、大分子量、离子型化合物等都有效，适合于生命物质的分析；分析过程中一般不破坏适合于生命物质的分析；分析过程中一般不破坏物质，因而可以方便地制备色谱纯物质。物质，因而可以方便地制备色谱纯物质。4 4项项 目目高效液相色谱法高效液相色谱法气相色谱法气相色谱法进样方式进样方式样品制成溶液样品制成溶液样品需气化或
4、裂解样品需气化或裂解流动相流动相溶液溶液惰性气体惰性气体分离原理分离原理吸附、分配、筛析、亲和吸附、分配、筛析、亲和等等吸附和分配吸附和分配检测器检测器UVDUVD、PDADPDAD、RIDRID等等TCDTCD、FIDFID、ECDECD等等应用范围应用范围低、中、高沸点有机化低、中、高沸点有机化合物合物离子型无机化合物离子型无机化合物热不稳定化合物热不稳定化合物生物活性分子生物活性分子低沸点有机化合低沸点有机化合物物永久性气体永久性气体5 5第一节 高效液相色谱的固定相和流动相（）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7
5、.01081.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。6 61.1.1.1.表面多孔型固定相表面多孔型固定相表面多孔型固定相表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相
6、对死体积小，出这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。薄，最大允许量受限制。固定相按孔隙深度分类，可分为固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型表面多孔型和全多孔型固定相两类。和全多孔型固定相两类。7 72 2 2 2全多孔型固定相全多孔型固定相全多孔型固定相全多孔型固定相 它由直径为它由直径为1010m m的的硅胶微粒凝聚而成硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗
7、粒很细（这类固定相由于颗粒很细（5 510m10m），），孔仍然较浅，孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。离及痕量分析。8 8 9 9（二）流动相二）流动相 由由于于高高效效液液相相色色谱谱中中流流动动相相是是液液体体，它它对对组组分分有有亲亲和和力力，并并参参与与固固定定相相对对组组分分的的竞竞争争。因因此此，正正确确选选择择流流动动相相直直接接影影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1 1）溶溶剂剂对对于于待待测测样样品品，必必须须具具有有合合适适的的极极性性
8、和和良良好好的的选择性。选择性。（2 2）溶剂要与检测器匹配）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长截止波长要长。要长。所谓溶剂的所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。下表列出了一些常用溶剂的紫外严重干扰组分的吸收测量。下表列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。截止波长。对对于于折折光光率率检检测测器器
9、，要要求求选选择择与与组组分分折折光光率率有有较较大大差差别别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。10101111（3 3）高高纯纯度度。由由于于高高效效液液相相灵灵敏敏度度高高，对对流流动动相相溶溶剂剂的的纯纯度度也也要要求求高高。不不纯纯的的溶溶剂剂会会引引起起基基线线不不稳稳，或或产产生生“伪伪峰峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加5050IOOnmIOOnm。（4 4）化学稳定性好化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。(5)(5)低粘度低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，
10、不利于分。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离柱或检测器内形成气泡，影响分离.1212第二节第二节 高效液相色谱的主要类型和分类高效液相色谱的主要类型和分类按按分分离离原原理理可可分分为为：吸吸附附色色谱谱（液液固固吸吸附附色色谱谱）；分分配配色色谱谱（液液液液分分配配色色谱谱）；离离子子交交换换色色谱谱；体体积积排排阻阻色色谱（凝胶色谱、空间排阻色谱）。谱（凝胶
11、色谱、空间排阻色谱）。按流动相、固定相的相对极性分类：按流动相、固定相的相对极性分类：固定相的极性大于流动相的极性，称为固定相的极性大于流动相的极性，称为正相色谱；正相色谱；反反之，固定相的极性小于流动相的极性的称为之，固定相的极性小于流动相的极性的称为反相色谱反相色谱。1313液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据待分离液固色谱实质是根据待分离的物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。的物质在固定相上的吸附作用不
12、同来进行分离的。一、液一、液-固吸附色谱法固吸附色谱法1414当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。当待测试样面的活性中心就要吸附流动相分子。当待测试样分子（分子（X）被流动相带入柱内，就要取代数目相）被流动相带入柱内，就要取代数目相当的已被吸附的流动相分子，于是，在固定相表当的已被吸附的流动相分子，于是，在固定相表面发生交换（竞争）吸附面发生交换（竞争）吸附:Xm n Mad Xad nMm1分离原理分离原理1515其中其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱
13、。上保留强，难于洗脱。Kad值小，则保留值弱，易值小，则保留值弱，易于洗脱，试样中各组分据此得以分离。于洗脱，试样中各组分据此得以分离。竞争吸附达平衡时，有竞争吸附达平衡时，有 16162固定相固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。化学反应等，因此，以硅胶用得最多。在在高高效效液液相相色色谱
14、谱法法中中，表表面面多多孔孔型型和和全全多多孔孔型型都都可可作作吸吸附附色色谱谱中中的的固固定定相相，它它们们具具有有填填料料均均匀匀、粒粒度度小小。孔孔穴穴浅浅的的优优点点，能能极极大大地地提提高高柱柱效效。但但表表面面多多孔孔型型由由于于试试样样容容量量较较小小，目前最广泛使用的还是目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。全多孔型微粒填料。17173.流动相流动相 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。液一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。液-固固吸附色谱中常用有机溶剂作为流动相。在吸附色吸附色谱中常用有机溶剂作为流动相。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；谱中对极性大的试样往往采用
15、极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（0）来衡量。来衡量。0 越大，表示洗脱剂的极性越强。越大，表示洗脱剂的极性越强。1818表中列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的表中列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的 0值。值。在硅胶吸附剂中在硅胶吸附剂中 0值的顺序相同，数值可换算（值的顺序相同，数值可换算（0硅胶硅胶0.77 0氧化铝）。氧化铝）。1919液固吸附色谱适用于分离那些能溶解在非极性溶液固吸附色谱适用于分离那些能溶解在非极性溶剂中、具有中等分子质量的非离子型（油溶性）剂中、具有中
16、等分子质量的非离子型（油溶性）的试样；对具有相同官能团但数目不同的化合物的试样；对具有相同官能团但数目不同的化合物或者异构体也有较高选择性；或者异构体也有较高选择性；缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；2020二二 分配色谱和化学键合相色谱分配色谱和化学键合相色谱液液-液分配色谱法，是马丁及辛格于液分配色谱法，是马丁及辛格于19411941年创立的。年创立的。液液-液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同
17、的分配系数。配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。了分离效率，从而能分离各种复杂组分。固定相与流动相均为液体（互不相溶），固定相与流动相均为液体（互不相溶），但在高效液相色但在高效液相色谱法中，使用的固定相是经特殊处理得到的。谱法中，使用的固定相是经特殊处理得到的。2121 固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液易流失，现在较少采用；：早期涂渍固定液，固定液易流失，现在较少采用；为了解决这一矛盾，采用
18、化学键合固定相，为了解决这一矛盾，采用化学键合固定相，化学键合固定相化学键合固定相：将不同基团通过化学反应键合到硅胶（载体）表面的游离羟将不同基团通过化学反应键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上。基上。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有约有3/43/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。以上的分离问题是在化学键合
19、固定相上进行的。22221.化学键合固定相化学键合固定相 目前化学键合固定相一般以硅胶（薄壳型或全目前化学键合固定相一般以硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体，经酸、碱洗、中和、干燥和多孔微粒型）为基体，经酸、碱洗、中和、干燥和活化等处理后，再利用表面上的硅羟基与某种有机活化等处理后，再利用表面上的硅羟基与某种有机物或有机硅化合物反应，制备成化学键合固定相。物或有机硅化合物反应，制备成化学键合固定相。键合上去的有机基团主要有三大类：键合上去的有机基团主要有三大类：疏水基团疏水基团不同链长的烷基和苯基等；不同链长的烷基和苯基等；极性基团极性基团氨基、氰基、醚基和醇基等；氨基、氰基、醚基和醇基等；离
20、子交换基团离子交换基团阴离子交换基团胺基、季铵基、阴离子交换基团胺基、季铵基、阳离子交换基团磺酸基。阳离子交换基团磺酸基。23232.正相键合相色谱法正相键合相色谱法 固定相固定相采用极性的有机基团，采用极性的有机基团，CN、NH2、双羟基、双羟基等键合在硅胶表面；等键合在硅胶表面；流动相流动相采用非极性或极性小的溶剂（如烃类）中采用非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙醇等）。加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙醇等）。它多用于分离异构体、极性不同的化合物，它多用于分离异构体、极性不同的化合物，此时，组分的分配比此时，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，值随其极性
21、的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。但随流动相极性的增加而降低。24243.反相键合相色谱法反相键合相色谱法 固定相固定相是采用极性较小的键合固定相，如是采用极性较小的键合固定相，如硅胶硅胶C18H37、硅胶苯基等；、硅胶苯基等；流动相流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛水、水和无机盐的缓冲溶液等。乙睛水、水和无机盐的缓冲溶液等。2525它多用于分离多环芳烃等低极性化合物；若采用含一定比它多用于分离多环芳烃等低极性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙睛的水溶液为流动相，也可用于分离极性化例的甲醇或乙睛的水溶液为流动相，也可用于分离极性化合物；若采用水和无机
22、盐的缓冲液为流动相，则可分离一合物；若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚等。些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚等。反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。的优点。26263.离子性键合相色谱法离子性键合相色谱法 当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如合各种离子交换基团，如COOH、SO3H、NHCH3、N（CH3）2等时，就形成了离子性键等时，就形成了离子性键合相色谱的合相色谱的固定相固定相；流动相流动相一般采用缓冲溶液。
23、一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。其分离原理与离子交换色谱类同。2727 以上讨论了各种类型化学键合相色谱法，归纳键合相色谱以上讨论了各种类型化学键合相色谱法，归纳键合相色谱的最大优点是：通过改变流动相的组成和种类，可有效地分的最大优点是：通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。此外，由于离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。此外，由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗。键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗。据统计，在高效液相色谱法中，约有据统计，在高效液相色谱法中，约有80的分离问题是的分离问题是用键合相色谱法解
24、决。此法的最大缺点是不能用于酸、碱用键合相色谱法解决。此法的最大缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。2828三、三、离子交换色谱法离子交换色谱法 此法是利用此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例仅适用无机离子混合物的分离
25、，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。广。固定相固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂；阴离子交换树脂或阳离子交换树脂；流流动动相相：阴阴离离子子离离子子交交换换树树脂脂作作固固定定相相，采采用用酸酸性性水水溶溶液液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；2929基本原理：基本原理：组分在固定相上发生的离子交换反应；组分在固定相上发生的离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式
26、等有关。亲和力大，保留时间长。电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长。阳离子交换反应：阳离子交换反应：R-Y+Mm+R-M+Ym+阴离子交换反应：阴离子交换反应：R+Y-Xm-R+X-Ym-在离子交换色谱中，常通过改变流动相中反离子的种类、在离子交换色谱中，常通过改变流动相中反离子的种类、浓度及流动相的浓度及流动相的pH值等来控制值等来控制k值，改变选择性。值，改变选择性。3030 离子交换色谱法在无机离子的分析和应用中受离子交换色谱法在无机离子的分析和应用中受到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的组到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的组分，需采用电导检测器，由于被测离子的电导信
27、号分，需采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的被强电解质流动相的高背景电导信号高背景电导信号掩没而无法检掩没而无法检测。为了解决这一问题，测。为了解决这一问题，1975年年Small等人提出一等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。四、离子色谱法四、离子色谱法3131 离离子子色色谱谱法法与与离离子子交交换换色色谱谱的的区区别别是是在在离离子子交交换换分分离离柱柱后后加加一一根根抑抑制制柱柱，抑抑制制柱柱中中装装填填与与分分离离柱柱电电荷荷相相反反的的离离子子交交换换树树脂脂。通通过过分分离离柱柱后后的的样样品品再再经经过过抑
28、抑制制柱柱，使使具具有有高高背背景景电电导导的的流流动动相相转转变变成成低低背背景景电电导导的的流流动动相相，从从而而用用电电导导检检测测器可直接检测各种离子的含量。器可直接检测各种离子的含量。3232若样品为阳离子，用无机酸（若样品为阳离子，用无机酸（HCl）作流动相，抑制柱为高）作流动相，抑制柱为高容量的容量的强碱性阴离子交换剂（强碱性阴离子交换剂（OH-）。当试样经阳离子交换。当试样经阳离子交换剂的分离柱后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个剂的分离柱后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：重要反应：R+OH-H+Cl-R+Cl-H2OR+OH-M+Cl-R+Cl-M+O
29、H-由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+M+转变成相应的转变成相应的碱，由于碱，由于OH-OH-离子的淌度为离子的淌度为Cl-Cl-离子的离子的2.62.6倍，提高了所测阳离子电导的倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。同理对于阴离子样品也有相似的作用机理。检测灵敏度。同理对于阴离子样品也有相似的作用机理。3333五、五、体积排阻色谱体积排阻色谱固定相固定相：凝胶（具有一定大小孔隙分布）；原原理理：按分子大小分离。小
30、分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快。3434尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子物质相对分子量的分尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子物质相对分子量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：布。它具有其他液相色谱所没有的特点：（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息；构的某些信息；（2）保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较）保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器；低的检测器；（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子）固定相与分子间作用力极
31、弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长；不能很强保留分子，因此柱寿命长；（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于差别必须大于10才能得以分离。才能得以分离。3535 排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，而且与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。选择溶剂还必须与所用的检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。体积排阻色谱法不采用改变流动相组成来改善分离度。3636第三节第三节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪3737液相色谱仪（液相色谱仪（2）3838液相色谱仪（液相色谱仪（3）3939液相色谱仪
32、（液相色谱仪（4）4040流程及主要部件流程及主要部件1.1.流程图流程图动画演示动画演示4141 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是高压输液泵是核心部件核心部件。1.1.储液罐（贮液槽）储液罐（贮液槽）是用于贮存足够量的流动相的容器
33、，是用于贮存足够量的流动相的容器，常用材料为玻璃或不锈钢等。使用过程应密闭。常用材料为玻璃或不锈钢等。使用过程应密闭。所用溶剂及样品在使用前应过滤。所用溶剂及样品在使用前应过滤。一、高压输液系统一、高压输液系统4242流动相过滤器流动相过滤器样品过滤器样品过滤器43432.流动相脱气流动相脱气HPLCHPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大
34、，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂溶解气体还会引起溶剂pHpH的变化，对分离或分析结果带来的变化，对分离或分析结果带来误差。误差。4444常用的脱气方法有：常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。溶剂挥发造成的组成变化。超声脱气比较好，超声脱气比较好，10
35、102020分钟的超声处理对许多有机溶分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般水混合液的脱气是足够了（一般500ml500ml溶液需超溶液需超声声202030min30min方可），此法不影响溶剂组成。方可），此法不影响溶剂组成。离线（系统外）离线（系统外）脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，气体立即脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中。在开始回到溶剂中。在1 14 4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。在线（系统内）脱气法在线（系统内）脱气法无此缺点。最常用的在线脱气法无此缺点。
36、最常用的在线脱气法为鼓泡，即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。为鼓泡，即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此方法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的严格来说，此方法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。此外还有在线真空脱惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。此外还有在线真空脱气机。气机。4545对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分为可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液
37、泵分为恒流恒流泵泵和和恒压泵恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它们各有优缺点。目，故保留时间的重现性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
38、往复式恒流柱塞泵3.3.高压泵高压泵46464.4.梯度洗脱装置梯度洗脱装置高压梯度洗脱高压梯度洗脱:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。低压梯度洗脱低压梯度洗脱:一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。4747二、进样系统二、进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5 530cm30cm），），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道柱外的因素
39、所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。对进样技术要求较严。进进样样阀阀4848直接进样、停流进样、高压六通阀进样。直接进样、停流进样、高压六通阀进样。通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：所示：4949三、三、分离系统（色谱柱）分离系统（色谱柱）色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部色谱柱是液相色谱的心
40、脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱体为直型不锈钢管，内径分。柱体为直型不锈钢管，内径26 mm，柱长柱长1050 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。一般在分离前备有一个保护柱，可以除去溶剂中的颗粒和一般在分离前备有一个保护柱，可以除去溶剂中的颗粒和污染物质，并可使淋洗溶剂由于经过保护柱为其中的固定液污染物质，并可使淋洗溶剂由于经过保护柱为其中的固定液饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定液，保证分离饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定液，保证分离的性能不受影响。的性能不受影响。5050四、四、检测系统检测系统a.紫外检测器紫外检测器
41、应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：特点：灵敏度高；流通池可做的很小（1mm 10mm，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。5151b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要发展；紫外检测器的重要发展；光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：1024个个二二极极管管阵阵列列，各各检检测测特特定定波波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。5252c.荧光检测器荧光检测器 fluorescence detector高灵敏度、高选择性；高灵敏度
42、、高选择性；对对多多环环芳芳烃烃，维维生生素素B、黄黄曲曲霉霉素素、卟卟啉啉类类化化合合物物、农农药药、药药物物、氨氨基基酸酸、甾甾类类化化合合物物等等有有响响应。应。5353d.示差折光检测器示差折光检测器 differential refractive index detector除除紫紫外外检检测测器器之之外外应应用用最最多多的的检检测测器器；通通用用型型检检测测器器（每每种种物物质质具具有有不不同同的的折折光光指指数数）；可可连连续续检检测测参参比比池池和和样样品品池池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比。中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比。灵灵敏敏度度低低、对对温温
43、度度敏敏感感、不能用于梯度洗脱；不能用于梯度洗脱；偏偏转转式式、反反射射式式和和干干涉涉型型三种；三种；5454第四节第四节 高效液相色谱分离条件的选择高效液相色谱分离条件的选择考虑分离方法的选择，主要考虑以下三个方面：考虑分离方法的选择，主要考虑以下三个方面：（1）相相对对分分子子量量 分分子子量量小小于于200的的一一般般选选用用气气相相法法；2002000的的选选用用液液液液、液液固固、或或离离子子交交换换色色谱谱法法；大大于于2000的可用排斥色谱法。的可用排斥色谱法。（2）溶溶解解度度 水水溶溶性性样样品品最最好好用用离离子子交交换换或或液液液液分分配配色色谱谱法法；微微溶溶于于水水
44、的的，但但在在酸酸、或或碱碱存存在在下下能能很很好好离离解解的的，可可用用离离子子交交换换色色谱谱法法；油油溶溶性性、或或相相对对极极性性较较弱弱的的混混合合物物，可用液固色谱法。可用液固色谱法。（3）化学结构）化学结构 离子型、或易离子化、或易形成离子对离子型、或易离子化、或易形成离子对的化合物宜用离子色谱法；异构体的分离，宜用液固色的化合物宜用离子色谱法；异构体的分离，宜用液固色谱法；同系物的分离，宜用液液分配色谱法；高分子化谱法；同系物的分离，宜用液液分配色谱法；高分子化合物宜用排斥色谱法。合物宜用排斥色谱法。55555656练习练习1、液相色谱适宜的分析对象是（、液相色谱适宜的分析对象
45、是（）。）。A 低沸点小分子有机化合物低沸点小分子有机化合物 B 高沸点大分子有机化合物高沸点大分子有机化合物 C 所有有机化合物所有有机化合物 D 所有化合物所有化合物2、在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（、在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（）。）。A 异构体异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物沸点相近，官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样极性变化范围宽的试样B BD D57573、吸附作用在下面哪种色谱方法中起主要作用（、吸附作用在下面哪种色谱方法中起主要作用（）A 液一液色谱法液一液色谱法 B 液一固色谱法液一固色谱法 C 键合相色谱法键
46、合相色谱法 D 离子交换法离子交换法4、液相色谱中通用型检测器是（、液相色谱中通用型检测器是（）。）。A 紫外吸收检测器紫外吸收检测器 B 示差折光检测器示差折光检测器 C 热导池检测器热导池检测器 D 荧光检测器荧光检测器B BB B58585、离子色谱的主要特点是（、离子色谱的主要特点是（）。）。A 高压、高效、高速、高分辨率、高灵敏度高压、高效、高速、高分辨率、高灵敏度 B 采用柱后抑制技术和电导检测，特别适合离采用柱后抑制技术和电导检测，特别适合离子分析子分析 C 采用了阴离子专用检测器，对阴离子分析有采用了阴离子专用检测器，对阴离子分析有高灵敏度高灵敏度 D 采用紫外检测器合柱压衍生装置，对离子分采用紫外检测器合柱压衍生装置，对离子分析有高效析有高效B B5959