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1、目的基因 研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量DNA和蛋白质分子,首先都要把它从庞大的基因组中分离出来。你所感兴趣和想研究的基因，称为目的基因。克隆克隆 来自同一始祖的相同拷贝的集合。分子克隆分子克隆细胞克隆细胞克隆动物克隆动物克隆畜產系 鄭登貴 教授抗虫基因转殖烟草荧光基因转殖鱼抗老化转殖兰花基因转殖羊挑出所要群落挑出所要群落挑出所要群落挑出所要群落得到纯系转殖菌株得到纯系转殖菌株得到纯系转殖菌株得到纯系转殖菌株大量培养生产大量培养生产大量培养生产大量培养生产人类胰岛素人类胰岛素人类胰岛素人类胰岛素Human InsulinHuman Insulin探针探针探针探针 ProbePro
2、be互补互补互补互补 DNADNA专专专专一性抗体一性抗体一性抗体一性抗体送入宿主细菌送入宿主细菌送入宿主细菌送入宿主细菌基因接入载体基因接入载体基因接入载体基因接入载体目标基因剪接目标基因剪接目标基因剪接目标基因剪接Stryer(1995)Stryer(1995)Biochemistry,Biochemistry,p.119 p.119Kleismith&Kish(1995)Kleismith&Kish(1995)Cell and Molecular Biology,Cell and Molecular Biology,p.115 p.115生物大分子的定量概念生物大分子的定量概念基因的大小
3、基因的大小分子质量（ku）碱基对数目（bp）质量单位（g、ng、pg）摩尔单位（pmol）光密度单位1kb=680kD=0.68MD1MD=1.47kb或1kD=1.47bpDNA 1kb120330蛋白质40kD蛋白质1kDDNA 250bp基因组的大小基因组的大小 细胞或生物体中一套完整单体的遗传物质的总和。人类基因组包含22条常染色体和X、Y 两条性染色体和线粒体上的全部遗传物质。不同生物的基因组大小复杂程度不同，其大小一般与进化程度相关。几种生物的基因组比较几种生物的基因组比较n n病毒SV40 5.2 1 环状n n大肠杆菌 4000 1 环状n n酵母 17000 17 线状n n
4、人 5-710106 6 23 23 线状 种类种类种类种类 大小大小大小大小 （KbKb）染色体数染色体数染色体数染色体数 形状形状形状形状大肠杆菌基因图大肠杆菌基因图 大肠杆菌的细胞核无核膜和核仁，没有固定的形态，结大肠杆菌的细胞核无核膜和核仁，没有固定的形态，结大肠杆菌的细胞核无核膜和核仁，没有固定的形态，结大肠杆菌的细胞核无核膜和核仁，没有固定的形态，结构简单，称为拟核，也称细菌染色体。构简单，称为拟核，也称细菌染色体。构简单，称为拟核，也称细菌染色体。构简单，称为拟核，也称细菌染色体。拟核具有高度紧密的结构，由拟核具有高度紧密的结构，由拟核具有高度紧密的结构，由拟核具有高度紧密的结构
5、，由RNARNA、蛋白质和超螺旋环、蛋白质和超螺旋环、蛋白质和超螺旋环、蛋白质和超螺旋环状状状状DNADNA组成。组成。组成。组成。环状环状环状环状DNADNA的总长度可达的总长度可达的总长度可达的总长度可达1300m1300m，分子量为，分子量为，分子量为，分子量为2.8102.8109 9 D D，大，大，大，大约含有约含有约含有约含有3000300040004000个基因，目前已经确定了个基因，目前已经确定了个基因，目前已经确定了个基因，目前已经确定了14001400多个基因多个基因多个基因多个基因的结构、功能及在基因图上的位置。的结构、功能及在基因图上的位置。的结构、功能及在基因图上的
6、位置。的结构、功能及在基因图上的位置。通过研究大肠杆菌基因的结构、功能及表达调控可揭示通过研究大肠杆菌基因的结构、功能及表达调控可揭示通过研究大肠杆菌基因的结构、功能及表达调控可揭示通过研究大肠杆菌基因的结构、功能及表达调控可揭示其它生物的遗传现象和规律。其它生物的遗传现象和规律。其它生物的遗传现象和规律。其它生物的遗传现象和规律。可接合质粒可接合质粒如如 F F 因子因子(fertlity factor,)转导嗜菌体分离宿主菌基因转导嗜菌体分离宿主菌基因 当当病病毒毒从从被被感感染染的的（供供体体）细细胞胞释释放放出出来来、再再次次感感染染另另一一（供供体体）细细胞胞时时，发发生生在在供供体
7、体细细胞胞与与受受体体细细胞胞之之间间的的DNA转转移移及及基基因因重重组组即为转导作用。即为转导作用。目的基因目的基因需要克隆的DNA片段。编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系目的基因的获取目的基因的获取化学合成法 cDNA文库基因组DNA文库聚合酶链式反应化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNADNA序列序列序列序列较短的核酸片段（较短的核酸片段（60-80bp）用途：用途：PCR引物引物 测序引物测序引物 定点突变定点突变 核酸杂交探针核酸杂交探针PCR 可以把 指定的基
8、因片段 数量放大染色体PCR 基因放大连琐反应聚合酶链反应聚合酶链反应聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)(polymerase chain reaction,PCR)(polymerase chain reaction,PCR)(polymerase chain reaction,PCR)mRNA mRNA cDNA cDNA 双链双链双链双链cDNA cDNA 重组重组重组重组DNADNA分子分子分子分子 cDNAcDNA文库文库文库文库 反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶 载体载体载体载体 受体菌受体菌受体菌受体菌 复制复制复制复制从从从从
9、cDNAcDNA文库获取目的基因文库获取目的基因文库获取目的基因文库获取目的基因 尿素-氯化锂法硫氰酸胍法polyT亲和层析法密度梯度离心分级法探针筛选法（一）mRNA的提取与纯化胍类化合物胍类化合物尿素尿素氯化锂氯化锂Rnasin-Rnasin-RNA酶酶DEPC尿素-氯化锂法、硫氰酸胍法polyTpolyT亲和层析法亲和层析法AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAApolyTpolyTpolyTpolyTpolyTpolyT（二）从mRNA制备cDNA逆转录酶聚合酶mRNAmRNAmRNAmRNAcDNAcDNA杂化双链杂化双链基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDN
10、AcDNA(三)cDNA文库的组建（四）从cDNA文库钓取目的基因组织或细胞染色体组织或细胞染色体组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNADNA基因片断基因片断基因片断基因片断克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体重组重组重组重组DNADNA分子分子分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌受体菌受体菌基因组基因组基因组基因组DNADNA文库文库文库文库 存在于转化细胞内由存在于转化细胞内由存在于转化细胞内由存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有克隆载体所携带的所有克隆载体所携带的所有克隆载体所携带的所有基因组基因组基因组基因组DNADNA的集合的集合的集合的集合从基因组从基因组DNADNA文库获取目的基因文库获取目的基因限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装基因网络GENE CHIPGENE CHIP