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1、质粒DNA的提取、纯化与鉴定南通大学江苏省神经再生重点实验室蒋茂荣 一、基因克隆的质粒载体1 1、定义、定义 双链闭环DNA；1kb-200kb；独立存在于宿主染色体之外；具复制起始点；复制和转录不同程度依赖于宿主基因；编码某些酶，使宿主具有特殊标志，可供选择。2 2、载体性质、载体性质 （1）.复制能力；（2）.容纳外源DNA的能力；（3）.选择标记：抗生素耐受。（4）.引入多克隆位点；（5）.引入重组选择标记。3 3、载体分类：、载体分类：按功能分 1.克隆载体 2.表达载体 按宿主性质 1.原核载体:质粒载体、粘粒、噬 菌粒、噬菌体、噬菌体M13等 2.真核载体:逆转录病毒、腺病毒、昆虫
2、杆状病毒 3.穿梭载体 4 4、常用质粒载体、常用质粒载体 例如：1.pBR322、pUC 18/19、pUC118/119、pGEM、pBluescript、pBluescript SK/KS等 2.pET、pGEMEX、pGEX等 3.pALTER等 5 5、常用质粒宿主、常用质粒宿主：HB101、DH5、TG1、JM系列等 BL21（DE3）等二、质粒DNA的分离纯化（一）、细菌培养物的生长和收获（一）、细菌培养物的生长和收获（二）、质粒（二）、质粒DNADNA的提取的提取 1 1、碱裂解法小量制备质粒、碱裂解法小量制备质粒DNA:DNA:a a、细菌的收集；、细菌的收集；b b、加入、
3、加入100l100l溶液溶液，重悬细菌；，重悬细菌；c c、加入、加入200l200l溶液溶液，使细菌悬液清亮；，使细菌悬液清亮；d d、加入、加入150l150l溶液溶液，冰上放置，冰上放置3-53-5分钟；分钟；e e、加入、加入450l450l酚：氯仿混匀；酚：氯仿混匀；f f、12000rpm12000rpm，离心，离心5 5分钟；分钟；g g、吸取上清，加入、吸取上清，加入2 2倍体积无水乙醇，室温倍体积无水乙醇，室温 静置静置2 2分钟；分钟；h h、12000rpm12000rpm离心离心5 5分钟，弃上清；分钟，弃上清；i i、75%75%乙醇洗涤，室温晾干；乙醇洗涤，室温晾干；j j、溶于适量、溶于适量TE/RTE/R中。中。三、质粒DNA的鉴定（一）、紫外光谱分析 通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯度。（二）、EB荧光分析（三）、电泳鉴定 在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DNA经单一酶切后与DNA Marker进行电泳对照，即可知该质粒的分子量大小。质粒的电泳图谱质粒的电泳图谱