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1、 228 论著 泸 州 医 学 院 学 报 2007 年 第 30 卷 第 3 期 Journal of Luzhou Medical College V 1.30 No.3 2007 载基因阴离子脂质体的制备及特征研究 刘 可 ， 余 录 (泸州医学 院化学教研室 ， 四川泸州 646000) 摘 要 目 的 ：制 备 粒 径 符 合 要 求 （ 200 nm 左右）的阴离 子脂质体，从处方 因素和工艺 因素两方面考 察多种因素 对所得脂质 体 粒径和 多分散指 数 (PDI)的影响 ； 并制备 阴离子脂质 体 /DNA 复合物 。 方法： 采用薄膜超 声法 -膜挤压 法； 以粒 径和多分散
2、 指数 为指 标（ 由激 光粒度仪测定 ）， 处方因素 选择介质的离 子强度， 工艺 因素选择旋转 蒸发的转速、 探头超声的次 数等因素进行 考察。 结 果 ： 旋 转 蒸 发 时 以 转 速 150rpm 制 备 脂 质 体 薄 膜 ； 探 头 超 声 时 功 率 为 200W,每 超 声 5s 间 隔 10s,水 浴 温 度 为 25C, 超 声 次 数 3035 次； 过膜 挤出次数 12 次。 结论 ： 使用薄膜超 声法 -膜挤压法 可制得符合课 题要求的阴离 子脂质体。 关键词阴 离子脂质体； 粒径； 制备方 法 中图分类 号 R734.2 文献标识 码 A 文章编号 1000-26
3、69(2007)3-0228-03 病 毒 载 体 和 非 病 毒 载 体 是 基 因 治 疗 普 遍 使 用 的 两类传输系统。 非病毒载体中阳离子脂质体被研究 得 最为广泛 1 。 实验发现， 由于阳离子脂质体表面带 正 荷， 体内应用时容易与血浆中的成分（ 如血浆蛋 白） 结合生成聚集体在肺部引起肺栓塞 2 。 阴离子脂 质体 则由于具有生物相容性好等优点而被广泛应 用 3 。 磷 脂 ( PC) 头部带有不同的电荷 ，带 正电荷的脂 质形成的 脂质体为阳离子脂质体， 带负电荷脂质形 成的脂质体 为阴离子脂质体， 不带电荷的脂质形成 的脂质体为中 性脂质体 , PC 不带电荷，磷脂酰甘油
4、 ( PG)、磷脂酰肌 醇（ PI) 、 磷脂 酰丝 氨酸 （ PS) 、 磷脂 酸 ( PA) 和 心磷 脂等带负电荷， 都可用于制备阴离脂质 体。 1 实验材料 1. 1 药品与试剂 普通质粒 DNA( 本实验室抽提）； DMEM 培养基 ( 美国 Giboco 公司）； 胰蛋白酶（ 美国 Bio Basic Unit 公司）； 胎牛 血清（ 杭州 四季青 生物制 品公 司）； 磷 脂 酰丝氨酸， 胆固醇和豆磷脂（ 上海伯奥生物科技有 限 公司）； 鱼精蛋白硫酸盐（ 美国 Sigma 公司） 等。 1. 2 仪器 Sizer Nano ZS90 型激光粒度及 Zeta 电位分析 仪 （ 英
5、国 Malvern 公司 ）； ZeissAxiovert 40 CFL 相差 / 荧光 / 明场显微 镜（ 蔡司光学仪器上海国际贸易有限 公 司）； JY92 - II 超声波细胞粉碎机（ 宁波新芝科器研 宄 所 ) 等 。 作 者 简 介 : 刘 可 （ 1956-),男，实验师 2 实验方法 2 . 1 空白脂质体、 脂质体的制备 本研究采用薄膜超声法- 膜挤压法制备空白脂 质 体， 其原理是： 水浴超声及探头超声的能量能使脂 质 在水相介质中形成双分子结构的微囊即脂质体； 膜挤 压法中， 稍大于膜孔径的脂质体由于其内在的 柔性， 在一定的压力下能通过膜孔， 过大的脂质体可 在过膜 的过
6、程中破裂， 这样反复几次就能获得大小 均匀的脂 质体。 将 3. 0 mg 的 PS, 6. 0 mg 的 PC, 4. 5 mg 的 胆 固醇 ( Choi) 溶于 10 ml 氯仿 , 以旋转蒸发仪减压蒸发除 去 有机溶剂并在瓶壁形成均匀的薄膜， 再置于真空干 燥器中干燥 2 个小时以进一步除去氯仿 。干 燥完毕，加 入 3 ml 分散介质溶胀并水化薄膜， 置于超声清洗 仪中 进行水浴超声， 每超声 lmin 中间间隔 0. 5 min。 将所 得脂质体混悬液转入西林瓶中置探头超声仪进 行超声 （ 冰浴 )， 设定条件为每超声 5 s 间隔 10 s， 超声 次 数 依 实 验 设 计 进
7、 行 并 依 次 挤 压 通 过 2 2 0 nm, 100 nm 的膜， 反复进行 12 次。 影响因素考察： 处方因素： 不改变脂质比例及 浓度， 讨论不同离子强度的介质对所得脂质体粒径 的 影响 。分 别以 5% 乳糖 、 5% 葡萄糖 、 0. 01 M PBS、 0. 05 M PBS、纯水作为介质，测定所得脂质体的粒径 及 PDI。 工艺因素： 从以下几个方面考察影响脂质 体粒径及 PDI 的工艺因素：旋转蒸发的转速、探头超 声的次数。 旋转蒸发的转速选择 50 rpm 和 150 rpm 两 种， 超声次 数每 5 次测量 1 次粒径 / PDI, 连续测量 10 第 3 期 刘
8、 可 等 ： 载 基 因 阴 离 子 脂 质 体 的 制 备 及 特 征 研 究 229 次共计超声 50 次， 过膜挤出次数选取了 6 次， 12 次。 2. 2 载基因阴离子脂质体的制备 取 一定 量的 鱼精 蛋白（ Protamine) 储 备液 ， 在 轻 微 搅 拌 下 逐 滴 加 入 等 体 积 的 DNA 储 备 液 中 ， 室 温 孵 育 10 min, 形成 Protamine/ DNA 复合物， 再加入适量 的空白阴离子脂质体 ，继 续室温孵育 40 min 即得载 基 因阴离子脂质体。 2. 3 阴离子脂质体粒径和 Zeta 电位的测定 取 阴 离 子 脂 质 体 混 悬
9、 液 以 纯 水 为 分 散 介 质 稀 释 至适宜浓度 ，利 用激光粒度及 Zeta 电位分析仪测定 脂 质体的粒径和 Zeta 电位。 3 结果 3. 1 影响因素考察 不同离子强度的介质对所得脂质体粒径的影响 ( 见附表） 附 表 不 同 离 子 强 度 对 粒 径 大 小 的 影 响 （ nm； ) 指 标 5% 乳 糖 5% 葡 萄 糖 0.01MPBS 0.05MPBS 体粒径电位示思图见图 4 和图 5 所示。 由图可见， 无 论是空白阴离子脂质体还是载基因阴离子脂质体 粒径 较小， 分布均匀， 电位适中， 达到实验要求。 次数 C 次） 图 1 13 声次数对粒径大小的影响（
10、nm) 粒 径 (nm) 142.2 110.2 156.3 3117 PDI 0.204 0.270 0.232 0.075 由上可见， 较高离子强度的分散介质（ 0. 05 M PBS) 对脂质体的粒径有显著影响 ，从 样品外观也可 以 观察到， 以 0. 05 MPBS 为介质的脂质体明显比其 他 样品混浊。 产生这种现象的原因可能是较高的离子强度使 脂质体表面电荷发生改变， 稳定性下降而产生了聚 集 。旋 转蒸发的转速较快 时（ 150 rpm), 过膜次数较 多 时（ 12 次）， 所得的脂质体粒径、 PDI 较小。 超声次数对粒径的影响见图 1 ，由 图 1 可见 ，随 着 超声次
11、数的增加，脂质体粒径显著减小，超声至一 定 次数后，粒径基本保持稳定，不再随超声次数的增 加 而改变。 超声水浴温度对粒径的影响如果显 示（ 数据 略 ）， 在一定范围内，随着水浴温度的升高，粒径呈下 降趋 势。 从以上单因素考察结果可以得到最佳的制备条 件为 ：旋 转蒸发时以转速 150 rpm 制备脂质体薄膜；探 头超声时功率为 200 W, 每超声 5 s 间隔 10 s, 水浴 温度 为 25 C, 超声次数 30 35 次； 过膜挤出次数 12 次。 3. 2 阴离子脂质体物理特征 上述试验条件下得到的空白阴离子脂质体粒径 电位 示意图见图 2 和图 3 所示。 载基因阴离子脂质 搖
12、 0 钱体阴离子指闹体的分布尺寸的选枰 泸 州 医 学 院 学 报 2007 年 第 30 卷 第 3 期 230 Journal of Luzhou Medical College V 1.30 No.3 2007 质体具有热力学不稳定性 ，若 温度过高可产生聚 集 等现象， 且脂质体容易被氧化、 水解。 参 考 文 献 4 讨论 图 5 基因载体阴离子脂质体的界面动电势的选择 1. Tomlinson E, Rolland AP. Controllable gene therapy Pharmaceutics of non- viral gene delivery systems J.Co
13、ntrolled Release, 1996; 39: 357 2. Tang Fuxing, Hughes JA. Introduction of a disulfide bond into a cationic lipid enhances transgene expression of plasmid DNAJ Biochem Bioph Res co, 1998; 242:141 3. K Amin, TD Heath. LDL- induced association of anionic liposomes with cells and delivery of contents I
14、I. Interaction of liposomes with cells in serum- containing mediumJ Journal of 选用鱼精蛋白硫酸盐有效地缩合 DNA 可以增 加 由内吞途径产生的内化作用， 保护 DNA 对抗核酸 酶 的降解作用 ，提 高 DNA 向细胞核的转运 4 , 5 。本 实 验 中采用的 PS 是阴离子脂类， 其主要作用是提供负 电 荷 ； CHOL 是中性脂类 ，其 作用是稳定脂质双分子 层、 降低阴离子脂质体的毒性，更重要的是，它具有 细胞 膜去稳定化作用，能促进脂质体对细胞的渗透， 提高 转染效率。水浴温度对粒径的影响出现上述趋 势
15、的原 因可能是 ，水 浴温度越高 ，提 供给脂质体的能 量越多， 形成的脂质体曲率越大即粒径越小。应注意 的是，这 种温度的升高是在一定的范围内的， 因为脂 Controlled Release, 2001; 73: 49 4. Tsai JT, Furstoss KJ, Michnick T, et al.Quantitative physical characterization of lipid- polycation- DNA lipopolyple- xes J. Bio techno 1 Appl Biochem, 2002;36(1): 13 5. Huang XG. Prote
16、ntiation of cationic liposome- mediated gene delivery by polycationd J. Biochemistry, 1996; 35: 1027 (2007- 01- 03 收稿 ) 标引关键词须知 标引关键词应针对文章的重点内容， 请尽量使用最新版美国国立医学图书馆编辑 | 的 Index Medicus 中的医学主题词表 ( MeSH) 内所列的词。 如果最新的 MeSH 中还无相 ! 应的词， 处理办法有： 可选用直接相关的几个关键词组配。 如果无法组配， 可选用 | | 最直接的上位关键词。 关键词中的缩写词应按 MeSH 还原为全称， 如 HBsAg 应标引为 | | 乙型肝炎表面抗原。 t