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1、质粒DNA的提取、定量酶切与PCR鉴定http:/ Teaching Center of Biochemistry and Molecular BiologyExpertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology余海浪E-mail:http:/ 了解紫外吸收法检测了解紫外吸收法检测DNADNA浓度与纯度的原理、方法浓度与纯度的原理、方法 学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作掌握掌握PCRPCR基因扩增的原理和操作方法基因扩增的原理和操作方法4第二部分第二部分 质粒质粒DNADNA提取与定量提取与
2、定量Extraction and Quantitation of Plasmid DNAExtraction and Quantitation of Plasmid DNA5独立于细菌染色替外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；存在于细菌，放线菌，真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多质粒（质粒（lasmidlasmid）定定 义义 6碱裂解法煮沸裂解羟基磷灰石柱层析法质粒DNA释放法酸酚法等方方 法法 选择哪一种方法主要取决以下几个因素：质粒的大小大肠杆菌菌株裂解后用于纯化的技术和实验要求7分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA分离质分
3、离质粒粒DNADNA三步曲三步曲分离分离质粒质粒收集收集裂解裂解细菌细菌质粒质粒扩增扩增基本步骤基本步骤 8基本原理基本原理 1 1、碱裂解法、碱裂解法基于染色体基于染色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA的变性与复性的差异；的变性与复性的差异；高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉定去除；92、离心层析柱基本原理基本原理 硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA；去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质
4、粒DNA从硅基质膜上洗脱；10原理示意图原理示意图原理示意图原理示意图11（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5（三）试剂：LB培养基（液体、固体）Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）溶液 P1 溶液 P2溶液 P3 去蛋白液 PE漂洗液 WB洗脱液 EB仪器材料仪器材料 1250mmol/L 50mmol/L 葡萄糖葡萄糖25mmol/L TrisCl(pH8.0)25mmol/L TrisCl(pH8.0)10 mmol/L EDTA(pH8.0)10 mmol/L EDTA(pH8.0)作用：分散细
5、胞，鳌合金属离子作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活使金属酶失活注意：菌液一定悬浮均匀，不能注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块有结块溶液溶液 I I 130.2 mol/L NaOH0.2 mol/L NaOH1%SDS1%SDS作作用用：细细胞胞壁壁肽肽聚聚糖糖在在碱碱性性下下水水解，核酸和蛋白质变性。解，核酸和蛋白质变性。注注意意：时时间间勿勿太太久久，动动作作要要温温柔柔，轻轻颠倒几次轻轻颠倒几次溶液溶液 IIII 145mol/L 5mol/L 乙酸钾乙酸钾 60 ml60 ml冰乙酸冰乙酸 11.5ml11.5ml水水 28.5ml28.5ml作作用用：酸酸性性条条件件下下质质粒
6、粒DNADNA复复性性，变变性性蛋蛋白白-SDS-SDS线线性性DNADNA沉沉淀淀，NaNa可中和可中和DNADNA注意：复性时间不宜过长注意：复性时间不宜过长溶液溶液 IIIIII 15菌液菌液离心离心13000rpm,1min13000rpm,1min弃上清弃上清瞬时离心瞬时离心彻底弃上清彻底弃上清加加250l 250l 溶液溶液P1P1旋涡振荡旋涡振荡悬浮沉淀悬浮沉淀加加250l 250l 溶液溶液P2P2加加400l400l 溶液溶液P3P3颠倒数次颠倒数次放置放置3-5min3-5min离心离心13000rpm,10min13000rpm,10min取上取上700l700l加加到吸
7、附柱中到吸附柱中离心离心13000rpm,1min13000rpm,1min弃滤液，加入弃滤液，加入500l500l去蛋白液去蛋白液13000rpm,1min13000rpm,1min离心离心（1 1）（2 2）（3 3）（4 4）（5 5）（6 6）（7 7）（8 8）（9 9）弃滤液，加入弃滤液，加入500l500l漂洗液漂洗液WBWB（1010）离心离心13000rpm,1min13000rpm,1min弃滤液，加入弃滤液，加入500l500l漂洗液漂洗液WBWB（1111）离心离心13000rpm,1min13000rpm,1min弃滤液弃滤液（1212）空柱离心空柱离心13000rp
8、m,2min13000rpm,2min放入一个干净的离心管放入一个干净的离心管中中(开盖放置开盖放置3min)3min)，在，在吸附膜的中间加吸附膜的中间加60l60l洗洗脱液脱液EBEB(放置放置1min)1min)离心离心13000rpm,1min13000rpm,1min（1313）-20-20保存备用保存备用操作步骤操作步骤 颠倒数次颠倒数次16紫外光吸收法紫外光吸收法 原理：原理：1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 2,而且物质对光的吸收是具有选择性的 3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质
9、的浓度有一定的比例关系.定量检测定量检测 17计算方法计算方法:因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。dsDNA(双链双链DNA)1 A260=50ug/mlssDNA(单链单链DNA)1 A260=33ug/mlRNA1 A260=40ug/ml定量检测定量检测 18记录A260值，通过计算确定DNA浓度，公式如下:质粒质粒DNA(DNA(g g/ml)=50(A/ml)=50(A260260)稀释倍数稀释倍数 注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA
10、的最终浓度和Ratio值.定量检测定量检测 19 根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度（Ratio=ARatio=A260260/A/A280280）Ratio=1.8 DNA样品较纯,符合实验要求Ratio1.9 RNA污染Ratio1.6 蛋白质或其它杂质的污染定量检测定量检测 20实验仪器实验仪器定量检测定量检测 紫外分光光度计 比色杯 21数据处理测量次数测量次数质粒质粒DNADNA浓度浓度(g/mL)RatioRatio值值(A260/A280)123平均值平均值定量检测定量检测 22定量检测定量检测 231.1.菌体老化菌体老化2.2.碱裂解不充分碱裂解不充分3
11、.3.菌体中无质粒菌体中无质粒4.4.溶液使用不当溶液使用不当1.1.请涂布平板培养后，重新挑选请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养新菌落进行液体培养2.2.可减少菌体用量或增加溶液的可减少菌体用量或增加溶液的用量用量3.3.不要频繁转接，每次接种时应不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。浓度是否正确。4.4.溶液溶液在温度较低时可能出现在温度较低时可能出现浑浊，置于浑浊，置于3737保温片刻直至保温片刻直至溶解为清亮的溶液。溶解为清亮的溶液。q问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
12、原原因因对对策策常见问题常见问题 241.1.混有蛋白混有蛋白2.2.混有混有RNARNA3.3.混有基因组混有基因组DNADNA1.1.不要使用过多菌体。重新纯化不要使用过多菌体。重新纯化DNADNA，去除蛋白、多糖、多酚去除蛋白、多糖、多酚等杂质等杂质2.2.加入加入RNaseARNaseA室温放置一段时间室温放置一段时间3.3.加入溶液加入溶液II II 和和IIIIII后后防止剧烈防止剧烈振荡，可能把基因组振荡，可能把基因组DNADNA剪切剪切成碎片从而混杂在质粒中成碎片从而混杂在质粒中。细。细菌培养时间过长会导致细胞和菌培养时间过长会导致细胞和DNADNA的降解，培养时间不要超的降解
13、，培养时间不要超过过1616小时。小时。q问题二：质粒纯度不高，如何解决？原原因因对对策策常见问题常见问题 25第三部分第三部分 酶切鉴定酶切鉴定DNA Restriction Enzyme Digestion26限制性内切酶（restriction restriction endonucleaseendonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本工具。特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制性内切酶限制性内切酶 27限制酶的切割点因酶而异，
14、有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段,如HaeIII,有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoR.限制性内切酶限制性内切酶 28 平末端平末端在识别顺序的中心对称轴处切割在识别顺序的中心对称轴处切割5 G-G-C-C 33 C-C-G-G 55 G-G3 C-C-C-C 3-G-G 5HaeIII限制性内切酶限制性内切酶 29 33端粘性末端端粘性末端在识别顺序的双侧末端切割在识别顺序的双侧末端切割DNADNA双链，于对称轴的双链，于对称轴的33末端切割。末端切割。5 G-G-T-A-C-C 33 C-C-A-T-G-G 5 G-G-T-A-C 3
15、CC 3 C-A-T-G-G Kpn I限制性内切酶限制性内切酶 305 G-A-A-T-T-C 33 C-T-T-A-A-G 5 G C-T-T-A-A 55 A-A-T-T-C G EcoRI55端粘性末端端粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割在识别顺序的双侧末端切割DNADNA双链，于对称轴的双链，于对称轴的55末端切割。末端切割。5 A-A-G-C-T-T 33 T-T-C-G-A-A 5 A T-T-C-G-A 55 A-G-C-T-T A HindIII限制性内切酶限制性内切酶 31双酶切限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的
16、BUFFER 如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；限制性内切酶限制性内切酶 32BufferBuffer的选择查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在的选择查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同不同bufferbuffer中的活力表中的活力表33 酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 l 反应液中，30温度下反
17、应1小时，将1 g 的DNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外该酶可分解15g的DNA。限制性内切酶限制性内切酶 34插入插入400bpDNA片段片段质粒大小为:2692bp+400bp=3092bp酶切片段大小为?酶切位点酶切位点35影响酶切反应的因素 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等 均能抑制酶反应;反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+,合适离子强度可以激发酶切反应;反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%;保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;限制性内切酶限制
18、性内切酶 36试剂名称试剂名称体积体积(L)L)无菌水无菌水6.010M酶切缓冲液酶切缓冲液 2.0质粒质粒DNA 10.0Hind III(15U/ul)1.0EcoR I (12U/ul)1.0总体积总体积20.0在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入下述试剂 移液枪轻轻混匀移液枪轻轻混匀(避免产生气泡避免产生气泡),37),37水浴水浴1.5h1.5h反应体系反应体系 37第四部分第四部分 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳DNA Agarose Gel Electrophoresis38u天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80）及琼脂胶（Agarope
19、ctin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。定定 义义 39琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量
20、的对数值成反比关系).实验原理实验原理 40 1、DNA的分子大小 2、琼脂糖浓度 3、DNA分子的构象 4、电源电压 5、嵌入染料的存在 6、离子强度影响 影响迁移速率因素影响迁移速率因素 41分离范围分离范围 42.电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。Gelview TBE琼脂糖5、DNA Marker 5000实验材料实验材料 43溴化乙锭(EB):3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性.Gelview:是一种新型核酸染料,可与DNA分子形
21、成复合物，能产生极强的荧光信号，其灵敏度比EB高,且荧光强度与DNA含量成正比荧光,在紫外光照射下呈现绿色荧光.常用染料实验材料实验材料 44是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。DNA Marker 应选择在目标片段大小附 近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。实验材料实验材料 45电泳缓冲液4 保存备用保存备用实验材料实验材料 46凝胶准备胶床准备铺胶静置胶床置于电泳槽中加电泳缓冲液拔梳子上样电泳取出凝胶拍照实验步骤实验步骤 47倒胶时把握好胶的温度，不要高于60，否则温度太高会使制板变形胶一定要凝
22、固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔电泳前，确认样品孔位于电场负极；点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多Goodview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔紫外线照射不要太久注意事项注意事项 48 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 125000 bp3000 bp2000 bp1500 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM:DL5000 DNA MarkerM:DL5000 DNA Marker1,4,7,10 1,4,7,10 为质粒为质粒DNADNA2,5,8,11 2,5,8,11 为为PCRPCR产物产物3,6,9,12 3,6,9,12 为酶切片段为酶切片段酶切长片段含目的DNA片段的酶切短片段实验结果实验结果 49思考题1.碱法提质粒中溶液I、II、III的作用？2.结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？3.影响PCR的主要因素有那些?50