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1、课程主讲人：（本科）11-第5章 基因组注释-基因组编辑ppt课件基因组编辑基因组编辑 (genom editing) 是一种是一种人工靶向人工靶向诱诱导基因组导基因组目标目标DNA序列发生突变序列发生突变的的遗传工程遗传工程。通过导入的。通过导入的核酸酶核酸酶使使DNA靶点靶点发生双链发生双链DNA断裂，再经细胞内断裂，再经细胞内DNA修复系统修复系统在靶点在靶点引入突变引入突变。这一技术涉及两个问题：。这一技术涉及两个问题： 1）如何实现）如何实现靶向靶向？ 2）怎样产生）怎样产生双链双链DNA断裂（断裂（DSB）？基因组编辑技术有基因组编辑技术有4种：种： 1) meganuclease
2、 (罕见位点核酸酶罕见位点核酸酶) 2）ZFN 2) TALEN 3) CRISPR/Cas9 or CRISPRiI-Sce是酵母线粒体基因组中一个是酵母线粒体基因组中一个内含子内含子编码的编码的限制性内切酶限制性内切酶，识别，识别18 bp 序列。内含子两序列。内含子两侧含有侧含有I-Sce位点，当位点，当I-Sce基基因表达产生因表达产生I-sce酶时：酶时：1）可）可将将I-Sce 内含子切内含子切离，产生无离，产生无内含子位点；内含子位点；2）寻找同源的）寻找同源的宿主内无内含子的宿主内无内含子的等位位点等位位点，将其，将其切开切开。然后通过。然后通过同源同源重组重组产生含有内含子的
3、等位产生含有内含子的等位I-Sce位点。这一遗传现象称之位点。这一遗传现象称之为为内含子归巢内含子归巢 (homing)。利用利用I-Sce专一性酶切专一性酶切并随之发生并随之发生双链断裂修复双链断裂修复特点，可用来特点，可用来进行基因组编辑。进行基因组编辑。由于由于I-Sce位点位点在绝大所数物种基在绝大所数物种基因组中因组中极少存在极少存在，因而实际，因而实际应用价值不大应用价值不大。Molecular Cell 10 895-905，2002什麽是什麽是ZFN:ZFN: ZFN, ZFN, Z Zinc-inc-F Finger inger N Nucleases(ucleases(锌指
4、核酸酶锌指核酸酶) )的简称。的简称。ZFNZFN技术原理：技术原理： PNAS 93：1156-1160，1996 转录因子锌指结合蛋白的转录因子锌指结合蛋白的DNADNA结合域可专一性与基因结合域可专一性与基因调控元件（调控元件（elementelement）结合，）结合，每个锌指基序每个锌指基序可以专一性识可以专一性识别并别并结合结合3 3个连续排列的碱基个连续排列的碱基（-NNN-NNN-）。结合）。结合DNADNA的的锌指锌指多肽与核酸内切酶多肽与核酸内切酶Fok1Fok1连接组成连接组成融合蛋白融合蛋白，称之，称之锌指核锌指核酸酶酸酶。锌指核酸酶可在体外或体内定点切割。锌指核酸酶可
5、在体外或体内定点切割DNADNA双链。如双链。如果切割位置在基因编码区，即可定点打靶基因。果切割位置在基因编码区，即可定点打靶基因。 锌指蛋白是真核生物中最丰富的转录因子之一。图示锌指蛋白是真核生物中最丰富的转录因子之一。图示 TFIII A是是5SrRNA基因的转录调控因子基因的转录调控因子, 含含9个锌指基序个锌指基序, 可识别与结合启动子区可识别与结合启动子区33个碱个碱基序列，控制基因表达。基序列，控制基因表达。Zif268(小鼠蛋白小鼠蛋白)是最早用于是最早用于基因打靶基因打靶的的锌指蛋白转录因子锌指蛋白转录因子, 含含3个锌指基个锌指基序，识别序，识别9 bp序列，与限制酶序列，与
6、限制酶Fok1组成融合蛋白用于基因组编辑。组成融合蛋白用于基因组编辑。将锌指蛋白（将锌指蛋白（Zif268）与内切核酸酶（）与内切核酸酶（Fok1）组成）组成融合蛋白融合蛋白Zif-FN (ZFN)。当。当ZFN的锌指结构域识别并结合特定的锌指结构域识别并结合特定DNA序列时，连接序列时，连接的的Fok1内切核酸酶可内切核酸酶可非特异切割邻近非特异切割邻近DNA，造成，造成DNA断裂，由断裂，由此启动此启动DNA修复系统进行修复系统进行同源重组修复同源重组修复或或非同源重组修复非同源重组修复。这两。这两种修复均会造成修复种修复均会造成修复DNA位点位点碱基缺失或插入，碱基缺失或插入，从而引起突
7、变。从而引起突变。Nature Review Genetics 11:636-646, 2010每个每个锌指基序锌指基序可结合可结合3个碱基。当基序中的个碱基。当基序中的氨基酸残基发生氨基酸残基发生代换代换时，可时，可改变改变基序结合的基序结合的碱基顺序碱基顺序。据此可以进行。据此可以进行锌指氨锌指氨基酸代换实验基酸代换实验，并对识别碱基序列检测。由此可，并对识别碱基序列检测。由此可建立建立锌指基锌指基序库序库，组成识别模块群。这些识别，组成识别模块群。这些识别模块模块可可排列组合排列组合，用于基，用于基因打靶序列的选择参考。因打靶序列的选择参考。什麽是什麽是TALEN:TALEN: TALE
8、N是是Transcription activator-like effector nucleases (转录激活因子样效转录激活因子样效应物核酸酶应物核酸酶)的简称，与的简称，与的技术原的技术原理有相似之处。理有相似之处。TALEN系统中，效系统中，效应子应子DNA结合域（结合域（TAL）取代取代了了ZFN中的中的锌指蛋白锌指蛋白，与之连接的，与之连接的内切核酸内切核酸酶酶仍然是仍然是Fok1。TAL效应子由效应子由33-34 aa 高高度保守的重复多肽度保守的重复多肽组成。组成。重复多肽之间仅在重复多肽之间仅在第第12和和13位置有两个位置有两个aa差异，差异，与与专一性识别碱基序列有关专一
9、性识别碱基序列有关。识别。识别A, T,C和和G的多肽的多肽单元分别人工合成组成模单元分别人工合成组成模块，根据识别的块，根据识别的DNA序列序列组建工程多肽链。组建工程多肽链。Science 326 ：1501, 2009 1) 发现发现CRISPR系统系统 2) CRISPR系统的结构系统的结构 3) Cas9工作原理及应用工作原理及应用嗜热乳酸链球菌嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)酸奶发酵酸奶发酵菌。抗噬菌体侵染的乳酸链球菌基因组中含有一种特菌。抗噬菌体侵染的乳酸链球菌基因组中含有一种特别的遗传成分别的遗传成分CRISPR (规律性簇集间隔分布短回文
10、规律性簇集间隔分布短回文重复序列重复序列)，具有，具有DNA免疫的功能。免疫的功能。 Science 315：1709 -1712，20071，重复序列长约，重复序列长约26-37nt, 5和和3末端有部分回文对称序列末端有部分回文对称序列;2，间隔序列（数字编号）与重复顺序大小相似，间隔序列（数字编号）与重复顺序大小相似, 35-44 nt, 不同不同 间隔序列之间不重复间隔序列之间不重复;3，间隔序列是细菌获取的，间隔序列是细菌获取的外源侵染外源侵染DNA序列序列（pro-spacer， 原间隔顺序），用于原间隔顺序），用于DNA免疫反应。免疫反应。化脓性链球菌（化脓性链球菌（strept
11、ococcus pyogenes）有有两个可转录两个可转录 CRISPR座位座位：1）下游下游CRISPR座位座位CRISPR01, 转录的产物为转录的产物为crRNA。2）上游上游CRISPR座位座位反向转录，反向转录，转录的产物为转录的产物为 tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA)。3） tracrRNA含有和含有和crRNA重复序列完全匹配重复序列完全匹配的序列，的序列，彼此彼此 间可间可形成双链形成双链RNA。CRISPR系统的免疫机制系统的免疫机制-获取外源原间隔序列：获取外源原间隔序列：来自来自病毒和质粒病毒和质粒DNA的的原原间隔序列间隔序列
12、(pro -spacer)被被切割整合切割整合到到CRISPR重复序列重复序列位置位置当当crRNA和和tracrRNA转录后转录后即可在同源重复序列之间即可在同源重复序列之间形成形成RNA双链双链，随后，随后Cas9与与crRNA/tracrRNA结合组成结合组成打靶复合物打靶复合物。crRNA的编码序列来自外的编码序列来自外源源DNA，因此可在，因此可在外源外源DNA侵入侵入细胞时，细胞时，crRNA可以可以搜寻搜寻并与外源并与外源DNA配对形成配对形成互补双链互补双链。一旦互补双链形成，。一旦互补双链形成，Cas9即可执行即可执行核酸内切核酸内切酶功能酶功能，在外源，在外源DNA与与cr
13、RNA配对位置切割配对位置切割DNA，完成完成DNA打靶打靶。Science 337, 816, 20121）引导）引导RNA（gRNA）与打靶与打靶DNA的的配对碱配对碱基数在基数在20 nt。2）打靶）打靶DNA序列与引导序列与引导gRNA的的配对序列配对序列中中，低于，低于5 nt的差异的差异会会出现出现脱靶效应。脱靶效应。3）原间隔顺序下游有）原间隔顺序下游有3个碱基个碱基组成的保守基组成的保守基序（序（PAM），在设计），在设计gRNA时必须时必须含有含有PAM序列序列。4）在在crRNA与接近与接近PAM靶靶DNA位点之间位点之间3-端端至少必须至少必须满足满足13个个碱基的碱基的
14、精确精确配对配对。Science 337, 816, 2012与与Cas9Cas9相比，相比，Cpf1Cpf1有以下特点：有以下特点：第一，第一， 大小不同。大小不同。Cas9Cas9剪切剪切DNADNA需要需要两个小两个小RNARNA分子分子，而，而Cpf1Cpf1只需要只需要一个一个。Cpf1Cpf1酶比标准的酶比标准的SpCas9SpCas9要小，更容易进入组织要小，更容易进入组织和细胞。和细胞。第二，第二， 剪切方式不同。剪切方式不同。Cas9Cas9在在同同一个位置剪切一个位置剪切DNADNA分子双链，分子双链，形成平末端；形成平末端；Cpf1Cpf1是交错剪切是交错剪切目标目标DN
15、A,DNA, 形成黏性末端形成黏性末端。第三，第三， 剪切位置不同。剪切位置不同。Cpf1Cpf1剪切剪切位点位点距离识别位点较远距离识别位点较远。第四，第四， Cpf1Cpf1系统在目标位置的选系统在目标位置的选择上与择上与Cas9Cas9不同。不同。 Cas9 Cas9 的的PAMPAM序列序列为为5 5- (NN AGAAW- (NN AGAAW-3 3（N N表示任意碱基表示任意碱基; W; W表示表示A A或或T)T)或或5 5- -NGGNGNGGNG-3-3，Cpf1Cpf1复合物的复合物的PAMPAM序列为序列为- -TTNTTN- -。靶。靶位与天然存在的位与天然存在的PAM
16、PAM序列相邻序列相邻. .见：见：Zetsche et al., 2015, Cell 163： 1131 1）20142014年年Swarts DCSwarts DC等报道采用等报道采用嗜热栖热菌嗜热栖热菌（Thermus Thermus thermophilusthermophilus）AGOAGO蛋白以蛋白以DNADNA介导细菌介导细菌DNADNA的切割的切割。 Nature. 2014; 507:258261Nature. 2014; 507:258261 2 2）20152015年中国河北科技大学韩春雨团队报道利用格氏年中国河北科技大学韩春雨团队报道利用格氏( (嗜嗜) )盐盐碱杆
17、菌碱杆菌( (Natrono- bacterium gregoryNatrono- bacterium gregoryi)AGOi)AGO蛋白以蛋白以DNADNA为介为介导导对对人类人类细胞细胞基因组基因组进行进行编辑编辑，称为，称为NgAgoNgAgo系统。系统。 Nature Nature Biotechnology doi:10.1038/ nbt.3547Biotechnology doi:10.1038/ nbt.35473 3） NgAgo NgAgo系统特点：系统特点：1，利用利用DNADNA而非而非RNARNA介导介导基因组基因组编辑编辑； 2 2，在编辑位点，在编辑位点去除数个核苷酸去除数个核苷酸，而非仅仅产生断裂；，而非仅仅产生断裂；3 3 ，引导序列，引导序列24 nt24 nt，专一性更强，专一性更强；4 4，NgAgoNgAgo系统不需要系统不需要 PAMPAM位点序列，对打靶序列限制少。位点序列，对打靶序列限制少。