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1、关于目的基因的克隆关于目的基因的克隆关于目的基因的克隆关于目的基因的克隆现在学习的是第1页，共31页 基因工程或基因工程或基因工程或基因工程或DNADNADNADNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效的基因，
2、目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗
3、传性状，包括人体基因治疗。疗。疗。疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用筛选
4、模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCRPCRPCRPCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。现在学习的是第2页，共31页一 鸟枪法1.1.鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基
5、因的基本战略2.2.鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进 3.3.鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性 基因测序基因测序“鸟枪法鸟枪法”，也俗称，也俗称“霰弹法霰弹法”。简单地说，它有点类似生活中玩的。简单地说，它有点类似生活中玩的拼图游戏。拼图游戏是将一个完整的画面分成杂乱无章的碎块，然后重新拼装复原。拼图游戏。拼图游戏是将一个完整的画面分成杂乱无章的碎块，然后重新拼装复原。而而“鸟枪法鸟枪法”则是先将整个基因组打乱，切成随机碎片，然后测定每个小片段序列，则是先将整个基因组打乱，切成随机碎片，然后
6、测定每个小片段序列，最终利用计算机对这些切片进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。最终利用计算机对这些切片进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。“鸟枪法鸟枪法”最初主要用于测定微生物基因组序列。近年来，最初主要用于测定微生物基因组序列。近年来，美国塞莱拉公司美国塞莱拉公司先后利先后利用改进的全基因组用改进的全基因组“鸟枪法鸟枪法”完成了果蝇和人类基因组的测序工作，证明了它在测定大基完成了果蝇和人类基因组的测序工作，证明了它在测定大基因组上的可行性和有效性。因组上的可行性和有效性。“鸟枪法鸟枪法”优点是速度快，简单易行，成本较低。优点是速度快，简单易行，成本较低。现在学习的是
7、第3页，共31页1.1.鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组DNADNADNADNA片段，然后通过快速有效的筛选程序片段，然后通过快速有效的筛选程序片段，然后通过快速有效的筛选程序片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的从众多克隆中分离出含有目的基因的从众多克隆中分离出含有目的基因的从众多克隆中分离出含有目的基因的目目目目的重组子的重组子的重组子的重组子，进而获得目的基因。鸟进而获得目的基因。鸟进而获得目的基因。鸟进而获得目的基因。鸟枪法适用于原
8、核细菌目的基因的克枪法适用于原核细菌目的基因的克枪法适用于原核细菌目的基因的克枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离隆分离隆分离隆分离。现在学习的是第4页，共31页（1 1）染色体）染色体DNADNA的切断的切断 超声波处理：超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。片段长度均一，大小可控，平头末端。全酶切：全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。大小不可控。部分酶切：部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。（2 2）与载体连接）与载体连接 如
9、果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载多拷贝克隆载体体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体表达型载体。如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌大肠杆菌作为作为（3 3）转化受体细胞）转化受体细胞 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞。的受体细胞。（
10、4 4）筛选含有目的基因的目的重组子）筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）。菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）。现在学习的是第5页，共31页2.2.鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNADNA，然后然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的目的重组子
11、重组子的出现频率。的出现频率。（1 1）使用特征性限制性内切酶切开染色体）使用特征性限制性内切酶切开染色体DNADNA 现在学习的是第6页，共31页例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 1.8 kbkb的的Sal ISal I片片段中，将染色体段中，将染色体DNADNA用用Sal ISal I切开，琼脂糖凝切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.01.6-2.0 kbkb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNADNA片段，然后与载体进行拼接片段，然后与载体进行拼接在连接前将在连接前将DNADNA片
12、段进行分级分离片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb现在学习的是第7页，共31页冻融法冻融法滤纸法滤纸法吸附法吸附法低融点凝胶法低融点凝胶法溶解法溶解法凝胶凝胶DNADNA片段回收技术片段回收技术 现在学习的是第8页，共31页 结合结合DNA制备膜选择性地吸附制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快的方法达到快速纯化质粒速纯化质粒DNA的目的。适合于从的目的。适合于从14 mL细菌培养物细菌培养物中提取多至中提取多至20g 高纯的质粒高纯的质粒DNA，用于测序、体外转，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实
13、验。实验。现在学习的是第9页，共31页3.3.鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构现在学习的是第10页，共31页二、cDNA法1.cDNA1.cDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略2.cDNA2.cDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序3.cDNA3.cDNA法法克隆目的基因的局限性法法克隆目的基因的局限性现在学习的是第11页，共31页mDNA
14、mDNA（1 1）c cDNADNA第一链的合成第一链的合成 55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 3355pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55cDNAcDNA第一链第一链引物引物退火退火逆转录酶逆转录酶dNTPsdNTPs1.cDNA1.cDNA法克隆目
15、的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略现在学习的是第12页，共31页（2 2）c cDNADNA第二链的合成第二链的合成 煮沸煮沸NaOHNaOH自身引导法：自身引导法：获得的双链获得的双链cDNA cDNA 55端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp
16、55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33KlenowKlenowdNTPsdNTPsS1S1自身环化形成发夹结构自身环化形成发夹结构降解双链中的单链，如发夹结构降解双链中的单链，如发夹结构现在学习的是第13页，共31页DNApol dNTPsDNApol dNTPsRNaesHRNaesH置换合成法：置换合成法：获得的双链获得的双链cDNA cDNA 55端也会有几对碱基缺失端也会有几对碱基缺失55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33
17、TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAApp 5555以切断的以切断的mRNAmRNA为引物为引物 AAAA AAAATTTTTTOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3333T4-DNA ligaseT4-DNA ligase焦磷酸钠存在条件下合成焦磷酸钠存在条件下合成cDN
18、AcDNA第一链第一链现在学习的是第14页，共31页dCTPdCTPTdTTdT引导合成法：引导合成法：获得的双链获得的双链cDNA cDNA 能保留能保留完整的完整的55端序列端序列55pppppp55G G AAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTpp 5533 HOHO55pppppp55G G AAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCOHOH 3333 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555
19、 ppGGGGGGGGGGGGGG33 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555 ppGGGGGGGGGGGGGGAAAAAAAAAAOHOH 33NaOHNaOH退火退火KlenowKlenowdNTPsdNTPs现在学习的是第15页，共31页（3 3）双链）双链c cDNADNA的克隆的克隆 双链平头的双链平头的cDNAcDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：平头末端直接与载体连接，平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收。但插入的片段无法回收。平头两端分别接同聚物尾，平头两端分别接同聚物尾，最好是最好是ATAT
20、同聚物尾，这样重组。同聚物尾，这样重组。分子可通过加热局部变性和分子可通过加热局部变性和S1S1核酸酶处理回收插入片段。核酸酶处理回收插入片段。加装人工接头引入酶切口，加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收。以便插入片段回收。现在学习的是第16页，共31页2.cDNA2.cDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序（1 1）完备分离程序）完备分离程序 提提取取细细胞胞总总mRNAmRNA，合合成成总总cDNAcDNA，将将之之全全部部克克隆隆，然然后后借借助助于于合合适的筛选手段找到适的筛选手段找到目的重组子。目的重组子。筛筛选选时时，若若使使用用的的是是多多拷拷贝贝载载体体，则
21、则采采用用菌菌落落原原位位杂杂交交法法筛筛选选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选。若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选。完备分离程序适用于完备分离程序适用于mRNAmRNA分子数少的目的基因的克隆，如人分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIIIVIII基因等。基因等。现在学习的是第17页，共31页（2 2）特异分离程序）特异分离程序 提提取取细细胞胞总总mRNAmRNA，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离，回回收收目目标标mRNAmRNA，由由此此合成双链合成双链cDNAcDNA，然后进行克隆。然后进行克隆。
22、特特异异分分离离程程序序较较适适用用于于mRNAmRNA丰丰度度极极高高的的目目的的基基因因克克隆隆如如血血红红蛋白基因等。蛋白基因等。现在学习的是第18页，共31页（3 3）差异分离程序）差异分离程序 利用两组细胞利用两组细胞mRNAmRNA种类的差异，分离克隆差异种类的差异，分离克隆差异mRNAmRNA所对应的所对应的cDNAcDNA，因而这种程序较适用于因而这种程序较适用于分离克隆新基因。分离克隆新基因。例如：正常的大鼠例如：正常的大鼠FR3T3FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基
23、因，进的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。而研究其生物学功能。现在学习的是第19页，共31页差异分离程序差异分离程序 多瘤病毒感染的多瘤病毒感染的FR3T3FR3T3细胞细胞正常的正常的FR3T3FR3T3细胞细胞总总mRNAmRNA总总mRNAmRNAcDNAcDNA双链双链cDNAcDNA单链单链cDNAcDNA提取提取mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA合成第二链合成第二链克隆克隆提取提取mRNAmRNA共价交联共价交联上柱上柱原位杂交原位杂交病毒诱导表达的基因病毒诱导表达的基因cDNAcDNA克隆克隆现在学习的是第20页，共31页3.
24、cDNA3.cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性并非所有的并非所有的mRNAmRNA分子都具有分子都具有polyApolyA结构。结构。细菌或原核生物的细菌或原核生物的mRNAmRNA半衰期很短。半衰期很短。mRNAmRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难。离纯化困难。仅限于克隆蛋白质编码基因。仅限于克隆蛋白质编码基因。现在学习的是第21页，共31页三 PCR法 PCRPCR（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction）法，又称为法，又称为聚合酶聚合酶链反应链反应或或PC
25、RPCR扩增技术扩增技术，是一种高效快速的体外，是一种高效快速的体外DNADNA聚合程序聚合程序 使用使用PCRPCR法克隆目的基因的前提条件是：法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的已知待扩增目的基因或基因或DNADNA片段两侧的序列片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必，根据该序列化学合成聚合反应必 需的需的双引物双引物。1.PCR1.PCR法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理现在学习的是第22页，共31页 由由Taq DNATaq DNA聚合酶扩增的聚合酶扩增的PCRPCR产物中，其产物中，其33末端总是会带有一个非末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，
26、而且这个碱基几乎总是模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A A，因为因为Taq DNATaq DNA聚聚合酶对合酶对dATPdATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdTTdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T T载体载体克隆克隆 2.PCR2.PCR克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序5555AAAAT TTT5555PCRPCR扩增产物扩增产物T T 载体载体T7T7lacZlacZMCSMCSorioriApAprr现在学习的是第23页
27、，共31页四 化学合成法1.1.化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略2.2.化学合成的单元操作化学合成的单元操作3.DNA3.DNA化学合成的用途化学合成的用途现在学习的是第24页，共31页1.1.化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略（1 1）全基因合成）全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的化学合成目的基因的前提条件是基因的DNADNA序列已知，有三种战略：序列已知，有三种战略：小片段粘接法小片段粘接法 混合退火混合退火根据目的基因全序列，分别合成根据目的基因全序列，分别合成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链DNADNA小片段小片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连
28、接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 现在学习的是第25页，共31页补钉延长法补钉延长法混合退火混合退火根据目的基因根据目的基因两条互补链两条互补链全序列，分别合成全序列，分别合成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链DNADNA小片小片段以及段以及20-3020-30碱基长的单链碱基长的单链DNADNA中片段中片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合现在学习的是第26页，共31页大片段酶促法大片段酶促法混合退火混合退火根据目的基因根据目的基因的的全序列，分别合成全序列，分别合成40-5040-50碱基长的
29、单链碱基长的单链DNADNA片段片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合现在学习的是第27页，共31页 上述三种方法各有利弊：化学合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNADNA的的单片段愈短，收率就愈高，但单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率
30、为例如，每聚合一个单体的产物收率为95%95%则合成则合成5050个碱基长的个碱基长的DNADNA单链大单链大片段的总收率只有片段的总收率只有7.7%7.7%现在学习的是第28页，共31页（2 2）探针等寡聚核苷酸合成）探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的编码的DNADNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNAcDNA法得到法得到的重组子，最终获得含有目的基因的的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子目的重组子 由于大多数氨基酸拥有由于大多数氨基酸拥有简并密码子简并密码子，故在探针序列的设计时，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的生物体对简并密码子的偏爱性偏爱性，合成系列探针合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在探针应具有足够的长度，通常在17-2017-20个核苷酸之间个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域探针内部不应出现可能的互补区域现在学习的是第29页，共31页现在学习的是第30页，共31页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第31页，共31页