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1、质粒质粒DNADNA的提取鉴定的提取鉴定n掌掌握握碱碱变变性性法法从从大大肠肠杆杆菌菌中中提提取取质质粒粒DNADNA原原理理和方法。和方法。n掌握掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒质粒DNADNA的技术。的技术。一、实验目的一、实验目的 质粒（质粒（plasmid）是一种独立的稳定的遗传因是一种独立的稳定的遗传因子，存在于细菌等细胞中。它们为双链、闭环的子，存在于细菌等细胞中。它们为双链、闭环的DNA分子，大小从分子，大小从1kb到到200kb不等，具有不等，具有自主复自主复制和转录能力制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的并表达
2、所携带的DNA基因信息，但其复制和转录要基因信息，但其复制和转录要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，而宿主在没利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，而宿主在没有质粒时是可以正常生长的。因此，有质粒时是可以正常生长的。因此，质粒是一种寄质粒是一种寄生性的自主复制子。生性的自主复制子。细菌质粒是基因工程中常用的细菌质粒是基因工程中常用的基因载体基因载体，也是，也是分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达的好材料。的好材料。二、实验原理二、实验原理l碱变性抽提法法碱变性抽提法法是常用的方法之一是常用的方法之一.l此此法法基基于于染染色色体体DNADNA与与
3、质质粒粒DNADNA的的变变性性与与复复性性差差异异而而达达到分离的目的到分离的目的。l在在pHpH高高达达12.612.6的的条条件件下下，染染色色体体DNADNA的的氢氢键键断断裂裂、双双螺螺旋旋解解开开而而变变性性；质质粒粒DNADNA的的大大部部分分氢氢键键也也断断裂裂，但但超超螺螺旋旋共共价价闭闭合合环环状状结结构构的的两两条条互互补补链链未未完完全全分分离离，当当用用pH4.8pH4.8的的KacKac高高盐盐缓缓冲冲液液调调节节pHpH至至中中性性时时，变变性性的的质质粒粒DNADNA又又恢恢复复到到原原来来的的构构型型，以以可可溶溶性性状状态态存存在在于于液液相相中中，而而染染
4、色色体体DNADNA不不能能复复性性，形形成成缠缠绕绕的的网网状状结结构构，与与不不稳稳定定的的大大分分子子RNARNA、蛋白质等一起沉淀出来。、蛋白质等一起沉淀出来。二、实验原理二、实验原理抽提中各种因素的影响，质粒抽提中各种因素的影响，质粒DNADNA可能以可能以三种形式三种形式存在：存在：1.1.共价闭环共价闭环DNADNA（covalently closed circular DNAcovalently closed circular DNA，cccDNAcccDNA），常以超螺旋形式存在；），常以超螺旋形式存在；2.2.开环开环DNADNA（open circular DNAopen
5、 circular DNA，ocDNAocDNA），此种质），此种质 粒粒DNADNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，形的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，形成缺刻，可以自由旋转从而消除了张力，形成松弛的成缺刻，可以自由旋转从而消除了张力，形成松弛的环状分子；环状分子；3.3.线状线状DNADNA（linear DNAlinear DNA，lDNAlDNA），质粒），质粒DNADNA的两条的两条 链在同一处断裂所形成。在电泳时，同一质粒链在同一处断裂所形成。在电泳时，同一质粒DNA DNA 的泳动速度根据迁移率从小到达分别为开环，线形的泳动速度根据迁移率从小到达分别为开环，线形 和超螺
6、旋和超螺旋DNADNA。cccDNAcccDNA含量越高，表明制备的质粒含量越高，表明制备的质粒DNADNA质量越好。质量越好。三、操作步骤三、操作步骤 详见详见189-190页页50 mM 葡萄糖葡萄糖25 mM Tris-HCl10 mM EDTA-Na2200 mM NaOH 1%（W/V）SDS3 mM KAC2510 min30 min 以上l 不同的不同的DNADNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带。泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带。l 核酸构型不同，在凝胶中的电泳速
7、度差别较大。同一质粒核酸构型不同，在凝胶中的电泳速度差别较大。同一质粒DNADNA的泳动速度次序为：的泳动速度次序为：共价闭环共价闭环DNADNA开环开环DNADNA线状线状DNADNA。l溴化乙锭溴化乙锭可插入到可插入到DNADNA分子的双链中。在波长分子的双链中。在波长254nm254nm紫外光照紫外光照射下插入溴化乙锭的射下插入溴化乙锭的DNADNA显橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作显橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧荧光指示剂光指示剂指示指示DNADNA含量和位置。含量和位置。四、四、DNA的琼脂糖凝胶电泳原理的琼脂糖凝胶电泳原理 1.1.琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的制制备备：本本实实验验采采
8、用用1.0%1.0%的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶。称称取取0.3g0.3g琼琼脂脂糖糖放放入入锥锥形形瓶瓶，加加入入30ml30ml电电泳泳缓缓冲冲液液，置置于于微微波波炉炉使使其其充充分分融融化化。室室温温放放置置至至6060左左右右，加加入入EBEB使使其其终终浓浓度度为为0.5ug/ml0.5ug/ml，混匀，倒胶板（，混匀，倒胶板（30ml/30ml/板）。板）。2.2.凝胶板的制作：凝胶板的制作：用用1cm1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两端边缘围成高端边缘围成高4mm4mm的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的模的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的模板置于水平
9、台上，迅速将上面板置于水平台上，迅速将上面胶液倒在模板的中央，让胶液自胶液倒在模板的中央，让胶液自由流向四周。待胶液充分冷却凝由流向四周。待胶液充分冷却凝固，将胶纸围墙慢慢取下，制备固，将胶纸围墙慢慢取下，制备好的凝胶板放入电泳槽中，加电好的凝胶板放入电泳槽中，加电泳缓冲液直至没过胶面约泳缓冲液直至没过胶面约1mm1mm深，深，取出样品梳。取出样品梳。五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤3.3.加样：加样：20ul TE+3ul 20ul TE+3ul 上样缓冲液，上样缓冲液，取取6ul 6ul 进行点样进行点样4.4.电泳：电泳：l电压：电压：60V60Vl电泳时间：电泳时间
10、：0.5 h0.5 hl电泳终止：指示剂距离凝胶前电泳终止：指示剂距离凝胶前沿约沿约1cm1cm处处5.5.检测：检测：取出胶板，用紫外检测仪取出胶板，用紫外检测仪观察结果。纯的质粒观察结果。纯的质粒DNADNA只有超螺只有超螺旋旋DNADNA一条带。一条带。6.6.凝胶处理：凝胶处理：鉴定后的凝胶应放在鉴定后的凝胶应放在指定的地方，待干燥后烧毁，不能指定的地方，待干燥后烧毁，不能倒在垃圾中，以防倒在垃圾中，以防EBEB污染。污染。五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤六、实验报告要求六、实验报告要求一、一、原理原理二、二、操作操作三、三、结果（铅笔绘图：正负极，条带数目、名结果（铅笔绘图：正负极，条带数目、名称、强弱、距离）称、强弱、距离）四、四、结果说明结果说明五、五、思考题思考题1 1、分离提取分离提取DNADNA的的过过程中哪些因素会引起程中哪些因素会引起链链的断裂的断裂?2 2、本实验为了质粒本实验为了质粒DNADNA纯度和分子的完整性，采用纯度和分子的完整性，采用了哪些措施？了哪些措施？