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1、课程主讲人：（本科）28-第11章 基因组复制-真核生物ppt课件1) 酵母复制起始点又称为酵母复制起始点又称为ARS( autonomously replication sequence).2) 酵母复制起始点含酵母复制起始点含4个亚功能区个亚功能区: A和和B1: ORC (Origin Recognition Complex, 起始识起始识 别复合物别复合物)识别顺序识别顺序(origin recognition sequence), 为复制调控区为复制调控区. B2: 与大肠杆菌与大肠杆菌oriC中的中的13 bp类似类似, 起始解链区起始解链区. B3: ABF1因子结合位置因子结合
2、位置, 产生扭曲力产生扭曲力,促使促使B2解链解链.A domain (core consensus)ORCTranscription factor ABF1enhances initiation-促使解链促使解链B domainsimperfect consensus酵母的复制起始点有一个专门的称呼，即酵母的复制起始点有一个专门的称呼，即ARSARS( (自主复制自主复制顺序顺序) )。酵母的酵母的ARSARS含有含有11 bp11 bp的保守顺序的保守顺序：ACS (ARS ACS (ARS consensus sequence) consensus sequence) 。 人类基因组中，
3、据估计大约有人类基因组中，据估计大约有30,000 50,00030,000 50,000复制起复制起始点，但其序列的组成没有明显的规律。始点，但其序列的组成没有明显的规律。 真核生物复制起始点序列缺少一致顺序，但与复制起始真核生物复制起始点序列缺少一致顺序，但与复制起始点结合的点结合的ORCORC（origin recognition complexorigin recognition complex，复制起复制起始点识别复合物始点识别复合物）有有很强的保守性很强的保守性。ORCORC由由6 6个亚基蛋个亚基蛋白组成白组成：ORC1-ORC6ORC1-ORC6，ORC1ORC1具有具有ATP
4、aseATPase活性。活性。ORC5ORC5可稳可稳定定ORCORC复合物的完整性，复合物的完整性，ORC6ORC6维持维持pre-RCpre-RC的结合状态。的结合状态。ORCORC在细胞的整个周期都始终与复制起始点结合在细胞的整个周期都始终与复制起始点结合，仅在，仅在细胞分裂的中期短暂离开。细胞分裂的中期短暂离开。a) 多细胞多细胞真核生物缺少真核生物缺少一致性的一致性的DNA复制起始点复制起始点保守顺序保守顺序, 图中显示的图中显示的为已报道的有关复制起始点位置为已报道的有关复制起始点位置; b) 细胞中有许多潜在的细胞中有许多潜在的DNA复制起始复制起始点位置点位置, 它们可在不同的
5、时间或状态下差别起始它们可在不同的时间或状态下差别起始DNA复制。复制。真核生物真核生物DNA前复制复前复制复合物（合物（pre- RC）组装）组装复制资格因子复制资格因子Cdc6和和CDT1在在G1期开始合成，期开始合成， 前前S期期Cdc6和和CDT1，MCM六聚体与六聚体与ORC结结合，完成前复制复合物合，完成前复制复合物组装。随后，在组装。随后，在S期专期专一性依赖细胞周期蛋白一性依赖细胞周期蛋白激酶激酶CDK 和和DDK激酶激酶作用下，进一步结合作用下，进一步结合GINSGINS，CDC45CDC45，SLD3SLD3，SLD2SLD2和和DPBIIDPBII，同时，同时DNADNA
6、聚合酶聚合酶Pol和和Pol与与复合物结合，完成前复复合物结合，完成前复制起始复合物组装。制起始复合物组装。真核复制叉是一个多组分的复合真核复制叉是一个多组分的复合物，含有解旋酶（物，含有解旋酶（helicase）和）和DNA合成的活性。解旋酶在复合成的活性。解旋酶在复制叉前面将双链制叉前面将双链DNA解开产生一解开产生一段单链段单链DNA的区段。活性解旋酶的区段。活性解旋酶作为整体含三个组分，作为整体含三个组分，MCM2-7，Cdc45和和GINS。RPA为单链结为单链结合蛋白，防止解开的单链复性。合蛋白，防止解开的单链复性。复制叉还有行使功能必须的复制复制叉还有行使功能必须的复制叉保护成分
7、（叉保护成分（fork protection complex，FPC）：）：Timeless (TIM), Tipin , MRC1和和And1。MRC1将前导链将前导链DNA聚合酶聚合酶Pol与解旋酶连接，与解旋酶连接，And1则将后随链则将后随链引物酶和引物酶和DNA聚合酶聚合酶Pol与解旋与解旋酶连接酶连接。复制时复制叉上会同时发生两个事件：复制时复制叉上会同时发生两个事件：DNA母链解链和互补新链合成。图示为母链解链和互补新链合成。图示为酵母复制叉。酵母复制叉。Pol负责先导链复制，负责先导链复制， Pol负责后随链复制。负责后随链复制。PLoS Genet 7(12): e10024
8、07，2011DNA夹板夹板是一个称之为滑行夹板是一个称之为滑行夹板的蛋白质骨架，在的蛋白质骨架，在DNA复复制时具有制时具有促进加工能力促进加工能力的作的作用。在滑行模板存在的情况用。在滑行模板存在的情况下，下，DNA聚合酶每次与模聚合酶每次与模板的结合都可使掺入新链的板的结合都可使掺入新链的核苷酸数目极大的增加，比核苷酸数目极大的增加，比缺少夹板的对照合成速率提缺少夹板的对照合成速率提高高1000倍。在真核生物中，倍。在真核生物中，DNA夹板为夹板为PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen，细胞增殖核抗原细胞增殖核抗原)。PCNA的安装必须依靠夹板的
9、安装必须依靠夹板装载因子装载因子RFC（replication factor C）。RFC又称夹板又称夹板装载因子装载因子（clamp loader），），将将PCNA安装在已经解旋的安装在已经解旋的DNA单链上。单链上。RFC是一个是一个关键的成分，可阻止聚合酶关键的成分，可阻止聚合酶脱离脱离DNA模板模板。安装好。安装好PCNA之后，之后，RFC脱离脱离DNA，随后随后PCNA与与DNA聚合酶结聚合酶结合。合。后随链滑行夹板安装：后随链滑行夹板安装：RFC是一个复合物，由是一个复合物，由5个含个含ATPase活性的活性的亚基组成（亚基组成（Rfc1-5）。）。RFC可在引物位置结合，可在引
10、物位置结合， 利用水解利用水解ATP释放释放的能量使环状的能量使环状6聚体聚体PCNA解开。解开。PCNA按正确的方向进入按正确的方向进入DNA单链，单链，随后闭合。安装好的随后闭合。安装好的PCNA可稳定可稳定pol ，并招募并招募Pol 和和Pol进入复进入复制位置，随之滑行。制位置，随之滑行。冈崎片段复制冈崎片段复制时，时， pol 要在连续间断的引物间要在连续间断的引物间组装，然后复制新链。这一位置转换必须借助组装，然后复制新链。这一位置转换必须借助RFC因子的帮助，使因子的帮助，使PCNA从前一个冈崎片段末端转移到下一个冈崎片段起始位置。从前一个冈崎片段末端转移到下一个冈崎片段起始位
11、置。Polymerase (Pol ): Pol 由催化亚基由催化亚基 (PriS) 以及非催化以及非催化亚基亚基(PriL) 形成复合物，形成复合物， Pri 是一个是一个RNA引物酶。首先引物酶。首先以以DNA单链为模板合成一段单链为模板合成一段RNA引物，引物长约引物，引物长约20 nt, 含含10 nt RNA和和10 nt DNA。随后。随后DNA聚合酶聚合酶Pol 和和 Pol 在其后合成前行链在其后合成前行链DNA或后随链或后随链DNA。 DNA聚合酶聚合酶Pol 主要负责后随链合成，主要负责后随链合成， DNA聚合酶聚合酶Pol 主要负责主要负责前行链合成。前行链合成。Poly
12、merase (Pol ): Pol 具有高加工活性和校读（具有高加工活性和校读（ proof- freading）功能）功能, 有有3 3 -5外切核酸酶活性，主要负责引外切核酸酶活性，主要负责引导链合成。导链合成。 Polymerase (Pol ): Pol 具有高加工活性和校读（具有高加工活性和校读（proof- reading）功能）功能, 有有3 3 -5 外切核酸酶活性，主要负责后外切核酸酶活性，主要负责后随链合成随链合成 。1）细菌细菌中冈畸片段长度在中冈畸片段长度在1 000 2 000 nt之间。之间。2）真核生物真核生物中，冈畸片段要短得多，平均中，冈畸片段要短得多，平均
13、100-200 100-200 ntnt。其。其 长度与缠绕核小体和连接核小体间区的长度与缠绕核小体和连接核小体间区的DNA长度大致相长度大致相 同，可能每一轮冈畸片段的合成均以核小体为单位。同，可能每一轮冈畸片段的合成均以核小体为单位。3）真核生物冈畸片段的平均长度比较固定，这与）真核生物冈畸片段的平均长度比较固定，这与DNA同向同向 复制时，滑行夹板需要在连续的两个冈畸片段之间不断复制时，滑行夹板需要在连续的两个冈畸片段之间不断 循环切换组装有关。这种空间位置的限制决定了冈畸片循环切换组装有关。这种空间位置的限制决定了冈畸片 段的长度。段的长度。1）真核生物）真核生物DNAPol 合成引物
14、起始合成引物起始复制复制; 2) DNA聚合聚合酶酶Pol 复制冈畸复制冈畸片段片段; 3) DNA聚合聚合酶酶Pol 缺少缺少53外切核酸酶活性，外切核酸酶活性，不能移去前面的引不能移去前面的引物物RNA，必须利用，必须利用RNA酶如酶如FEN-1或或Rnase H切除引物。切除引物。真核生物真核生物DNADNA复制资格因子是基因组复制主要控制点。复制复制资格因子是基因组复制主要控制点。复制点火之后点火之后, , 为了阻止复制资格因子为了阻止复制资格因子Cdc6Cdc6和和Cdt1Cdt1再次与再次与MCMMCM结合，结合，Cdt1Cdt1将与将与GemGem结合被抑制，而结合被抑制，而Cd
15、c6Cdc6则被输出细胞核则被输出细胞核降解，由此防止降解，由此防止DNADNA重复发生复制。重复发生复制。人类线粒体基因组为双链环状人类线粒体基因组为双链环状DNA，外圈为重链（，外圈为重链（H），内圈为轻链（），内圈为轻链（L）。）。复制重链时在复制起始点复制重链时在复制起始点OH以轻链为模板转录合成一段以轻链为模板转录合成一段RNA，随后该，随后该RNA分分子由子由RNase H在在OH位点切割作为引物，并由位点切割作为引物，并由Pol 合成新链。当合成新链。当Pol 合成的新链合成的新链到达到达OL位置时，由位置时，由L1启动子在此合成一段启动子在此合成一段RNA引物并由引物并由Pol
16、 拷贝新链。拷贝新链。OH,重重链复制起始点；链复制起始点；OL,轻链复制起始点；轻链复制起始点；mtSSB, 线粒体单链线粒体单链DNA结合蛋白结合蛋白.1）哺乳动物）哺乳动物Pol II酶的转录速率约酶的转录速率约13-33 nt/s，DNA复复 制速率约制速率约17-72 nt/s。2）哺乳动物有长度超过）哺乳动物有长度超过800kb的基因，如的基因，如FHIT (1500 kb), WWOX (1000kb), IMMP2L (900 kb)。3) 哺乳动物细胞的周期已知最短时间约哺乳动物细胞的周期已知最短时间约10 hr。4) 超长基因超长基因IMMP2L, WWOX和和FHIT 的
17、的转录转录分别需分别需11, 11和和13 hr, 可可跨越两个细胞周期跨越两个细胞周期, 和和DNA复制时间会复制时间会发生重叠发生重叠，产生冲突产生冲突。这一冲突可导致染色体在复制。这一冲突可导致染色体在复制叉位置断裂叉位置断裂, 是是染色体脆性位点染色体脆性位点产生的重要原因。产生的重要原因。5）WWOX 和和FHIT是肿瘤抑制因子，如发生突变可导是肿瘤抑制因子，如发生突变可导致急性白血病。致急性白血病。体外培养的人类体细胞在添加体外培养的人类体细胞在添加阿非迪霉素阿非迪霉素(Aphidicol) 时在时在细胞分裂中期脆性位点会发生染色体间隙和断裂与转细胞分裂中期脆性位点会发生染色体间隙
18、和断裂与转位等现象。在一些癌变的体内细胞也会出现相似的表位等现象。在一些癌变的体内细胞也会出现相似的表型，造成一些肿瘤抑制基因的丢失，引发癌变型，造成一些肿瘤抑制基因的丢失，引发癌变。 超长基因超长基因FHITFHIT的转录在的转录在G1G1期开始延伸至期开始延伸至S S期。期。S S期期FHITFHIT基因区基因区DNADNA复制启动，复制叉与转录复合物冲撞。转录区形成复制启动，复制叉与转录复合物冲撞。转录区形成R-R-环（环（R-R-loop)loop)结构，引起普遍性脆性位点（结构，引起普遍性脆性位点（ common fragile sites common fragile sites ）的不稳定性，产生染色体缢痕或断裂。）的不稳定性，产生染色体缢痕或断裂。 Molecular Cell 44, 966977, 2011Molecular Cell 44, 966977, 2011