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1、第二章 植物基因工程中的目的基因,植物基因工程,（三） 植物抗真、细菌病害、抗逆基因,上节知识点回顾,抗植物病毒基因工程中常用的技术路线。 CP基因抗病毒的原理。 病毒卫星RNA。 缺陷干扰颗粒。,1. 植物抗真菌病害基因,植物防卫反应： 增强细胞壁结构： 富含羟脯氨酸糖蛋白和富含甘氨酸蛋白；木质素 诱导产生或激活抗菌物质： 硫堇，植物抗毒素，几丁质酶，PR蛋白,小麦锈病,梨黑星病,1.1 几丁质酶基因,几丁质酶抑菌机制 植物病原真菌的细胞壁主要成分之一是几丁质，几丁质酶通过破坏菌丝尖端新合成的几丁质而抑制病原菌的生长。病原真菌细胞壁中几丁质的降解不仅破坏细胞新物质的沉积，使病原体死亡，而且产
2、生的细胞壁碎片可以刺激寄主植物产生抗病反应。,几丁质酶属于PR蛋白，在植物中含量低，受病原菌诱导，没有病原特异性，是由宿主的反应类型决定的，在进化上相对保守。,几丁质酶的利用策略,直接应用，将酶直接施与农田，以保护植物免受土壤真菌的侵染 将几丁质酶基因引入根围细菌，使该工程菌表达分泌几丁质酶 将基因导入植物，使转基因植物表达几丁质酶。,现在已经对许多微生物和植物的几丁质酶基因进行了分离，克隆，测序和转化，转基因植株中几丁质酶增加，抗病性增加。,1.2 植物抗毒素基因,植物抗毒素：亦称植保素，是植物受侵染后产生的一类低分子抗菌化合物，具有种属特异性。,现已鉴定的植保素达200多种，以类黄酮与类萜
3、类植保素研究最多。植保素的产生速度、累积含量与植物的抗病性有着密切的关系。,1.3过氧化物酶基因,苯丙烷代谢是一条和多种生理功能密切相关的代谢途径。该途径的产物在植物抗病反应中起着重要作用。（预防性抗菌物质、诱导性抗病物质、防御屏障）,过氧化物酶催化苯基类丙烷醇脱氢聚合最终形成木质素，将该酶的编码基因和35s启动子连接转入烟草，显著提高了烟草对霜霉病的抗性。,1.4 SAR抗病基因,SAR概念：系统获得抗病系统，由病原侵染激发，可持续及对随后同种病原体甚至不同种的其他病原体的侵染均能表现出系统性的抗病性。,水杨酸（SA）：一种信号分子，SA介导植物保护反应是由于一组复杂的植物保护机制被SA激活
4、所致。（足够的SA含量+有效的信号感知和转导途径）。 过氧化氢酶：在病原菌与寄主识别反应的早期就会积累的过氧化氢酶是SA的结合蛋白，该酶基因的过表达能够增加马铃薯抵抗病原菌的能力。,2. 抗植物细菌病害基因,全世界马铃薯每年因细菌病害减产25%，约40亿美元。,1845-1860年马铃薯晚疫病导致爱尔兰饥荒。,1970年玉米大斑病再次引起全球惊慌。,2.1 病原菌自身的抗性基因,原理：将病原菌基因导入植物细胞，使其过量表达，或表达失去原有功能的蛋白，或表达失去原有的时空性，从而干扰病原菌的正常生理代谢，以致寄主植物表现出抗性。,菜豆毒素是菜豆假单胞菌中重要的治病因子，作用机制是抑制植物鸟氨酸氨
5、甲酰基转移酶（OCTase）的活性。菌体本身存在抗菜豆毒素的OCTase，将编码该酶的基因导入烟草后，获得的烟草转基因植株在接种菜豆毒素后不表现系统病症。,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯,2.2 溶菌酶基因及其应用,溶菌酶（lysozyme）存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的1，4-糖苷键水解的酶。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。,3.抗非生物胁迫基因,胁迫：指对植物生存和生长不利的各种环境因素的总和。分为生物胁迫和非生物胁迫。,风、雨、雪、 声、磁、电,化学因素,盐类、离子、气体、除草剂等,辐射,红外光,可
6、见光,紫外光,离子辐射,水,涝 干旱,温度,低温 高温,冷害 冻害,苏铁冻害,农田杂草丛生,香蕉除草剂药害,农田杂草丛生,玉米除草剂药害,限制除草剂应用的重要因素：除草剂药害,3.1 耐除草剂基因,主要为转基因大豆、玉米、棉花、油菜，5860万hm2，约占全世界转基因作物的72%,解决除草剂对农作物伤害的途径,（二 ）育种 1.杂交育种：将野草植物的除草剂的抗性引入栽培品种中； 2.遗传工程育种：组培或细胞培养结合理化诱变 基因工程手段,（一）应用对农作物伤害小的除草剂,耐除草剂基因工程策略：靶蛋白改造；引入酶系统,3.1.1靶蛋白抗性基因及其应用,（1）抗EPSPS抑制剂基因及其应用,EPS
7、PS：草甘膦（glyphosate）是一种施用于叶片的广谱、非选择性的有机磷类除草剂。草甘膦特异性地抑制植物和细菌中5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）的活性。EPSPS是芳香族氨基酸合成途径中的一个酶，对植物正常发育起着重要作用。,EPSPS过量表达,EPSPS靶蛋白突变,（2）抗ALS抑制剂基因及其应用,ALS：乙酰乳酸合成酶。磺酰脲类除草剂通过抑制支链 氨基酸合成过程中的一个关键酶ALS来表现其除草剂作用。植物中ALS对磺酰脲类除草剂的抑制作用相当敏感。,ALS的靶点突变体在自然界普遍存在，ALS基因上许多位点可以产生突变体并赋予抗性。,将拟南芥中的抗除草剂基因（ALS基因突
8、变基因）导入烟草，转基因烟草对磺酰脲类除草剂敏感性下降了约1000倍。,3.1.1 靶蛋白抗性基因及其应用,有许多不同的酶系统对除草剂有降解的作用，这些酶系统存在于作物、杂草和微生物中。,降解抗性可能涉及多于一种基因或物质参与，分离对除草剂有降解作用的基因较困难。但是降解系统产生的对除草剂的抗性的专一性强、效率高、负效应小。,3.1.2 除草剂的降解和解毒基因及其应用,（1）乙酰CoA转移酶基因及其应用,乙酰CoA转移酶具有使除草剂草丁膦失活的作用。在CoA存在的情况下，乙酰CoA转移酶催化乙酰CoA与草丁膦的游离氨基酸结合，使L-草丁膦转变为乙酰-L-草丁膦，从而失去除草剂活性。,从链霉菌中
9、分离到乙酰辅酶A转移酶基因（bar）转入烟草、马铃薯和番茄中，获得抗Basta的植株，而且产量不受影响。,3.1.2 除草剂的降解和解毒基因及其应用,（2）超氧化物酶歧化酶基因,许多除草剂（百草枯）在植物体内产生活性氧并氧化植物细胞质膜而导致植物死亡。 把高效启动子控制下的SOD基因导入植物，可以提高植物的抗逆性。,3.1.2 除草剂的降解和解毒基因及其应用,降解或解毒策略可以作为修饰或过表达靶蛋白的一个有价值的替代方法。 解毒酶基因还可能赋予植物对多种除草剂的耐性。,抑制植物对除草剂的吸收和转运具有很大前景，但是还是一种设想。,3.2抗其他非生物胁迫的基因,第一类基因编码产物是在植物的抗性中
10、直接起保护作用的蛋白质。1.合成渗透调节物质的关键酶类，2.具有解毒作用的酶，3.保护生物大分子及膜结构的蛋白，4.具保护作用的蛋白酶，5.水通道蛋白。 第二类基因编码的产物是在信号转导和逆激基因表达过程中起调节作用的蛋白质因子。1.传递信号和调控基因表达的转录因子，2.感应和转导胁迫信号的蛋白激酶，3.与第二信使生成有关的酶。,3.2.1渗透调节物质合成酶基因,渗透调节物质：植物在高盐或干旱条件下，为了消除胁迫所造成的伤害，维持渗透平衡和体内水分，在细胞中产生和积累的一些小分子化合物。 氨基酸衍生物，脯氨酸、甜菜碱；糖类，海藻糖、果聚糖，多醇类。其中海藻糖、甜菜碱是次生代谢产物。,3.2.2
11、保护生物大分子及膜结构的蛋白质基因,（1）抗冻蛋白基因,抗冻蛋白（antifreeze protein，AFP）：指能降低冰点和减少冰晶生长速度的蛋白质。,用鱼类AFP处理植物组织细胞，可以减少细胞冰晶生长，降低冰冻温度。,表达黄盖鲽AFP基因的番茄和烟草的转基因植株抗冻性增加。,荧光抗冻蛋白装饰的冰晶体,（2）胚胎发生后期富集蛋白基因,3.2.2保护生物大分子及膜结构的蛋白质基因,胚胎发生后期富集蛋白（late embryo genesis abundant protein，LEA）：出现在胚发后期，随种子脱水成熟其含量增加，具有高度的亲水性，是植物能够在水分亏缺时，保持膜系统及生物大分子免受破坏。,干旱、高盐或低温胁迫下，lea基因在各种植物的营养器官也被诱导。将大麦的LEA蛋白基因导入水稻获得的转基因植物抗旱性和抗盐性明显提高。,本节知识要点,几丁质酶抑菌机理 植物抗毒素概念 SAR概念 植物抗真菌病害基因的种类、作用机理 细菌自身抗性基因作用机理 溶菌酶作用机理 胁迫概念 耐除草剂基因工程原理 耐除草剂基因种类 抗冻蛋白 胚胎发育后期富集蛋白,