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1、不同抗性烟草种质对CMV侵染的细胞响应差异分析文柳嘤程亚增 郑业强 程立锐 刘旦 蒋彩虹 张映杰杨爱国表1台烟8号和NC82病级分布l able 1 Disease grade frequency distribution of T.T.8 and NC82品种 Varieties各病级株数Plant numbers of each disease grade总株数病情不。级1 级3 级5 级7 级9 级To（葡 plant number Disease index台烟8号NC82166573009112.33，0033322318975.782.3 CMV侵染后烟草不同抗、感品种细胞内膜系统
2、结构变化在对台烟8号和NC82的发病叶片超微结构进行观察时发现，两个品种在病毒侵 染后内膜系统发生了不同变化。其中，NC82病变细胞中，内膜系统出现异常扩 大且层叠扭曲（图5F, H）；细胞液泡内部出现大小不均一的囊泡，而且局部液 泡内部有颗粒状物质，推测这是由CMV病毒颗粒聚集产生（图5G）；病变细胞 中过氧化物酶体也发生畸形，其内部也充满大小不均一的颗粒（图5E）。由此 推测，CMV可能利用NC82的内膜系统进行复制，使得细胞产生内质网应激，生 理功能发生紊乱。而在抗病品种台烟8号的病变细胞中，上述现象较少，但可 观察到大量形状规那么，偏圆形，大小在0.31.0 um左右且内含囊泡性质物质
3、 的自噬小体出现在细胞壁附近（图5A-D）。自噬小体内有降解细胞物质的功 能，因此，台烟8号有可能通过自噬小体降解CMV病毒从而产生防御反响，详 细过程仍需进一步研究。另外，在台烟8号深绿区域细胞中观察到过氧化物酶 体出现，而过氧化物酶能够调节细胞的活性氧代谢水平，维护细胞膜的稳定性。这或许与台烟8号对CMV表现抗病的 机制有关。总之，受CMV病毒侵染后，两个品种在内膜系统结构上的差异可能 与限制病毒复制有关，这也是进一步解析台烟8号对CMV抗病机制的切入点。3讨论3. 1 CMV侵染烟草的细胞学研究目前，对CMV侵染烟草的病理学研究主要是根据叶片表型和病情指数分析不同 品种的抗性，缺乏从细胞
4、学角度分析抗、感材料接种CMV病毒后的受损情况， 以及细胞学结构变化差异。徐鹏飞等报道，疫霉根腐病菌对不同抗性大豆品种 细胞结构的影响不同，抗病大豆下胚轴细胞结构略有变化，而感病大豆几乎无 完整细胞结构。文柳嘤等研究指出，TMV侵染不同抗性烟草品种72 h后，抗病 和感病品种相比其叶绿体等细胞器均出现显著差异。本研究分析了 CMV病毒IB 亚组接种烟草叶片后心叶发病过程和发病病症，同时利用TME观察了轻微花 叶、泡斑、深绿和褪绿4种发病病症的叶肉细胞超微结构。结果说明，抗病品种台烟8号总体表现病症轻于感病品种NC82,其细胞病变程度也轻于感病品 种；在感病品种NC82中，泡斑病症的细胞病变程度
5、重于花叶病症；褪绿病症的叶 肉细胞病变程度重于深绿病症。而CHEN等研究指出在深绿病症细胞中，叶绿体 比褪绿中的更有序，且其抗性相关的代谢物表达水平也比褪绿中的高。这说明 细胞结构的变化反响出细胞生化功能的变化程度。本研究从亚细胞水平解析 CMV病毒对烟叶细胞内超微结构影响，为从细胞学上解析烟草抗病机理提供理 论依据。3.2 活性氧代谢与烟草CMV抗性活性氧迸发（ROS）是植物抵抗病原菌侵染的一种有效手段。细胞中过氧化物酶 体能够清除细胞内的活性氧，减少活性氧对细胞结构损伤，因此过氧化物酶体 的活性与植物的抗病性密切相关。QUEIROS等研究报道马铃薯愈伤组织在盐胁 迫下，细胞整体结构会发生改
6、变，亚细胞结构如叶绿体、线粒体、过氧化物等 也发生了重塑。在本研究中发现，抗病品种台烟8号发病叶片深绿部位中，其 过氧化物酶体形态保持正常，并且紧邻线粒体，而感病品种NC82发病叶片中过 氧化物酶体出现畸形，由此推测两品种细胞ROS的调控系统可能存在差异。活性氧还是调控很多代谢途径的信号因子，与抗病基因的表达水平息息相关。 SUN等研究指出，烟草接种CMV、TMV后会引起h型硫氧还蛋白（NtTRXh3）特 异性表达，过表达NtTRXh3可提高烟草对病毒的抗性，而沉默NtTRXh3基因那么 会增加烟草感病程度。此外，TADA等指出硫氧还蛋白可调节病程相关基因非表 达子NPR1的构象，从而诱导病程
7、相关基因的表达，使植株产生抗性。由于硫氧 还蛋白受细胞内氧化水平调控，因此台烟8号与NC82的ROS水平差异可能影响 抗病基因表达水平，这或许是台烟8号病程延缓或抗性产生的原因。3.3 细胞内膜系统与烟草CMV抗性细胞内膜系统是细胞功能实现的重要组成局部。CMV病毒侵染本氏烟和三生 烟，会导致寄主细胞内膜系统发生紊乱，产生内质网应激，重构形成特异的细 胞结构，如小泡、多泡体等。单链正义RNA病毒复制复合体与细胞内膜密不可 分。雀麦草花叶病毒（BMV）的RNA复制依赖于类脂双层膜中脂肪酸的构成。酵 母基因参与调节细胞膜流动性，其功能缺失突变体会严重抑制BMV的复制。本 研究中，NC82内膜系统出
8、现大量异常，液泡内部出现囊泡结构，并内含一些颗 粒物质（图5G, H）,推测为CMV侵染NC82的细胞后形成的特异性结构，从而 为病毒复制提供环境。另一方面，动物RNA病毒侵染可使细胞产生内质网应激，引起内质网的未折叠蛋白鹰答，继而产生细胞自噬。植物病毒TMV-U1株系 侵染亮黄烟72 h也出现自噬现象。TMV侵染Hela肿瘤细胞后，细胞也产生自 噬。本研究中台烟8号发病叶多表现为轻微花叶病症，感病细胞中出现大量自 噬现象，并且靠近细胞壁出现很多小囊泡（图7A-D）,这可能与细胞清除CMV 病毒，限制CMV病毒复制相关，也是台烟8病程延缓、发病较轻的原因。目前，趣草CMV抗性分子机制尚不清楚，
9、课题组已经利用SSR, SNP等标记尝试 定位台烟8号的CMV抗性主效基因，并已经获得一些候选基因。本研究从细胞 学角度解析台烟8号的抗性机理，研究结果为进一步说明CMV抗性机制提供实 验证据，为精确定位抗性基因提供筛选依据。4结论通过比照台烟8号和NC82在CMV侵染后4种发病病症的叶肉细胞超微结构变化 差异，发现：（1）泡斑病症细胞内的病毒复制积累水平高于轻微花叶病症，其 叶绿体和线粒体病变程度重于花叶病症。褪绿区域细胞的叶绿体严重畸形，其 光合作用和淀粉合成功能损失重于深绿区域。(2)发病叶中的线粒体、过氧化 物酶体和细胞自噬等结构，三者在台烟8号中的形态比NC82中的形状更规那么， 结
10、构更有序，这些结构差异可能与台烟8号抗病机制有关。Reference代帅帅，任民，蒋彩虹，等.烟草骨干亲本主要病毒病抗性鉴定及遗传多样性 分析J.中国农业科学，2015, 48 (6) ： 1228-1239.DAI S S, REN M, JIANG C H, et al. Identification of resistance to main virus diseases and genetic diversity study of tobacco foundation parentsJ. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48 (6) ：1228-1
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29、8号发病病症多为花叶，NC82发病病症多泡斑和深绿、褪绿区域相间；（2）比照NC82轻微花叶和泡斑 的超微结构发现，二者叶绿体类囊体片层都减少，但泡斑病症细胞内线粒体崎 和CMV颗粒密度都高于轻微花叶病症细胞，说明泡斑的细胞病变程度重于花叶 病症;比照NC82和台烟8号的深绿和褪绿区域细胞超微结构发现，深绿区域的 叶绿体形态较完整，而褪绿区域的叶绿体严重变形、类囊体片层紊乱、淀粉粒 畸形或消失，说明褪绿区域叶肉细胞病变程度重于深绿区域；(3)比照所有病 变叶片中过氧化物酶、自噬小体及内膜系统结构发现，台烟8号在CMV侵染 后，其三者形态结构都比NC82的更规那么有序。研究结果为进一步探究抗CM
30、V烟 草品种的抗性分子机制提供理论依据。Key：黄瓜花叶病；透射电子显微镜;超微结构；自噬：S435.72： 1007-5119 (2019) 03-0067-08 D0I：10. 13496/j. issn. 1007-5119. 2019. 03. 010： In order to reveal the cytological mechanism of tobacco resistance to CMV, we compared the ultrastructure of the leaves between resistant variety Taiyan 8 (T. T. 8) and
31、 susceptible variety NC82 after CMV inoculation by transmission electronic microscopy (TEM). The results showed that (1) After CMV infection, the disease symptoms of T. T. 8 were mild mosaic, while that of NC82 often were bubble spot, light green island (LGI) and dark green island(DGI) .(2) Comparin
32、g the ultrastructure of mild mosaic and bubblespot in NC82, thylakoid lamellae of both symptoms were reduced, but the density of mitochondrial cristae and CMV coat particles in bubble spot cell was higher than that in slight mosaic. This indicated that the damage degree of cell structure of bubble s
33、pot was more severe than mild mosaic. Comparing the ultrastructure of LGI and DGI in NC82 and T. T. 8, the structure of chloroplasts in DGI was integrated, while chloroplasts in LGI were seriously deformed, thylakoid lamellae was disordered, starch granules were abnormal or disappeared. It inferred
34、that the degree of cell structure lesion in LGI was more serious than that in DGI. (3) Comparing to all pathological leaves, the morphology of autophagy structure, peroxisome and endomembrane system in T. T. 8 were more orderly than NC82. The results from this study provide theoretical basis for fur
35、ther study on molecular resistance mechanisms of T.T. 8.cucumber mosaic virus； transmission electronic microscopy (TEM)； ultrastructure； autophagy黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)病是危害烟草的主要病毒病之 一，在烟草整个生育期都可以导致植株发病，严重影响烟叶的产质量及经济效 益。通过解析烟草与CMV的互作机制，可为挖掘抗病基因、培育抗病品种提供 理论依据，从而进一步推动抗CMV烟草品种的选育。烟草受CMV侵染后发病
36、初期表现为明脉，随后开展成花叶、斑驳或泡斑，发病 后期形成明显的深绿和褪绿区域。通过细胞超微结构观察，CMV侵染会导致叶 绿体结构肿胀、外膜破裂、内部片层松散，直至整个叶绿体解体。而对于不同 发病病症的叶肉细胞，其细胞超微结构有所不同，发病叶片的深绿区域细胞中 叶绿体形态相对正常，类囊体数量较多且基粒堆叠紧密；而褪绿区域叶绿体中类 囊体较少，基粒不完整且形态异常。CMV侵染还会引起烟草其他细胞器的变 化，如CMV侵染后诱导内质网应激，细胞器降解。CMV病毒有多个亚组，不同亚组的致病力差异较大，引起烟草表型也不同，亚 组n侵染后烟株发病较轻，亚组I能引起严重的褪绿、矮化甚至坏死病症，CMV (Y
37、)的突变株侵染黏烟草后能够引起接种部位局部坏死。而植物细胞抵御 CMV不同病毒亚组，其互作机制也有所差异，如活性氧迸发，细胞自噬等。本 研究针对我国绝大局部烟区的CMV主流病毒IB亚组，利用透射电子显微镜(TEM)观察CMV侵染不同抗性烟草品种的叶片超微结构变化，分析引起其细胞 结构改变的原因，为揭示CMV与烟草互作机制提供细胞学证据，同时为有针对 性培育抗CMV烟草品种提供理论依据。1材料与方法1试验材料供试烟草材料为CMV抗病品种台烟8号，感病品种NC82。CMV病毒为目前我国 云南、贵州、湖南等烟叶主产区的主流病毒IB亚组。烟草种子和CMV病毒均由 中国农业科学院烟草研究所烟草遗传育种研
38、究中心保存。1.2 材料种植及病毒接种烟草材料按照托盘育苗法育苗，每个材料播种3盘，每盘32株，于人工气候室 培养，培养条件为(251) ,光照16 h/do CMV病毒采用摩擦接种法接种烟 苗最上部叶，方法Reference12。1.3 病情调查 烟草幼苗接种CMV病毒后30 d进行病情调查，调查方法同文献13。1.4 超薄切片制备及TEM观察接种CMV病毒后，取两个品种接种后的发病心叶叶片，以PBS处理同时期两品 种未接种病毒的健康心叶为对照。样品切成1 mmX5 mm大小，用2. 5%戊二醛 前固定24 h, 1%钺酸后固定1.5 h。乙醇系列脱水，环氧树脂812包埋，10 放置17 h
39、, 15 放置20 h, 60 放置17 ho样品切片厚度为5070 urn, 利用柠檬酸铅和醋酸双氧铀在25 T下分别对样品进行20 min染色，在透射电 镜下观察并拍照。2结果CMV侵染后烟草不同抗、感品种的发病情况接种CMV 30 d后，台烟8号的病情指数为12.33 （表1）,表现为高抗，多数 叶片发育正常，仅个别叶片出现轻微花叶，植株生长健壮，无明显矮化现象； NC82病情指数为75.78,表现为高感，发病严重，多数叶片发育畸形，叶缘卷 曲，细长且褪绿，并出现黄绿相间的泡斑和深绿斑点，多数烟株矮化无法正常 生长。观察两品种接种CMV后020 d心叶发病情况，发现接种CMV 8 d时，
40、NC82第 一片心叶表现轻微花叶，而台烟8号无发病病症；接种CMV后13 d,台烟8号 第一片心叶才出现轻微花叶。接种CMV 20 d后，NC82心叶生长受到抑制，出 现皱缩和泡斑，而台烟8号仅表现轻微花叶，叶片大小无明显变化。2.1 CMV侵染后烟草不同发病时期的细胞超微结构变化 为进一步明确CMV病毒对烟草叶片细胞结构造成的损伤，分析了感病品种NC82 在接种CMV后不同时期（8 d、20 d和30 d）的叶片细胞超微结构变化。结果 如图1所示，经PBS处理未接种病毒的NC82 （设为CK）叶片细胞结构完整，叶 绿体、线粒体的内部结构清晰，过氧化物酶体形态正常（图1A, E, I） o接种
41、 病毒8 d的NC82烟株叶片出现轻微花叶病症，细胞结构异常，主要表现在：叶 绿体外部围绕着囊泡且叶绿体瘦长，类囊体片层变薄，淀粉粒消失（图1B, C, H）；线粒体崎褶皱增多（图IC, K）；过氧化物酶体内，物质密度不均，结 晶形状不规那么（图1J）；细胞质中出现直径约20 nm的CMV病毒颗粒（图 IL） o从而说明，在烟叶发生轻微花叶时，CMV病毒颗粒就已在细胞质中积 累，病毒复制引起叶绿体类囊体片层减少，叶片光合作用减弱、呼吸作用增 强，而且细胞内的活性氧水平也会发生改变。接种CMV病毒20 d的NC82叶片出现泡斑皱缩，细胞质中充满了病毒颗粒（图 2C, D）,叶绿体类囊体片层变薄，
42、膜结构已经不清晰（图2A, B） o同时，该 时期细胞内线粒体数目增加，体积膨大，崎褶皱增多（图2E）。整体上，接种 20 d细胞内CMV复制积累数量增加，导致叶片光合作用进一步下降，呼吸作用 进一步增强，病毒对叶片的细胞结构破坏增强。接种CMV病毒30 d时，从表型上看，NC82发病叶上出现明显的深绿和褪绿分 区。对超微结构观察发现，深绿区域细胞的叶绿体与对照相似，类囊体片层轻 微疏松，淀粉粒结构清晰，但线粒体外膜有明显破损（圈3A-F）。而褪绿区域 的细胞中，叶绿体形状不规那么，类囊体片层模糊，片层间无连接，淀粉粒畸形 或消失（图3G, H） o此外，褪绿区域的细胞中，线粒体也出现畸形，其
43、内部 崎密度明显增多（图31）。以上说明，CMV的进一步侵染会严重破坏褪绿区域 细胞的光合作用和淀粉合成功能，并且褪绿区域的叶片颜色发黄，这可能与其 叶绿体结构和生理功能损失有关。与此同时，台烟8号接种CMV病毒30 d后也偶尔出现深绿和褪绿病症。对抗、 感材料中两种病症的超微结构进行比照。结果发现，无论是在发病叶片的深绿 区域，还是褪绿区域，两个品种叶肉细胞叶绿体结构相似。例如在发病叶片的 深绿区域，叶绿体和淀粉粒均为结构清晰，类囊体片层疏松（图4D, E）；在褪 绿区域，叶绿体和淀粉粒形状畸形，类囊体片层模糊（图4G, H） o但是在发 病叶片的深绿区域，抗病品种台烟8号的过氧化物酶体和线粒体形态正常，并 聚集在一起（图4F）,而感病品种NC82中线粒体外膜破损，内含物外流。在 褪绿区域细胞内，两品种线粒体都发生重塑，抗病品种台烟8号中，线粒体崎 不可见且内部中空，而感病品种NC82线粒体与之相反，内部崎显著增多。线粒 体是细胞的供能细胞器，为生化反响提供能量，台烟8号深绿区域的线粒体保 持完整性，并与过氧化物酶体聚集，这可能为细胞上调表达抗性相关代谢物的 合成，提供充足的能量。而病毒复制也大量消耗寄主能量，线粒体褪绿区域的 细胞中发生重塑，可能与病毒复制有关。从线粒体在抗、感品种的不同表现推 测，线粒体在台烟8号抗病过程中可能发挥一定作用。