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1、基因工程基本操作的四个步基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取(一一)、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成限制酶限制酶基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化
2、细菌转化细菌体外包装体外包装1)1)基因组文库基因组文库(Genomic library)(Genomic library)是指将某种生物体的是指将某种生物体的全部基因组全部基因组DNADNA用限制性内切酶或机械力量用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的切割成一定长度范围的DNADNA片段，片段，再与合适的载体在体外重组后，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。保存某种生物的全部基因。一、目的基因的获取一、目
3、的基因的获取（一）从基因文库中直接获取（一）从基因文库中直接获取1.1.基因文库基因文库一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取（一）从基因文库中直接获取cDNA(cDNA(互补互补DNA)DNA)：是由生物的某一特定器官或是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的特定发育时期细胞内的mRNAmRNA经体外反转录后形成的互补经体外反转录后形成的互补DNADNA片段，与载体连接后储片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的受体菌群就叫做这种生物的cDNAcDNA文库文库 2)cDNA2)cDNA文库文库(cDNA libr
4、ary(cDNA library)基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取（一）从基因文库中直接获取按照外源按照外源DNA片段的来源：片段的来源：u从特定组织提取的染色体从特定组织提取的染色体基因组基因组DNA -基因组基因组DNA文库（总）文库（总）umRNA反转录成的反转录成的cDNA拷贝拷贝-cDNA文库（部分）文库（部分）基因文库的目的基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。基因文库的分类基因文库的分类依据：目的基因
5、的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻基因翻译产物蛋白物蛋白质等特性等特性从基因文库中得到目的基因的方法从基因文库中得到目的基因的方法2 2、利用、利用PCR技技术扩增目的基因增目的基因参与的参与的组分分在在DNA复制中的作用复制中的作用解旋解旋酶打开打开DNA双双链DNA母母链提供提供DNA复制的模板复制的模板4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸合成子合成子链的原料的原料DNA聚合聚合酶催化合成催化合成DNA子子链引物引物使使DNA聚合聚
6、合酶能能够从引物的从引物的3端开始端开始连接脱氧核苷酸接脱氧核苷酸生物体内生物体内DNA分子复制的条件分子复制的条件DNADNA聚合酶的特性聚合酶的特性 DNA DNA聚合酶不能从头开始合聚合酶不能从头开始合成成DNADNA，而只能从，而只能从3 3端延伸端延伸DNADNA链。链。因此，因此，DNADNA复制需要引物。复制需要引物。ATGCATGC5 5，端含磷酸基团端含磷酸基团端含磷酸基团端含磷酸基团3 3，端含羟基端含羟基端含羟基端含羟基3 3，端端端端5 5，端端端端355DNA的复制方向的复制方向DNADNA 分子的热变性原理分子的热变性原理DNA双链双链单链单链变性（加热变性（加热8
7、0-100）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）变性的目的：变性的目的：复性的目的：复性的目的：解开双链解开双链有利于引物与两条单链结合有利于引物与两条单链结合 在在80100 80100 的温度范围内，的温度范围内，DNADNA的双螺旋的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为结构将解体，双链分开，这个过程称为变性变性 PCR原理原理 高温解决了打开双链的问题，但是，高温解决了打开双链的问题，但是，又导致又导致DNADNA聚合酶失活的问题，耐高温聚合酶失活的问题，耐高温的的Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶解决了高温导致解决了高温导致DNADNA聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促
8、成了PCRPCR技术的技术的自动化。自动化。PCR PCR 反应的条件反应的条件DNADNA模板；模板；分别与两条模板链相结合的分别与两条模板链相结合的两种两种引物引物（引物（引物和引物和引物）；）；四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸；耐高温的聚合酶；耐高温的聚合酶；控制温度，但不需解旋酶；控制温度，但不需解旋酶；需要在一定的缓冲液中进行。需要在一定的缓冲液中进行。1 1、PCRPCR的反应步骤的反应步骤 PCRPCR一般经历三十多次循环一般经历三十多次循环，每次循环每次循环可以分为三个步骤可以分为三个步骤变性、复性和延伸。变性、复性和延伸。循环之前的一次预变性，以便增加大分循环之前的一次预变性，
9、以便增加大分子模板子模板DNADNA彻底变性的概率。彻底变性的概率。PCRPCR的反应过的反应过程程950C变性550C复性720C延伸第第第第一一一一轮轮轮轮 DNA DNA聚合酶只能特异性地聚合酶只能特异性地复制处于两个引复制处于两个引物之间的物之间的DNADNA序列序列，使这段固定长度的序列呈，使这段固定长度的序列呈指数指数扩增。扩增。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物为模板参与反应，并且由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与引物单链会与引物结合，进行结合，进行DNADNA的延伸的延伸2 2、PCRPCR的反应结果的反应结果3、人工合成法：、人工合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可以基因较小，核苷酸序列已知，可以利用利用DNA合成仪人工合成合成仪人工合成