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1、课程主讲人：（本科）27-第11章 基因组复制-原核生物ppt课件复制子复制子是是DNA的复制单位的复制单位, 由复由复 制起始点制起始点, 复制顺序和复制终点组成。复制顺序和复制终点组成。1）大肠杆菌染色体为一个复制子；）大肠杆菌染色体为一个复制子；2）啤酒酵母基因组约有）啤酒酵母基因组约有300个复制起始点个复制起始点, 每每 40 kb DNA组成一个复制子；组成一个复制子；3）人类基因组有）人类基因组有20,000个复制起始点个复制起始点, 每每150 kb一个复制子。一个复制子。所有所有DNA的复制都在复制起始点开始的复制都在复制起始点开始, 复制的调控都集中在起始点复制的调控都集中
2、在起始点, 中心事件是中心事件是复制起始复合物的组装与复制的复制起始复合物的组装与复制的“点火点火”.将大肠杆菌质粒复制起始点切除将大肠杆菌质粒复制起始点切除, 然后用相同的限制酶然后用相同的限制酶处理染色体处理染色体DNA. 将缺少复制起始点的载体将缺少复制起始点的载体DNA与染色与染色体片段连接转化体片段连接转化, 阳性克隆即含有复制起始点阳性克隆即含有复制起始点.DnaADnaA蛋白与蛋白与OriCOriC位置的位置的9bp9bp重复顺序结合重复顺序结合, , 并以消耗并以消耗ATPATP的的形式弯曲形式弯曲DNA. DNA. 弯曲弯曲DNADNA产生的产生的扭曲力促使富含扭曲力促使富含
3、ATAT的的13bp13bp重复重复顺序解链顺序解链. . 暴露暴露的单链的单链DNADNA与与SSB(SSB(单链结合蛋单链结合蛋白白) )结合结合, , 形成形成复制泡复制泡. .DNA Pol III的核心酶由的核心酶由, 和和 三个亚基组成：三个亚基组成： 亚基具酶催化活性，执亚基具酶催化活性，执行行53的的DNA合成；合成； 亚基具亚基具 35外切核酸酶活性，切除错配核苷外切核酸酶活性，切除错配核苷酸；酸； 亚基执行较正功能，填补正确配对碱基。亚基执行较正功能，填补正确配对碱基。亚基是亚基是滑行夹板滑行夹板（sliding clamp），使聚合酶始终保持与），使聚合酶始终保持与DNA
4、的结合，的结合，提高提高DNA聚合酶的加工活性。聚合酶的加工活性。 (套套)亚基与两个核心酶结合形成二聚体。亚基与两个核心酶结合形成二聚体。单元有单元有5个亚基组成，个亚基组成，3个个，1个个 和和1个个， 单元的功能是将两个单元的功能是将两个亚基形成一个整体与亚基形成一个整体与DNA结合，结合，所以又称夹板载体（所以又称夹板载体（clamp loader）。）。 亚基参与后随链复制。亚基参与后随链复制。(西西)和和(普西普西)按按1：1与与 和和 结合。结合。亚基是亚基是滑行夹板滑行夹板（sliding clamp），使聚合酶始终保持与），使聚合酶始终保持与DNA的结合，的结合，提高提高DN
5、A聚合酶的加工活性。聚合酶的加工活性。 (套套)亚基与两个核心酶结合形成二聚体。亚基与两个核心酶结合形成二聚体。单元有单元有5个亚基组成，个亚基组成，3个个，1个个 和和1个个， 单元的功能是将两个单元的功能是将两个亚基形成一个整体与亚基形成一个整体与DNA结合，结合，所以又称夹板载体（所以又称夹板载体（clamp loader）。）。DNA聚合酶聚合酶III复合物具有两种生化功能：复合物具有两种生化功能：催化核苷酸聚合反应和执行催化核苷酸聚合反应和执行35外切核苷酸酶活性（外切核苷酸酶活性（a）。）。DNA复制时，如果掺入的是错误的碱复制时，如果掺入的是错误的碱基，基， DNA聚合酶聚合酶I
6、II会察觉这种错误，主动往后滑移，并利用其校读会察觉这种错误，主动往后滑移，并利用其校读功能域将错配碱基切除（功能域将错配碱基切除（d）。将错误配对碱基切除后，）。将错误配对碱基切除后，DNA聚合酶聚合酶III会重新挑选正确的碱基成员继续合成新链（会重新挑选正确的碱基成员继续合成新链（e）。图中所示为大肠杆菌复制叉上前导连和后随链并列复制的装置图中所示为大肠杆菌复制叉上前导连和后随链并列复制的装置 加工加工因子因子trx将解旋酶，引物酶和将解旋酶，引物酶和DNA聚合酶结合组成复制体，并将前聚合酶结合组成复制体，并将前导连和后随链的导连和后随链的DNA聚合酶同向设置，协同朝同一方向前移。解聚合酶
7、同向设置，协同朝同一方向前移。解旋速度与复制速度彼此协调。旋速度与复制速度彼此协调。 gp4: 噬菌体编码的解旋酶噬菌体编码的解旋酶/引物酶引物酶6聚体。聚体。trx: 加工因子，大肠杆菌硫氧还蛋白；加工因子，大肠杆菌硫氧还蛋白；gyrase: 促旋酶或拓促旋酶或拓扑酶扑酶II，在，在DNA复制时在复制叉前端引入负超螺旋。复制时在复制叉前端引入负超螺旋。 Hamdan SM et al.，2005虽然虽然DNADNA多聚酶多聚酶IIIIII是大肠是大肠杆菌主要的复制酶杆菌主要的复制酶, ,但缺少但缺少53外切核酸酶的活性外切核酸酶的活性, , 不能执行不能执行RNARNA引物切除。在引物切除。
8、在DNADNA聚合聚合酶酶IIIIII以以具有具有53外切核酸酶活性的外切核酸酶活性的DNADNA聚合酶聚合酶I I切除引物，复切除引物，复制新链，留下的制新链，留下的缺口由缺口由DNA连接酶缝合。连接酶缝合。1) 原核生物原核生物DNA复制速率约复制速率约1000 bp/s.2) 大肠杆菌基因组大肠杆菌基因组DNA全长约全长约4.6 x 106 bp,双向双向复制每秒约复制每秒约1000 x 2 bp, 约需约需40 m完成整个基完成整个基因组复制。因组复制。 实际上大肠杆菌每复制一代约实际上大肠杆菌每复制一代约20 m, 这是因为在上一轮复制尚未完成时这是因为在上一轮复制尚未完成时, 第二
9、第二轮复制又开始起始。轮复制又开始起始。3) 真核生物真核生物DNA复制速率约复制速率约40-50 bp/s。真核生。真核生 物物DNA复制速率约为原核生物复制速率约为原核生物DNA复制速率复制速率 的的1/20。大肠杆菌大肠杆菌ColE1质粒复制起始质粒复制起始点上游点上游P-II启动子转录产生启动子转录产生RNA II分子。分子。RNA II可产生可产生稳定的数个茎环的结构，可与稳定的数个茎环的结构，可与DNA模板链配对形成双链。随模板链配对形成双链。随后经后经RNase H加工，产生一个加工，产生一个用作用作DNA聚合酶聚合酶I的引物起始的引物起始复制。在复制。在RNA II下游存在一个
10、下游存在一个可反向转录的启动子，合成可反向转录的启动子，合成RNA I。RNA I可以和可以和RNA II配对，阻止配对，阻止RNA II高级结构形高级结构形成，不能产生引物，复制不能成，不能产生引物，复制不能进行。当质粒拷贝数过多时，进行。当质粒拷贝数过多时，RNA I和和RNA II的比例增加，的比例增加，有利于有利于RNA I和和 RNA II之间的之间的配对，抑制复制。配对，抑制复制。DnaA box: DnaADnaA box: DnaA蛋白结合区。蛋白结合区。A/T:A/T:富富A/TA/T区。区。13mer:13mer:OriCOriC区区13bp13bp同源序同源序列。列。DR
11、: DR: 顺式重复顺序顺式重复顺序, , 与与repErepE蛋白结合蛋白结合, , 使双链使双链DNADNA分开。分开。IR: IR: 反向反向重复顺序重复顺序, , 顺序与顺序与DRDR一致。一致。incCincC: : 拷贝数控制区。拷贝数控制区。ori2ori2: : 质粒复制起始质粒复制起始点。点。sopA,B,CsopA,B,C: : 参与质粒分配到子细胞。参与质粒分配到子细胞。P/O: P/O: 启动子启动子/ /操纵基因。操纵基因。repErepE为复制蛋白为复制蛋白, , 单体时可与单体时可与DRDR重复顺序结合形成复制泡起始复制。重复顺序结合形成复制泡起始复制。 repE
12、repE在二聚体时与在二聚体时与IRIR结合结合, , 抑制复制起始和转录。抑制复制起始和转录。伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体是一种可感是一种可感染人体引起萊姆症（染人体引起萊姆症（ Lyme disease ）的）的细菌细菌。 1970年年代中期，美國東北岸康乃代中期，美國東北岸康乃迪克州鄰近康乃迪克河的迪克州鄰近康乃迪克河的萊姆鎮突然出現原因不明萊姆鎮突然出現原因不明的兒童關節炎人群突發症，的兒童關節炎人群突發症，1977年將其定名為年將其定名為萊姆關萊姆關節炎節炎(Lyme arthritis)。經過。經過一系列流行病學的調查之一系列流行病學的調查之後最後終於分離出其致病後最後終於分離出其致病
13、原。如今，在美國地區，原。如今，在美國地區，萊姆病萊姆病(Lyme disease)已成已成為最常見及重要的節肢動為最常見及重要的節肢動物病媒傳播疾病物病媒傳播疾病(arthropod vector-borne disease)。伯伯氏疏螺旋体基因组含有线氏疏螺旋体基因组含有线性染色体，环状质粒性染色体，环状质粒DNA和线性质粒和线性质粒DNA, 采取采取不同不同的方式复制的方式复制。伯氏疏螺旋体线性伯氏疏螺旋体线性DNA的端粒有一个的端粒有一个特别的结构特别的结构-发夹发夹环。环。线性线性DNA的复的复制从中间位置起始制从中间位置起始，到达到达末端末端时，有一时，有一个称之为个称之为ResT的端的端粒复制酶参与端粒粒复制酶参与端粒复制。复制。ResT含有酪含有酪氨酸重组酶活性和氨酸重组酶活性和拓扑酶活性，可在拓扑酶活性，可在末端回文结构位置末端回文结构位置与与DNA序列结合序列结合，在特定位置在特定位置交错切交错切割单链割单链，随后发生，随后发生转酯反应，完成两转酯反应，完成两条子链的解离。条子链的解离。