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1、质粒质粒质粒质粒DNADNA的提取、定量、的提取、定量、的提取、定量、的提取、定量、与与与与PCRPCR鉴定鉴定鉴定鉴定 王妮莎王妮莎1一、实验流程一、实验流程简述实验内容流程，简述实验内容流程，PCR操作步骤操作步骤煮菌，煮菌，PCR（PCR程序最后设程序最后设4保温）保温）约约2小时收集小时收集PCR产物产物学习学习PCR原理原理质粒质粒DNA提取提取（约（约1小时）小时）紫外检测定量知识（计算方法），步骤紫外检测定量知识（计算方法），步骤紫外检测紫外检测定量定量琼脂糖电泳原理琼脂糖电泳原理电泳电泳（样品：质粒（样品：质粒DNA，PCR产物，酶切产物，产物，酶切产物，Marker）约约30
2、分钟分钟观察电泳结果、观察电泳结果、记录、拍照、保存记录、拍照、保存2二、实验目的二、实验目的掌握碱裂解法提取质粒的方法掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解和掌握紫外吸收检测了解和掌握紫外吸收检测DNADNA浓度与纯度的原浓度与纯度的原理和测定方法理和测定方法 学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNADNA的的构型、分子量的大小构型、分子量的大小 掌握掌握PCRPCR基因扩增的原理和操作方法基因扩增的原理和操作方法3聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)Polymerase Chain ReactionPolymerase C
3、hain ReactionPolymerase Chain Reaction4仪器仪器仪器仪器:PCR:PCR仪仪仪仪(BioRad MJ mini)(BioRad MJ mini)台式离心机台式离心机台式离心机台式离心机灭菌的薄壁离心管灭菌的薄壁离心管灭菌的薄壁离心管灭菌的薄壁离心管微量加样枪微量加样枪微量加样枪微量加样枪凝胶电泳系统等凝胶电泳系统等凝胶电泳系统等凝胶电泳系统等凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统一、实验仪器561 1、菌液：菌液：菌液：菌液：DNADNA模板模板模板模板大肠杆菌大肠杆菌DH5a菌株菌株(含靶基因含靶基因含靶基因含靶基因CHD5CHD5片段的片段的
4、片段的片段的pMD19-T)二、实验材料 72 2、引物：、引物：、引物：、引物：正向引物：正向引物：正向引物：正向引物：5 GTA5 GTAAAAAAACGACGACGGCGGCCACCAGT 3GT 3 反向引物反向引物反向引物反向引物:5 CAG:5 CAGGAAGAAACAACAGCTGCTATGATGAC3AC33 3、2Premix2Premix：Taq Taq酶：酶：酶：酶：5U/l 5U/l 4dNTP:10mM each 4dNTP:10mM each 10buffer:500mM KCl,100mM Tris-HCl(pH 8.3)10buffer:500mM KCl,10
5、0mM Tris-HCl(pH 8.3)MgCl2:25mM MgCl2:25mM4 4、灭菌去离子水、灭菌去离子水、灭菌去离子水、灭菌去离子水二、实验材料 8 94 94预变性预变性预变性预变性2 2 分钟后开始以下循环分钟后开始以下循环分钟后开始以下循环分钟后开始以下循环 9494 30 30 秒秒秒秒 5555 30 30 秒秒秒秒 30 30 循环循环循环循环 7272 60 60 秒秒秒秒 7272 8 8 分钟；分钟；分钟；分钟；4 4 保温。保温。保温。保温。实验过程约实验过程约实验过程约实验过程约1 1小时小时小时小时3030分钟分钟分钟分钟三、实验步骤9温度温度温度温度（）时
6、间时间时间时间（minmin）9494727250509494变性变性变性变性（30s30s）50 50 退火退火退火退火（30s30s）72 72 延伸延伸延伸延伸（60s60s）循环循环循环循环1 1 循环循环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3PCRPCRPCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNADNADNA变性、引物退火和变性、引物退火和变性、引物退火和变性、引物退火和反应延伸三个
7、步骤完成的。图中设定的反应参数是反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94949494变性变性变性变性30s30s30s30s，50505050退火退火退火退火30s30s30s30s，72 72 72 72 延伸延伸延伸延伸60s60s60s60s。如此周而复始，重复进。如此周而复始，重复进。如此周而复始，重复进。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。DNA变
8、性形成2条单链DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍10灭菌去离子水灭菌去离子水11 l l2*PremixPremix25 l l正向引物正向引物-SO100(10 M)2 2 l l反向引物反向引物-SO101(10 M)2 2 l l菌液：菌液：菌液：菌液：1010 l l总体积总体积50 l l1.菌液煮沸菌液煮沸10min2、取、取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头注意每换一种试剂换一个新吸头,且且PCR反应管标记在侧面反应管标记在侧面)：如配好的反应液较多沾到管壁上，可将
9、如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心或者将反应管盖上反应管置台式离心机中瞬时离心或者将反应管盖上盖子使劲甩，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪盖子使劲甩，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪仪)上。上。11四、结果分析1、用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定;2、加5uLPCR产物进行电泳;3、预期PCR产物大小约400500bp;12*由由由由1985198519851985年穆里斯（年穆里斯（年穆里斯（年穆里斯（K.MullisK.MullisK.MullisK.Mullis）发明，他也因此获得了）发明，他也因此获得了）发明，他也因此获
10、得了）发明，他也因此获得了1993199319931993年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。PCRPCR（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，）即聚合酶链式反应，）即聚合酶链式反应，）即聚合酶链式反应，是指在是指在是指在是指在DNADNA聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以DNADNA为模板，特定引物为为模板，特定引物为为模板，特定引物为为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在延伸起点，通
11、过变性、退火、延伸等步骤，在延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制体外复制体外复制体外复制DNADNA的过程。的过程。的过程。的过程。五、实验原理五、实验原理131415PCR 反应系统的组成反应系统的组成l l 模板模板DNAl l 引物引物l l dNTPl l 耐热的耐热的 DNA聚合酶聚合酶l l 缓冲液缓冲液16(一一一一)模板模板模板模板DNADNAPCR 可以以可以以 DNA 或或 RNA 为模板进行核酸的体为模板进行核酸的体外扩增。外扩增。模板的浓度要适当模板的浓度要适当 基因组基因组基因组基因组DNADNA：50-100 50-100 ngng质粒质粒质粒质粒DNA
12、:5-10 DNA:5-10 ngng95模板DNA17(二二二二)引物引物引物引物 与摸板与摸板DNADNA链互补的小片段链互补的小片段DNADNA分子；分子；作为作为DNADNA复制的起始点，复制的起始点，即与目的片段即与目的片段互补的一段寡核苷酸链。互补的一段寡核苷酸链。PCR PCR特异性反应的关键；特异性反应的关键；引物引物1 1引物引物2 25518引物的特异性：引物的特异性：引物的设计与合成对引物的设计与合成对 PCR 的成功与否起着决定的成功与否起着决定性的作用性的作用引物的浓度：引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性引物的浓度：引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性引物浓度过
13、高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成加引物二聚体的形成一般认为一般认为 PCR 反应中引物的终浓度为反应中引物的终浓度为 0.2 1mol/L 为宜为宜引物的设计：使用引物设计软件引物的设计：使用引物设计软件Oligo 6,Primer premier,NTI 9.0,Omiga,Dnastar等等19引物的设计原则：引物的设计原则：1.长度 一般为1530 bp2.GC含量 一般为40603.引物二聚体（1）不应有自身互补序列 （2）两个引物之间不应有多于4个碱基的互补4.引物修饰 5端可修饰，3端不能进行修饰5
14、.同源性 与非特异结合区同源性不超过706、Tm值 高于55 20（三）（三）Taq 酶酶从水生栖热菌从水生栖热菌 Thermus Aquaticus（Taq）中分离出）中分离出的热稳定性的热稳定性 DNA 聚合酶聚合酶酶浓度：酶浓度：酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增酶的浓度太高则会出现非特异性扩增每每 100l 反应液中含反应液中含 1-2.5U Taq DNA 聚合酶为佳聚合酶为佳保存：保存：-20 引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶21Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶酶酶酶活活
15、活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90100 80 60 40 2022（四）（四）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种dNTP浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与可与Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。23（五）（五）Mg2+Mg2+是是DNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。反应体系。Mg2+浓度过低
16、会使浓度过低会使Taq酶活性丧失、酶活性丧失、PCR产量下降；产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的等的浓度影响反应中游离的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。浓度。24变性温度与时间变性温度与时间变性充分：变性温度越高，时间越长变性就越充分。变性充分：变性温度越高，时间越长变性就越充分。变性温度、时间要适应：温度过高、时间过长又会影响变性温度、时间要适应：温度过高、时间过长又会影响 Taq DNA Taq DNA 聚合聚合酶的活性，酶的活性，变性温度变性温度90-95 90-95 为宜
17、。为宜。退火温度与时间：退火温度与时间：复性温度决定着复性温度决定着 PCR PCR 的特异性。温度越低复性越好，的特异性。温度越低复性越好，升高复性温度可以增加非特异性结合，大多数升高复性温度可以增加非特异性结合，大多数 PCR PCR 反应的反应的复性温度在复性温度在 353570,70,一般低于引物一般低于引物TmTm值的值的55左右。左右。复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。引物延伸温度一般为引物延伸温度一般为 72 72。延伸时间：延伸时间：72 72 时，核苷酸的合成速度为时，核苷酸的合成速度为 35-
18、100 35-100 个核苷酸个核苷酸 /S/S，这取决于缓冲体系、这取决于缓冲体系、pH pH、盐浓度和、盐浓度和 DNA DNA 模板的性质。模板的性质。然而，延伸然而，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。时间过长会导致非特异性扩增带的出现。延伸温度与时间：延伸温度与时间：25PCR循环次数循环次数循环次数要恰当：一般是循环次数过多，非特异性背循环次数要恰当：一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。少循
19、环次数。常规常规PCR循环次数一般为循环次数一般为2540个周期。个周期。26PCRPCR相关技术相关技术27荧光定量荧光定量PCRPCR（real-time PCRreal-time PCR）PCRPCR相关技术相关技术融汇PCR技术、DNA探针杂交技术（标记有荧光报告基团与荧光淬灭基团），结合先进的光谱检测技术发展起来的一项新技术，通过测定荧光强度来对PCR产物进行实时定量。28PCRPCR相关技术相关技术优点：起始定量优点：起始定量29PCRPCR技术的主要用途技术的主要用途（一）目的基因的克隆（二）基因突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA的序列测定（五）基因的突变分析析30P
20、CRPCR的临床应用的临床应用遗传病的诊断：-地中海贫血诊断、产前诊断、肝癌研究、-1抗胰蛋白酶缺陷症、苯丙酮尿症、痛风病等诊断研究生物识别：PCR已用于人免疫缺陷病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（HPV）等十几种病毒检测癌基因的研究：选择肿瘤基因突变部位进行扩增，可协助对肿瘤的诊断。31质粒质粒DNADNA的提取与定量的提取与定量Extraction and Quantitation of Extraction and Quantitation of Plasmid DNAPlasmid DNA32一、什么是质粒？独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；基因
21、工程常采用的载体33质粒提取方法质粒提取方法方法：碱裂解法 煮沸裂解 羟基磷灰石柱层析法 酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小大肠杆菌菌株裂解后用于纯化的技术和实验要求34基本步骤基本步骤所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：1)1)培养细菌使质粒扩增培养细菌使质粒扩增 2)2)收集和收集和裂解细菌裂解细菌 3)3)分离、纯化质粒分离、纯化质粒DNADNA分离质分离质粒粒DNADNA三步曲三步曲分离分离质粒质粒收集收集裂解裂解细菌细菌质粒质粒扩增扩增35二、实验原理二、实验原理 基于基于染色体染
22、色体DNA与与质粒质粒DNA的的变性与复性变性与复性的差的差异而达到分离目的。异而达到分离目的。碱性条件下：碱性条件下：染色体染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒质粒DNA的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。两条互补链不会完全分离。pH值至中性：值至中性：染色体染色体DNA不能复性形成网状结构，通过离心，与不不能复性形成网状结构，通过离心，与不稳定的大分子稳定的大分子RNA、蛋白质、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下复合物等一起沉淀下来而被除去。来而被除去。质粒质粒DNA恢复原来的
23、构型。恢复原来的构型。3637三、实验材料三、实验材料宿主菌：大肠杆菌DH5a菌株载体：PMD-18T质粒插入片段基因：CHD5CHD538米尔副教授领导的研究小组发现的CHD5，其编码基因位于1号染色体的特异部分（1p36）。当CHD5失去功能的时候，细胞内平时起抑癌作用的系统会被关掉。CHD5如同肿瘤抑制网络的总开关，这提示CHD5与多种人类癌症有关。根据CHD5的调节功能，可以设计更好更有效的癌症治疗策略。此前，这个基因一直是个谜。这项研究对未来的癌症治疗将产生重要影响，提高CHD5的表达量会带来额外的抑癌效果。临床实验中也发现，许多神经胶质瘤患者的CHD5基因缺失，说明CHD5与人类癌
24、症有莫大关系，打开CHD5开关功能的药物可能会对很多种癌症的治疗有效。补充知识：补充知识：模板基因39溶液溶液P1（细菌悬浮液）（细菌悬浮液）已加入已加入RNaseA溶液溶液P2（细菌裂解液）（细菌裂解液）溶液溶液P3（中和液）（中和液）去蛋白液去蛋白液PE洗脱液洗脱液WB 已加入无水乙醇已加入无水乙醇灭菌水灭菌水（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5（三）试剂：LB培养基（液体、固体）Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）40溶液溶液 I I 50 mmol/L 葡萄糖25 mmol/L TrisCl(p
25、H8.0)10 mmol/L EDTA(pH8.0)2 mg/mL溶菌酶作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块41溶液溶液 IIII0.2 mol/L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)1%SDS作作用用：细细胞胞壁壁肽肽聚聚糖糖在在碱碱性性下下水水解解，核核酸酸和和蛋蛋白白质变性。质变性。注意：时间勿太久，动作要温和，轻轻颠倒几次注意：时间勿太久，动作要温和，轻轻颠倒几次42溶液溶液 IIIIII5mol/L 乙酸钠60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液中钠的浓
26、度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。作作用用：酸酸性性条条件件下下质质粒粒DNADNA复复性性，变变性性蛋蛋白白-SDS-SDS线线性性DNADNA沉淀，沉淀，NaNa可中和可中和DNADNA注意：复性时间不宜过长注意：复性时间不宜过长432、离心层析柱硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质；通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；44四、实验步骤四、实验步骤1.取取1.5ml培养物加入培养物加入Eppendorf管中管中2.9000rpm30 s，弃上清弃上清3.加入加
27、入250l 溶液溶液P1，吹打，使细菌沉淀分散，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮彻底悬浮。4.加入加入250l 溶液溶液P2，颠倒，颠倒610次混匀（次混匀（不要剧烈振荡不要剧烈振荡），），直到溶液变得直到溶液变得清亮清亮.5.加入加入400l 溶液溶液P3，立即，立即温和温和混匀，室温放置混匀，室温放置3-5min。13000rpm离心离心10min，小心，小心取上清液（取上清液（700-800l）。6.将将吸附柱吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱吸附柱中，中，13000rpm离心离心3min，弃滤液弃滤液。7.加入加入500l去蛋白液，去蛋白
28、液，13000rpm离心离心1min，弃滤液弃滤液，8.向吸附柱中加入向吸附柱中加入500l 漂洗液漂洗液WB，13000rpm离心离心1min，弃滤液弃滤液。9.重复步骤重复步骤8一次。一次。10.空柱空柱13000rpm离心离心2min，然后室温放置，然后室温放置3-5min，使残留乙，使残留乙醇挥发。醇挥发。11.取出吸附柱取出吸附柱，放入一个干净的，放入一个干净的离心管离心管中，在吸附膜的中间中，在吸附膜的中间加加60l-100l洗脱缓冲液，室温放置洗脱缓冲液，室温放置1min，13000rpm离心离心1min洗脱质粒洗脱质粒DNA，-20保存备用。保存备用。45质粒定量检测质粒定量检
29、测紫外分光光度计法紫外分光光度计法 原理：1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 2,而且物质对光的吸收是具有选择性的 3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱46一、质粒定量一、质粒定量紫外吸收检测质粒紫外吸收检测质粒DNADNA的浓度的浓度因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。dsDNA(双链DNA)1OD260=50ug/mlssDNA(单链DNA)1OD260=33ug/mlRNA1OD260=40ug/ml记录OD260值，通过计算确定DNA浓度，公式如下:质粒质粒DNA(DNA(g g/ml)=50(O
30、D/ml)=50(OD260260)稀释倍数稀释倍数 47 根据在260nm以及在280nm的读数比值（A260/280=OD260/OD280）估计核酸的纯度A260/280=1.8 DNA样品较纯,符合实验要求A260/2801.9 RNA污染A260/2801.6 有蛋白质或其它杂质的污染注意:eppendorf公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度和A260/280值.A260/A280可以反应可以反应DNA的纯度：的纯度：48二、实验仪器二、实验仪器核酸蛋白测定仪 比色杯 49三、实验方法三、实验方法1打开仪器电源开关，无需预热。2根据样品的不同，
31、在仪器控制面版上选择对应的方法组，如测量质粒DNA浓度选 ，测量RNA浓度选 等，以此类推。3选择进入方法组后，选择你所需要的方法，然后按enter键 确认。4按parameter/dilution键 设置样品稀释倍数，输入样品的体积和稀释样品所用稀释液的体积，按enter键 确认。（取质粒DNA样品2l+98l灭菌水）5后推打开仪器上放置石英比色皿的槽盖。6按照设置的稀释方法，先向石英比色皿中加入对应体积的空白稀释液，然后把石英比色皿放入检测槽，按blank键 进行调零。7再按照设置的稀释方法，向石英比色皿中加入对应体积的样品，并用微量加样器轻轻混匀。8按sample键 ，仪器会根据样品的稀
32、释倍数自动计算出样品的最终浓度。注意事项：1为确保液体始终处于检测区的中心位置，被检测样品的体积必须50ul。2为避免石英比色皿受到污染，每次检测样品浓度前后都要用灭菌蒸馏水或去RNase水清洗石英比色皿3实验结束后，前推盖上检测槽的槽盖，并关掉仪器电源。50数据处理数据处理测量次数质粒DNA浓度(g/ml)Ratio值(A260/A280)123平均值51琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳DNA agarose gel electrophoresis52一、琼脂糖凝胶一、琼脂糖凝胶 天然琼脂（天然琼脂（AgarAgar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose Aga
33、rose，约约占占8080）及琼脂胶（）及琼脂胶（AgaropectinAgaropectin）组成。组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳收，
34、因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。53在一定电场强度下，在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子的迁移取决于分子筛效应分子筛效应，即，即DNA分子本身的分子本身的大小和构型大小和构型(相对分子质量不同的相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样片段泳动速度不一样)，且，且DNA分子的分子的迁移速度与相迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。对分子质量的对数值成反比关系。作用：作用：凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的质量相同，但构型不同的DNA分子：一分子：一般来说，其中闭
35、环结构泳动最快，其般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环次为线性结构，最慢的可能是单链开环。二、琼脂糖凝胶电泳原理二、琼脂糖凝胶电泳原理染色染色溴化乙锭溴化乙锭(EB):3,8-二氨基二氨基-5-乙基乙基-6苯基菲啶溴盐苯基菲啶溴盐)，可与，可与DNA结合结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性。有致癌性。Gelview:荧光染料荧光染料,在紫外光照射下呈现绿色荧光在紫外光照射下呈现绿色荧光54琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围胶浓度（）线性DNA分子大小（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461
36、.50.242.00.13胶浓度越大，越适宜分离的胶浓度越大，越适宜分离的DNA越小越小55影响迁移速率因素影响迁移速率因素 1、DNA的分子大小 2、琼脂糖浓度 3、DNA分子的构象 4、电源电压 5、嵌入染料的存在 6、离子强度影响 56三、实验材料三、实验材料电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。溴酚蓝慢。6loading buffer GelviewGelview ：荧光染料：荧光
37、染料,在紫外光照射下呈现绿色荧光在紫外光照射下呈现绿色荧光TBETBE：TBETBE贮液贮液2L2L：54g Tris-base54g Tris-base、27.5g27.5g硼酸、硼酸、20ml 0.5M20ml 0.5M的的EDTA(pH8.0)EDTA(pH8.0)加水至加水至1L,1L,用钱稀释用钱稀释1010倍倍琼脂糖琼脂糖：1g1g5 5、DNA Marker5000DNA Marker5000DNA Marker5000DNA Marker500057DNA Marker DNA Marker 是分子量不同的是分子量不同的是分子量不同的是分子量不同的DNADNA片段，主片段，主片
38、段，主片段，主要用途就是要用途就是要用途就是要用途就是DNA DNA 分子凝胶电泳时，加样用做分子凝胶电泳时，加样用做分子凝胶电泳时，加样用做分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。应选择在目标片段大小附近应选择在目标片段大小附近ladderladder较密较密的的markermarker，这样对目标片段大小的估计较准，这样对目标片段大小的估计较准确。确。58凝胶准备胶床准备铺胶静置胶床置于电泳槽中加电泳缓冲液拔梳子上样电泳取出凝胶拍照三、实验步骤三、实验步骤59样品准备：将样品准备
39、：将6l PCR产物、提取的质粒产物、提取的质粒DNA、分别与大约为样品体积、分别与大约为样品体积1/6的的loading buffer用加样器轻轻混匀；用加样器轻轻混匀；上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中；上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中；盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；电泳条件：电压电泳条件：电压120v；时间；时间2530分钟；分钟；电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带 60注意事项注意事项1.1.凝胶浓度选择凝胶浓度选择根据样品根据样品DNADNA分子大小而定，所以电泳前应对分
40、子大小而定，所以电泳前应对DNADNA片段片段大小有粗略的估计。大小有粗略的估计。2.2.倒胶倒胶时把握好胶的温度，不要高于时把握好胶的温度，不要高于6060，温度太高会使制板变形。，温度太高会使制板变形。3.3.胶一定要凝固好才能拔梳子，方向要竖直向上，不要弄坏点样孔胶一定要凝固好才能拔梳子，方向要竖直向上，不要弄坏点样孔4.4.电泳前，确认电泳前，确认样品孔位于电场负极样品孔位于电场负极；5.5.点样时枪头下伸，一定不要弄破胶，并且点样时枪头下伸，一定不要弄破胶，并且点样孔内不能有气泡点样孔内不能有气泡，缓，缓冲液不要太多冲液不要太多6.6.GelviewGelview有毒，切勿用手接触，
41、更不要污染环境，胶勿乱扔有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔7.7.紫外线照射不要太久紫外线照射不要太久61 采用采用采用采用1 1琼脂糖凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳分析PCRPCR产物、酶切产产物、酶切产产物、酶切产产物、酶切产物以及提取的物以及提取的物以及提取的物以及提取的DNADNA四、结果分析DNA-markerDNA-marker质粒质粒DNAPCR产物产物酶切产物酶切产物点样顺序点样顺序62五、预期实验结果M:DL5000 DNA MarkerM:DL5000 DNA Marker1,4,7,10 1,4,7,10 为为质粒质粒2,5,8,
42、11 2,5,8,11 为为PCR目的条带目的条带;3,6,9,123,6,9,12为酶切片段为酶切片段 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 125000 bp3000 bp2000 bp1500 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp酶切长片段含目的DNA片段的酶切短片段63温馨提示防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。Gelview是强诱变剂，有致癌性，操作时要带手套，防止污染。所有含有是强诱变剂，有致癌性，操作时要带手套，防止污染。所有含有Gelview的溶液在弃置前应当
43、进行净化处理。的溶液在弃置前应当进行净化处理。64一、回顾实验流程一、回顾实验流程简述实验内容流程，简述实验内容流程，PCR操作步骤操作步骤煮菌，煮菌，PCR（PCR程序最后设程序最后设4保温）保温）约约2小时收集小时收集PCR产物产物学习学习PCR原理原理质粒质粒DNA提取提取（约（约1小时）小时）紫外检测定量知识（计算方法），步骤紫外检测定量知识（计算方法），步骤紫外检测紫外检测定量定量琼脂糖电泳原理琼脂糖电泳原理电泳电泳（样品：质粒（样品：质粒DNA，PCR产物，酶切产物，产物，酶切产物，Marker）约约30分钟分钟观察电泳结果、观察电泳结果、记录、拍照、保存记录、拍照、保存65思考题思考题1.碱法提质粒中溶液碱法提质粒中溶液I、II、III的作用？的作用？2.简述简述PCR产物电泳出现非特异扩增条带的原因。产物电泳出现非特异扩增条带的原因。66