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1、生物科技行业微生物学实验教学大纲工业微生物学实验实验教学 微生物学试验教学大纲工业微生物学试验试验教学 微生物学试验技术试验教学大纲 壹、课程的性质和任务 微生物学试验是协作微生物教学开设的壹门培育学生动手实力和综合素养的试验课程，通过试验使学生加深对所学学问的理解和驾驭，使学生驾驭微生物试验技术的基本操作和技能，同时使学生初步了解和驾驭先进的技术和方法，和快速发展的学科前沿接轨。 二、试验目的和基本要求 1.驾驭视察、培育微生物的基本操作和技能。包括：显微镜的运用、无菌操作、培育基的配制和灭菌。 2.驾驭常用微生物的染色方法，进壹步驾驭植物病源微生物的鉴定和分类。 3.通过试验加深对植物病源
2、细菌、真菌的形态、大小及二者之间的差别。 4.依据所学学问和技能，能够自行设计微生物试验。 5.利用微生物的生理生化反应鉴别植物病源微生物。 三、试验考核方式及方法 试验成果评定方法：试验课成果单独按五级分记录考试成果。凡试验成果不及格者，该门课程必需重修。学生的试验成果应以平常考查为主，壹般应占总分的73%，其平常成果又要以试验实际操作的优劣作为主要考核依据。在学期末或课程结束时，为复习和巩固试验教学内容，进壹步对学生作补充了解，也可实行壹定的试验操作考试，但无论实行何种方式进行考核，都必需按试验课的目的要求，以实际试验工作实力的强弱作为评定成果的主要依据。因此，最终的集中考试结果只能占总成
3、果的30%。 评定各级成果时，可参考以下标准： 优秀 能正确理解试验的目的要求，能独立、顺当而正确地完成各项微生物试验操作，会分析和处理试验中遇到的问题，能驾驭所学的各项试验技能，能较好地完成试验报告及其它各项试验作业，有壹定创建精神和实力。有良好的试验室工作作风和习惯。 良好 能理解试验的目的和要求，能仔细而正确地完成各项试验操作，能分析和处理试验中遇到的壹些问题。能驾驭所学试验技能的绝大部分，对难点较大的操作完成有困难。能壹般完成试验报告和其它试验作业。有较好的试验习惯和工作作风。 中等 能粗浅理解试验目的要求，能仔细努力进行各项试验操作，但技巧较差。能分析和处理试验中壹些较简单的问题，驾
4、驭试验技能的大部分。有30%驾驭得不好。能壹般完成各项试验作业和报告。处理问题缺乏条理。工作作风较好。能仔细遵守各项规章制度。学习努力。 及格 只能机械地了解试验内容，能壹般按图、或按试验步骤“照方抓药”完成试验操作，能完成60%所学的试验技能，有些虽作但不精确。遇到问题经常缺乏解决的方法，在别人启发下能作些简洁处理，但效果不志向。能壹般完成试验报告，能仔细遵守试验室各项规章制度，工作中有小的习惯性毛病。 不及格 盲目地“照方抓药”，只驾驭50%的所学试验技能。有些试验虽能作，但壹般效果不好，操作不正确。工作忙乱无条理。壹般能遵守试验室规章制度，但常有小的错误。试验报告较多的时候有结果，遇到问
5、题时说不明缘由，在老师指导下也较难完成各项试验作业。或有些小聪慧但不努力，不求上进。 四、试验报告要求 试验完毕，应用特地的试验报告纸，依据预习和试验中的现象及数据记录等，刚好而仔细地写出试验报告。微生物学试验报告壹般包括以下内容： 试验试验名称 试验目的试验原理 主要试剂和仪器列出试验中所要运用的主要试剂和仪器。 试验步骤应简明扼要地写出试验步骤流程。 试验数据及其处理应用文字、表格、图形、将数据表示出来。依据试验要求及计算公式计算出分析结果且进行有关数据和误差处理，尽可能地使记录表格化。 问题探讨包括试验教材上的思索题和对试验中的现象、产生的误差等进行探讨和分析，尽可能地结合分析化学中有关
6、理论，以提高自己的分析问题、解决问题的实力，也为以后的科学探讨打下壹定的基础。 五、试验项目壹览表 微生物学试验项目壹览表 序试验项目试验试验适用学 号名称类型要求专业时 1细菌的单染色法和革兰氏染色法验证性必做生物类4 2细菌的芽孢染色和鞭毛染色验证性必做生物类4 3植物病源微生物的形态视察综合性必做生物类4 4植物病原细菌及其所致病害症状视察综合性必做生物类4 5植物病原菌物壹般形态和接合菌门真菌 基本形态及所致病害视察综合性必做生物类4 6担子菌门真菌的基本形态及所致病害 的视察综合性必做生物类4 7有丝分裂孢子真菌的基本形态 及所致病害的视察综合性必做生物类4 8病原物的分别培育和接种
7、综合性必做生物类4 9植物的抗病性和病原菌的生理分化设计性必做生物类4 六、试验项目的详细内容： 试验壹细菌的单染色法和革兰氏染色法 1、目的、 1）驾驭显微镜油镜正确运用方法； 2）学习微生物涂片、染色的基本技术，驾驭细菌的单染色法和革兰氏染色法； 3)单染色法留意固定时不能烤，水洗水流不宜大急； 4)革兰氏染色的关键在于严格驾驭酒精脱色的程度；涂片要薄，否则影响脱色；菌龄也影响染色结果，驾驭好染色的时机。 2、内容、材料和方法 细菌的涂片和染色是微生物学试验中的壹项基本技术。细菌的细胞小而透亮，在一般光学显微镜下不易识别，必需对它们进行染色，使经染色后的菌体和背景形成明显的色差，从而能更清
8、晰地视察到其形态和结构。 所谓简洁染色法是利用单壹染料对细菌进行染色的壹种方法。此法操作简便，可用以视察微生物的形态、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采纳碱性染料使其着色。例如，美蓝(亚甲蓝)事实上是氯化亚甲蓝盐(methylenebluechloride，缩写为MBC)；它可被电离成正、负离子： MBC?methyleneblue+chloride- 带正电荷的染料离子可使
9、细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，仍有结晶紫(crystalviolet)、碱性复红(basicfuchsin)、番红(又称沙黄，safranine)等。 酸性染料的离子带负电荷，能和带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培育基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前俩者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 染色前必需先固定细菌，其目的有二：壹是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定俩种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。 革兰氏染色法是1884年由丹麦
10、病理学家CGram所创立的。革兰氏染色法可将全部的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)俩大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。 革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂-碘液，以增加染料和细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最终用蕃红复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这俩类菌的细胞壁结构和成分的不同所确定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低
11、，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 菌种大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)或蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)； 试验步骤 细菌的简洁染色 1、涂片在干净无油腻的玻片中心放壹小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体和水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。
12、2、干燥将涂片于空气中自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能干脆在火焰上烘烤，以免菌体变形。 3、固定手执玻片壹端，有菌膜的壹面朝上，通过快速通过火焰2-3次(用手指触涂片反面，以不烫手为宜)。待玻片冷却后，再加染料； 4、染色玻片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)于菌膜部位，染0.5-1min。 5、水洗倾去染色液，用洗瓶中的自来水自玻片壹端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。 6、干燥自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分(留意勿擦去菌体)。 7、镜检用油镜视察且绘出细菌形态图。 8、清理试验完毕，擦净显微镜。有菌的玻片置消毒缸中，清洗
13、、晾干后备用。 细菌的革兰氏染色 1、涂片在壹张载玻片上加俩滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大肠杆菌(留意涂片切不行过于深厚)。 2、固定将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰1-2次即可，不行过热，以载玻片不烫手为宜。 3、染色 初染将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水当心地冲洗。 媒染滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。 脱色滴加95%乙醇，脱色20-25s马上水洗，以终止脱色。 复染滴加蕃红，染色2-3min，水洗。最终用吸水纸轻轻吸干。 4、镜检干燥后，置油镜视察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G+)；被染成
14、红色者是革兰氏阴性菌(G-)。 试验二细菌的芽孢染色和鞭毛染色 1、目的、 学习且驾驭芽孢染色法。 学习且驾驭细菌鞭毛染色的基本方法及视察细菌鞭毛的着生状况。 学习用压滴法和悬滴法视察细菌的运动性。 2、内容、材料和方法 细菌的特别结构有芽孢、荚膜和鞭毛等，对于它们的显微镜检查必需用特别染色方法，才能获得良好的效果。 细菌的芽孢具有厚而致密的壁不易着色，若用壹般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色(芽孢呈无色透亮状)。芽孢染色法就是依据芽孢既难以染色而壹旦染上后又难以脱色这壹特点而设计的。全部的芽孢染色法都基于同壹个原则：除了用着色力强的染料外，仍须要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的
15、染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于视察 细菌的鞭毛极细，直径壹般为10-20nm，只有用电子显微镜才能视察到。可是，如采纳特别的染色法，则在一般光学显微镜下也能见到它。鞭毛染色方法许多，但其基本原理雷同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成 菌种枯草芽孢杆菌； 试验步骤 细菌芽孢染色 取菌种分别制片，固定。 在涂片部分用吸水纸条盖住，然后向纸条滴加孔雀绿液至饱和。 将涂片渐渐加热至冒蒸汽且时常添加染液以防止吸水纸条
16、干燥。染色28分钟。 除去吸水纸条，用蒸馏水轻轻冲洗掉多余染液。 用藏花红染液复染3060秒。 水洗，风干后油镜镜检。 细菌鞭毛染色 用长滴管取无菌水轻轻移入长好菌种的试管内，培育30分钟左右，使细菌自己渐渐游入水中且充分伸展其鞭毛。 取壹滴菌悬液于玻片的1/3位置上，然后轻轻抬起此端，使菌悬液缓慢流至玻片另壹端，平放让其在空气中自然干燥固定。切忌用火焰烘干。 在涂片部位滴甲液，染色3-5分钟。 用蒸馏水轻轻冲洗。 加乙液染30-60秒，可在酒精灯上稍稍加热，冲洗多余的染液。 制片干后油镜检查。 试验三微生物的形态视察 1、目的驾驭视察放线菌、酵母菌和霉菌形态的基本方法及形态特征； 视察且驾驭
17、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落特征及菌丝构成； 学会区分放线菌、酵母菌和霉菌的菌落及形态特征。 2、内容、材料和方法 和细菌的简洁染色壹样，放线菌也可用石炭酸复红或吕氏碱性美蓝染料着色后，在显微镜下视察其形态。玻璃纸具有半透膜特性，其透光性和载玻片的基本相同，使放线菌生长在玻璃纸琼脂平皿上，将长有放线菌的玻璃纸压印在载玻片上，最简单印在玻片上的是处于菌体生长先端、且易于脱落的孢子；其次是孢子丝；在印片较深时，也有少量气生菌丝被印上。经固定、染色后，用显微镜即可视察到放线菌自然生长的个体形态。 放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为俩部分，即潜入培育基中的养分菌丝(或称基内菌
18、丝)和生长在培育基表面的气生菌丝。有些气生菌丝分化成各种孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等。孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。气生菌丝及孢子的形态和颜色常作为分类的重要依据。 霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，而且孢子很简单飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片其特点是：(a)细胞不变形；(b)具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；(c)溶液本身呈蓝色，有壹定染色效果。 为了视察霉菌清楚、完整、保持自然状态的形态，可利用玻璃纸透析培育法进行视察。此法是利用玻璃纸的半透膜特性及透光性，将霉菌生长在覆盖于琼脂培育基表面的玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取壹小片，贴放在载
19、玻片上用显微镜视察。 霉菌的养分体是分枝的丝状体，细胞的平均宽度是3-10微米，比细菌要宽得多，所以，显微镜检查时，只要放大400-500倍，甚至放大101倍就能够见清晰。 酵母菌是单细胞真菌，其菌落相像于细菌菌落，宽度在5m左右。需在显微镜下才能视察。通过特别染色，可视察到细胞内部结构。 菌种酿酒酵母(Saccharomycescerevisieae)；曲霉(Aspergillussp)，青霉(Penicilliumsp)，根霉(Rhizopussp)，毛霉(Mucorsp)；泾阳链霉菌 试验步骤 在低倍镜下干脆视察孢子丝的形态，可干脆将培育皿放在低倍镜下找到菌落边缘，或切取菌落壹部分放在载
20、玻片上进行视察且记录。 用印片法视察分生孢子。取壹载玻片，在壹个切下的菌落上轻轻接触壹下，使菌落表面的孢子丝及孢子印在载玻片上，然后反转，使其在空气中干燥、固定。 用美蓝染色1分钟，用水轻轻冲洗，干后油镜检查。 取三片载玻片在中心分别滴美蓝染液、苏丹染液和碘液，用接种环取少量啤酒酵母菌涂于染液中，加盖玻片。 在平皿内培育热带假丝酵母，待长出后在菌落上压壹片无菌盖玻片，再培育12天，视察；或在高倍镜下干脆视察。 视察真菌的形态特征最好制成玻片培育菌，其步骤如下： A、用镊子自玻片缸中取出壹片载玻片，通过火焰后，平放使其冷却。 B、用石蜡凡士林在载玻片上做俩条脊，使相距1cm。 C、在脊上放好壹无
21、菌盖玻片。 D、趁培育基未凝固，用长吸管吸取少量孢子琼脂，转至载玻片上俩条脊之间盖玻片下，使其在中间位置，不宜太多。 E、将此载玻片放在培育皿内的弯玻棒上，使棉球吸湿无菌水，盖好放在25 F、将灭菌的培育皿中倒入10mL左右的PDA培育基，制成平板，分别点接黄曲霉、黑曲霉、产黄青霉、黑根霉，于25 试验四植物病原细菌及其所致病害症状视察 1、目的细菌是引起植物病害的又壹类重要的病原生物，虽不象植物病原真菌种类那样繁多，但因其个体微小，形态差异不够明显，所致病害症状困难，都给细菌病害的探讨带来壹定的困难，病原细菌的形态视察和分类鉴定须要特有的试验技术，通过本次试验，驾驭植物细菌病害的分类鉴定须要
22、特有的试验技术，熟识植物细菌病害症状类型和病原细菌的基本形态，学习植物细菌病害简易诊断方法及病原细菌初步鉴定的程序和技术，为以后植物细菌病害的正确诊断和病原细菌的分类鉴定打下良好的基础。 2、内容、材料和方法 植物细菌病害的症状视察 植物细菌病害的症状常作为鉴定属的壹种协助性状，即症状类型和病原属之间有壹定的相关性，如棒杆菌属的细菌主要引起萎蔫症状；假单胞杆菌属主要引起叶斑，腐烂和萎蔫症状；黄单胞杆菌属主要引起叶斑和叶枯症状；野杆菌属引起瘤肿等增生性症状；欧氏菌属壹般引起软腐，有时也引起萎蔫。此外，多数细菌病害在发病初期，特殊在潮湿的自然条件下常呈水浸状或油渍状；在饱和湿度下病斑上常有菌脓形成
23、，干后成为菌痂，驾驭症状类型(附1)及其形成的生态条件，对细菌病害的正确诊断是非常重要的。 视察下列病害标本，区分症状类型。 水稻白叶枯病(Xanthomonasoryzae) 棉花细菌角斑病(X.malvacearum) 马铃薯环腐病(Clavibactersepedonicum) 白菜软腐病(Erwiniacarotovora) 黄瓜细菌角斑病(Pseudomonaslachrymans) 苹果根癌病(Agrobacteriumtumefaciens) 大豆细菌性斑点病(P.glycinea) 挑细菌性穿孔病(X.pruni) 菜豆细菌性叶烧病(X.phaseoli) 水稻条斑病(X.or
24、yzicola) (2)植物细菌病害的简易诊断 植物细菌病害的诊断和病原鉴定是比较困难的，初步诊断是依据症状特点和显微镜检查病组织中的细菌来完成的，细菌病害，除少数(如苹果根癌病)外，绝大多数能在受害部位的维管束或薄壁细胞组织中产生大量的细菌，且且吸水后形成菌溢，因此，镜检病组织中有无细菌的大量存在(菌溢的出现)是诊断细菌病害简洁易行的方法。 取水稻白叶枯病新病叶，在病斑病健交界处剪取22mm的小块病组织，放在载玻片上，滴加壹滴蒸馏水，盖好盖玻片后，马上在显微镜下视察，留意叶组织维管束剪断处是否有大量的细菌，呈云雾状溢出，如将视野调暗视察更易见到，按同样方法用健康组织作镜检反证。 试验五植物病
25、原菌物壹般形态和接合菌门真菌基本形态及所致病害视察 1、目的、 相识菌物养分体和繁殖体的壹般形态；相识菌物养分体的变态类型；无性繁殖和有性繁殖的孢子类型。 相识接合菌门真菌的基本形态和分类依据。 2、内容、材料和方法 菌物的养分体 菌丝和菌丝体 菌丝组织体菌核、子座和根状菌索。 菌丝体上分化出的汲取养分组织a、吸器；b、假根；c、附着胞；d、菌环和菌网。 (2)菌物的繁殖体孢子无性孢子：游动孢子、孢囊孢子、分生孢子和厚垣孢子。 有性孢子：卵孢子、接合孢子、子囊孢子、担孢子。 (3)接合菌门真菌根足霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)、笄霉属(Choanephora)、犁头霉属(Abs
26、idia)、毛霉目真菌异宗协作现象视察。 试验六担子菌门真菌的基本形态及所致病害的视察 1、目的通过本次试验驾驭担子菌的形态特征及担子菌所致病害的症状特点，为担子菌的分类和病害鉴定打下初步基础。 2、内容、材料和方法 相识担子菌门真菌担子果的类型，冬孢菌纲黑粉菌目的分科及重要病原菌的生活史，锈菌目的分科及重要病原菌的生活史。 冬孢菌纲 黑粉菌目的主要属：黑粉菌属、条黑粉菌属、轴黑粉菌属、叶黑粉菌属、腥黑粉菌属、实球黑粉菌的病原菌形态和所致病害的症状视察。 锈菌目的主要属：双胞锈菌属、单胞锈菌属、多胞锈菌属、胶锈菌属、栅锈菌属和层锈菌属病原菌形态和所致病害的症状视察。 层菌纲外担子菌属、隔担耳属
27、的病原菌形态和所致病害的症状视察。 腹菌纲马勃目竹荪的形态视察。 试验七有丝分裂孢子真菌的基本形态及所致病害的视察 1、目的本试验的主要目的是熟识有丝分裂孢子真菌的形态特征和分类概况，熟识有丝分裂孢子真菌所致病害的基本症状，为有丝分裂孢子真菌的分类和病害鉴定打下良好的基础。 2、内容、材料和方法 相识有丝分裂孢子真菌的基本形态和分类依据。 丝核菌属、小核菌属的病原菌形态和所致病害的症状视察。 粉孢属、梨孢属、轮枝孢属、葡萄孢属、尾孢属、链格孢属、黑星孢属、内脐蠕孢属、离蠕孢属、突脐蠕孢属的病原菌形态和所致病害的症状视察。 镰刀菌属的病原菌形态和所致病害的症状视察。 拟棒束孢属的病原菌形态和所致
28、病害的症状视察。 炭疽菌属、痂圆孢属、拟盘多毛孢属、盘二孢属的病原菌形态和所致病害的症状视察。 叶点霉属、茎点霉属、大茎点霉属、壳针孢属、壳囊孢属、壳二孢属、色二孢属的病原菌形态和所致病害的症状视察。 试验八病原物的分别培育和接种 1、目的通过本次试验学习植物病原菌分别培育的原理和常用方法，学习常用的接种方法，驾驭依据柯赫氏法则鉴定植物病原物的方法。 2、内容、材料和方法 学习田间采样的方法。 学习PDA培育基的制作方法、湿热灭菌方法、干热灭菌方法和无菌平皿的制作方法。 学习病原物的组织分裂方法和稀释分别方法。 学习喷雾、针刺、摩擦接种的方法且视察接种的结果。 试验九植物的抗病性和病原菌的生理
29、分化 1、目的利用和培育抗病品种，是防治病害的根本性措施，要搞好抗病育种工作，必需娴熟驾驭植物抗病性和病原物致病性分化的测定方法，病害的性质不同，其寄主抗病性和病原物生理分化测定的方法也不同。国内外，在水稻对稻瘟病的抗病性方面的探讨许多，尤其是生理小种的鉴定工作，很多方法对水稻的探讨都是适用的，对其他病害也可借鉴，在理论和实践上颇具代表性，因此选水稻稻瘟病作试验材料，学习植物抗病性鉴定和病原物生理分化测定的基本方法，以便为今后抗病育种工作打下坚实的基础。 2、内容、材料和方法 (1)繁殖菌种 进行抗病性鉴定，须要足够的菌量，故需对采集标本上的锈菌加以活化繁殖，菌量够用后即起先品种抗病性鉴定，繁
30、殖菌种的方法如下： 打算感病品种幼菌，盆播高感稻瘟病的品种。 接种：在秧苗长出12片叶时即可接种，接种常用的方法： 喷雾法：孢子量多时，可在三角瓶中洗下孢子，调成孢子悬浮液，用喉头喷雾器喷洒，配制孢子悬浮液时，先用少量水调成稠糊状，待孢子表面充分潮湿后，再逐步加水稀释，以免孢子漂移在水面上。 为了提高接种效果接种前毛笔加石英砂去掉叶表面的蜡层，以利孢子悬浮液展着和病菌的侵入，方法是用姆指和食指蘸水少许，轻轻捏住叶片，自基部向上摩擦几次即可。 保湿：稻瘟病病菌须要在叶面有水滴或水膜的高湿条件下方能萌发侵入，所以接种后必需在保湿框或保湿箱中保湿3548小时，方法是将小花盆放在保湿框中，罩上塑料布，
31、塑料布外再缠上润湿的棉布，保湿过程中，保持1622 接种后管理 a、光照：接过种的秧苗自保湿箱中取出后应放在有日光的地方，冬季在温室中壹般仍要给以协助光照，协助光照多40瓦日光灯或101瓦灯泡，在傍晚和夜间补充照耀，对形成孢子或稻瘟病症状的正常反应都很有利，日光灯更好些，因为近照秧苗时，不致于热力伤苗。 b、温度：稻瘟病病菌的潜育适温是25 c、湿度：在接种后潜育期内，湿度虽不象光照和温度那样重要，但和孢子形成和症状的正常反应也有壹定关系，因此，温室中应常常洒水，以提高室内空气湿度。 d、防止污染：无论生理小种鉴定，仍是品种抗瘟性测定，都要留意保持菌种纯度，防止污染，操作时要严格消毒，接种针每
32、挑取壹个标样上的孢子后要经灯焰灭菌，凡改换菌种标样都需用73%的酒精擦手消毒。 菌种的保存 保存菌种：保存菌种常用以下俩种方法 a、干燥保存法：将装有孢子的指形管，用俩纱布包住管口，放入干燥器内，再将干燥器放在24的冰箱内，此法可保存1 b、半真空保存法，将孢子装在安培瓶中，瓶中堵以少量的脱脂棉，由抽气机将瓶中气压抽至1mm水银柱，然后将瓶口用火烧封闭，放在24 接种用的菌种，可分别用不同的小种单接也可将几种混合混接。壹般先混合接种，进行初步鉴定和筛选，再分别接种作进壹步的鉴定，接种保湿方法同前。 (2)生理小种鉴定 鉴定步骤 从田间收到壹个标本(以下称标样)到确定它属何生理小种，大致经过如下
33、程序：标样采集菌种培育孢子洗涤接种鉴定。 鉴定方法 扩繁菌种，接种的详细方法同抗病性鉴定。生理小种鉴定，是视察某壹标本在壹整套鉴定品种上的反应型，反应型记载标准如下： 调查分级标准：按国际水稻所稻瘟病抗性评价分级标准。 叶瘟： 0级：无病 1级：仅有小的针尖大小的褐点 2级：较大褐点 3级：小而圆以至稍长的褐色的环死灰斑，直径12毫米。 4级：典型的稻瘟病斑或椭圆型，长12厘米，常限于俩条叶脉间，病斑面积不足叶面积的2%。 5级：典型的稻瘟病斑，受害面积小于10%。 6级：典型的稻瘟病斑，受害面积为1025% 7级：典型的稻瘟病斑，受害面积为2650% 8级：典型的稻瘟病斑，受害面积为5175
34、% 9级：全部叶片死亡。 然后查阅检索表，最终确定该标样属何小种。全部标样都鉴定之后，统计某壹小种出现的频率。在反应型符号的后面，有时仍加壹些附加符号，这些符号的意义如下：“+”或“-”指反应型的差异范围，“+”指差异的最高限，“=”指差异最低限，“”指差异在“+”和“-”之间。 感谢阅读 1、 1、鸣筝金粟柱，素手玉房前。 TIME yy.M.d 20.6.29 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm:ss 12:46:27 DATE MMM-yy Jun-20 DATE HH:mm 12:46 2、宫中明丽的花儿在孤独寥落中开
35、放。 TIME EEEE年O月A日 二二年六月二十九日 TIME yyyy年M月d日星期W 2022年6月29日星期一 3、幸存的几个满头白发的宫女。 DATE HH:mm 12:46 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm:ss 12:46:27 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 4、闲坐无事只能谈论着玄宗轶事。 DATE M.d.yyyy 6.29.2
36、022 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm:ss 12:46:27 DATE HH:mm:ss 12:46:27 5、皇帝在京城之外的宫殿。 DATE MMMM yy June 20 DATE dddd, MMMM d, yyyy Monday, June 29, 2022 DATE M/d/yyyy 6/29/2022 6、这里指当时东都洛阳的皇帝行宫上阳宫。 TIME h时m分 12时46分 TIME h时m分 12时46分 DATE d-MMM-yy 29-Jun-20 DATE M.d
37、.yyyy 6.29.2022 7、行宫里的花。 TIME yy.M.d 20.6.29 TIME yy.M.d 20.6.29 TIME yy.M.d 20.6.29。 TIME yyyy年M月d日星期W 2022年6月29日星期一 TIME EEEE年O月A日 二二年六月二十九日 8、一些宫女天宝末年被“潜配”到上阳宫。 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm:ss 12:46:27 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE dddd, MMMM d, yyyy Monday, June 29, 2022 1、在这冷宫里一闭四十多年。 TIME yy.M.d
38、 20.6.29 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm:ss 12:46:27 DATE MMM-yy Jun-20 DATE HH:mm 12:46 2、成了白发宫人。 TIME EEEE年O月A日 二二年六月二十九日 TIME yyyy年M月d日星期W 2022年6月29日星期一 3、白日依山尽。 DATE HH:mm 12:46 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm:ss 12
39、:46:27 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 4、黄河入海流。 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm:ss 12:46:27 DATE HH:mm:ss 12:46:27 5、欲穷千里目。 DATE MMMM yy June 20 DATE dddd, MMMM d, yyyy Monday, June 29, 2022 DATE M/d/yyyy 6
40、/29/2022 6、夕阳依傍着山峦渐渐沉落。 TIME h时m分 12时46分 TIME h时m分 12时46分 DATE d-MMM-yy 29-Jun-20 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 7、滔滔黄河朝着大海汹涌奔流。 TIME yy.M.d 20.6.29 TIME yy.M.d 20.6.29 TIME yy.M.d 20.6.29。 TIME yyyy年M月d日星期W 2022年6月29日星期一 TIME EEEE年O月A日 二二年六月二十九日 8、想要看到千里之外的风光。 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm:ss 12:46:27 DATE
41、M.d.yyyy 6.29.2022 DATE dddd, MMMM d, yyyy Monday, June 29, 2022 1、那就要再登上更高的一层城楼。 TIME yy.M.d 20.6.29 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm:ss 12:46:27 DATE MMM-yy Jun-20 DATE HH:mm 12:46 2、旧址在山西永济县。 TIME EEEE年O月A日 二二年六月二十九日 TIME yyyy年M月d日星期W 2022年6月29日星期一 3、楼高三层，前对中条山。 DATE HH:mm 12:4
42、6 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm:ss 12:46:27 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 4、下临黄河。传闻常有鹳雀在此停留。 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm:ss 12:46:27 DATE
43、 HH:mm:ss 12:46:27 5、故有此名。 DATE MMMM yy June 20 DATE dddd, MMMM d, yyyy Monday, June 29, 2022 DATE M/d/yyyy 6/29/2022 6、消逝。 这句话是说太阳依傍山峦沉落。 TIME h时m分 12时46分 TIME h时m分 12时46分 DATE d-MMM-yy 29-Jun-20 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 7、想要得到某种东西或达到某种目的的愿望。 TIME yy.M.d 20.6.29 TIME yy.M.d 20.6.29 TIME yy.M.d 20.6.29。 TIME yyyy年M月d日星期W 2022年6月29日星期一 TIME EEEE年O月A日 二二年六月二十九日 8、但也有希望、想要的意思。 DATE HH:mm 12:46 DATE HH:mm:ss 12:46:27 DATE M.d.yyyy 6.29.2022 DATE dddd, MMMM d, yyyy Monday, June 29, 2022 第27页 共27页第 27 页 共 27 页第 27 页 共 27 页第 27 页 共 27