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1、宁德师范学院毕业设计(论文)诺氟沙星对锦鲫的环境健康风险评价诺氟沙星对锦鲫的环境健康风险评价院系：化学与材料学院专业（班级）：环境科学与工程1班姓名：黄慧娴学号:B2016063144指导教师：阚海峰职称：讲师完成日期：2020年5月20日宁德师范学院教务处制原创性声明本人声明所呈交的本科毕业论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明。签名：_ 日期：_关于论文使用授权的说明本人完全了解宁德师范学院有关保留、使用毕业论文的规
2、定，即：宁德师范学院有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；宁德师范学院可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。（保密的论文在解密后应遵守此规定）签名：_ 导师签名：_ 日期：_摘 要在水产养殖方面上，诺氟沙星(Norfloxacin，NFLX)是一个非常有效的杀菌药物，并且在防治领域也有相应的积极作用。作为具有广谱杀菌作用的喹诺酮类药物，被广泛应用于水产养殖，对病害防治并起到了一定的积极作用效果。本论文选择诺氟沙星作为毒物和锦鲫作为实验材料生物，在实验室条件下模拟进行半静态染毒实验，研究10 mg/kg、100mg/kg两种高低浓度的诺氟沙星对锦鲫肝脏
3、抗氧化防御系统的毒性效应。实验结果表明：10 mg/kg组和100mg/kg两组浓度都均对锦鲫体内超氧化物歧化酶(SOD)有产生诱导效果，氧化应激，酶的活性上升；两者都对过氧化氢酶（CAT）产生抑制效果，酶的活性下降，肝脏的抗氧化防御系统受到伤害损伤。在14天和30天，对于SOD酶活高低浓度组相较比空白组均都有有显著性差异（P0.05）升高还是降低了，酶的活性升高，起到诱导效果，在14天，对于CAT酶活高低浓度组都均有显著性差异（P0.05），抗氧化防御系统受到损伤升高还是降低了，酶的活性降低，起到抑制效果，诺氟沙星对水生生物锦鲫产生致毒作用。关键词:诺氟沙星；;锦鲫；;超氧化物歧化酶；;过氧
4、化氢酶；抗;氧化防御系统AbstractAs a broad-spectrum quinolone drug，,norfloxacin has been widely used in the prevention and control of aquaculture diseases and has played a positive role.In this dissertation，,norfloxacin and Brocade carp were selected as experimental materials to conduct semi-static exposure exp
5、eriments under laboratory simulation conditions to study the toxic effects of norfloxacin of 10 mg/kg and 100 mg/kg on the antioxidant defense system of Carassius auratus liver.The results showed that 10 mg/kg group and 100 mg/kg group induced superoxide dismutase (SOD) in Carassius auratus，, oxidat
6、ive stress，, increased enzyme activity，, inhibited catalase (CAT)，, decreased enzyme activity，, and damaged liver antioxidant defense system.At 14 and 30 days，,there was significant difference in SOD activity between the high and low concentration group and the blank group (P 0.05);in 14 days，, ther
7、e was significant difference in CAT activity between the high and low concentration groups (P 0.05).The antioxidant defense system was damaged and norfloxacin had toxic effect on Carassius auratus.Keyword:Norfloxacin;Brocade carpBrocade carp;Superoxide dismutase;Keywords catalase; Antioxidant Defens
8、e System目 录1 引言11.1 诺氟沙星的基本概述11.2 出现的问题21.2.1 细菌耐药性21.2.2 毒副作用31.3 诺氟沙星的药物作用31.4 锦鲫的抗氧化防御系统31.4.1抗氧化防御系统31.4.2 抗氧化防御的机理41.5 本文的研究目的和意义42 实验部分52.1 实验仪器与试剂52.2 实验步骤52.2.1 锦鲫的驯养52.2.2 染毒实验52.2.3 取样和制备样品62.3 生化指标测定62.3.1 总蛋白测定62.3.2 SOD活性测定72.3.3 CAT活性测定72.4 数据统计分析73 结果与讨论73.1 结果分析73.1.1 诺氟沙星对锦鲫肝脏内的蛋白质浓
9、度的影响73.1.2 诺氟沙星对锦鲫肝脏中的SOD酶活性的影响83.1.3 诺氟沙星对锦鲫肝脏中的CAT酶活性的影响103.2 讨论114 结论与展望124.1 结论124.2 展望13致 谢14参 考 文 献15诺氟沙星对锦鲫的环境健康风险评价1 引言喹诺酮类药物的发展可分为三个阶段。首代喹诺酮萘啶酸最先被察觉并且投入使用。在这些里，噁喹酸也经常被使用在治疗鱼类和虾类疾病上。第二代喹诺酮类药物的诞生扩大了其抗菌谱，对肠杆菌，沙雷氏菌也有相应的抗菌效果。它的抗菌效果得到增强，抗菌谱得到扩展，并且血清蛋白和PH方面上是不被影响的。因为一二两代药物的弊端，例如抗菌谱窄，口服吸收较慢，毒性反应较大等
10、，渐渐不被人们所使用。喹诺酮类药物在水产养殖中的应用大体经历了3个时代的发展，第一代喹诺酮类药物萘啶酸首先被发现并应用，其药物只对大肠杆菌、痢疾杆菌、克雷伯氏菌及少部分变形杆菌有效。其中，噁喹酸常用于治疗鱼虾病。第二代喹诺酮类药物的诞生，使其在抗菌谱方面有所扩大，对肠杆菌属、枸橼酸杆菌、绿脓杆菌及沙雷杆菌也有一定的抗菌作用。其抗菌作用有所增加，抗菌谱扩大，而且受血清蛋白和pH值的影响较小，其中，吡哌酸是国内主要的水产药物应用品种。由于第一、二代的抗菌谱窄、口服吸收慢、毒性反应大、易产生耐药性等缺点而逐渐被淘汰。第三代喹诺酮药物是在喹诺酮核心的大范围结构修饰的基本上进行开发的。在亲核的第六个位置
11、引入氟，在第七个位置引入哌嗪基，大大增加了抗菌谱，并进一步拓宽了在水产培养的应用。第三代喹诺酮类药物是建立在对喹诺酮核大规模结构改造的基础上发展起来，在母核的第6位上引入氟，第7位上引入哌嗪基，使抗菌谱明显扩展，进而广泛应用于水产养殖中。第三代以氟哌酸为首的药物开创了新的时代，跟着也就有了诺氟沙星以及恩诺沙星之类的药品。在由敏感菌所引起的呼吸道疾病和消化道感染疾病领域，第三代喹诺酮类药物使用范围是最为广泛的，还能够提高生物体的免疫作用。揭开了喹诺酮类衍生物的新序幕，随后产生了恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星等药物。第三代喹诺酮类药物主要作用于敏感菌所致的呼吸道、消化道感染。第三代喹诺酮类药物还可提
12、高机体的免疫功能。如芦氟沙星可在体外提高中性粒细胞对肺炎克雷伯杆菌的吞噬和杀灭作用1，氧氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星和洛美沙星可不同程度地提高吞噬杀菌作用2。第三代喹诺酮药物中的诺氟沙星、环丙沙星及氟甲沙星用于防治鳗、鳖等细菌性肠炎和出血病的较多3。第四阶段的喹诺酮类药物已在20世纪90年代后期研制成功，并已陆续进入临床试验。目前眼下，这此一类药物逐渐在渔业仍主要应用在人类临床医疗方面使用越来越广上，在水产养殖病害防治上还未发现该类药物的使用14。1.1 诺氟沙星的基本概述以及合成工艺作为第三代喹诺酮药物的代表其中之一的诺氟沙星(Norfloxacin)是第3代喹诺酮类抗菌药物，具有着非常强大的
13、广谱抗菌效果作用，尤其对需氧革兰阴性杆菌的抗菌活性高，生物重复使用性高利用度高，在、组织方面有着良好的渗透性好，、和与其余药物都没有其他抗菌素无相互交叉作用以及耐药性较强等、的性质。诺氟沙星于很大一部分肠杆菌科细菌均具备着优秀的抗菌效果。以及诺氟沙星对一些多重耐药细菌也具有不错的抗菌效果。副作用小及口服吸收快等特点。对下列细菌在体外具良好抗菌作用:肠杆菌科的大部分细菌，包括枸椽酸杆菌属、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌等肠杆菌属、大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形菌属、沙门菌属、志贺菌属、弧菌属、耶尔森菌等。诺氟沙星不仅具有抗菌作用，还具有杀菌效果，诺氟沙星体外对多重耐药菌亦具抗菌活性。对青霉素耐药的淋病奈瑟
14、菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌亦有良好抗菌作用。致使细菌死亡的原理是利用在诺氟沙星为杀菌剂，通过作用于细菌DNA螺旋酶上方的A亚单位，使得DNA没有办法进行合成，并且还能够阻止复制抑制DNA的合成和复制而导致细菌死亡，从而起到杀菌效果。临床用于敏感菌所致泌尿系统、肠道、呼吸系统、外科、妇科、五官科及皮肤科等感染性疾病。喹诺酮类药物结构中3、4位为羧基和酮羰基，极易和金属离子如钙、镁、铁、锌等形成螯合物，而7位的含氮杂环在酸性条件下，水溶液光照可见分解反应。5-6诺氟沙星的结构式见下图。其化学名为1-乙基-6-氟-1,4-二氢-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸。通用名:诺氟沙星(Norf
15、loxacin)，氟哌酸(Floxacin);别名:力醇罗、氟哌酸、淋克星。基本化学性质为:分子量为319.34，颜色是微白色到淡黄色，状态是粉末，容易结晶。类白色至淡黄色结晶性粉末。熔点为227-228。极易溶解于酸、碱溶液当中，在醇和水溶液中是极微溶的于水和醇。没有无臭味，有吸湿性，味微苦。诺氟沙星的结构式见附图所示。图1-1诺氟沙星结构式经典合成工艺目前，国内外通常以3-氯-4-氟苯胺为起始原料，与原甲酸三乙酯、丙二酸二乙酯环合后经乙基化、水解、哌嗪缩合、精制等步骤最终制得诺氟沙星。反应过程HC(OC2H5)3+H2C(COOC2H5)2+H5C2O-CH=C(COOC2H5)2，因此，
16、也有以3-氯-4氟苯胺和乙氧甲叉丙二酸二乙酯(EMME)直接作为起始原料制得中间体37。1.2 出现的问题现如今，水产养殖方面也在不断得进行发展，关于这方面疾病的预防和治疗也有了相应的进步，人们研究出多种类的抗生素在水产养殖上。诺氟沙星抗生素因为其广谱抗菌特性，代谢活性高，残留性较低，低毒性等特点，所以在人们使用范围是较广的，属于最经常使用抗生素的其中之一。虽然抗生素有预防疾病的突发，能够促进生长和产量等优点，但是过度利用，就会造成很大的问题，这些问题集中在耐药性，毒副作用这两个方面。随着水产养殖业的快速发展，大量的抗生素被应用在水产养殖疾病防治环节。喹诺酮类抗生素以其抗菌广谱性、代谢快、低残
17、留和低毒副作用等特点成为最常用的抗生素之一。预防疾病的暴发，促进生长，提高产量，但由于其长期大量使用，带来的问题也日益突出，主要体现在耐药性、毒副作用和残留3个方面。1.2.1 细菌耐药性这几年近年来，有许多学者在深入探究通过对喹诺酮之类的抗生素所携带的抗性基因中产生过程的深入研究发现，在水体当中发现水生细菌携带喹诺酮抗性基因是因为遗留残留在水产养殖环境当中的喹诺酮类药物会导致水生细菌产生喹诺酮抗性基因28，在水生细菌质粒中，很大可能性就是因为它才会引入人类病原体的抗性基因的源头而携带喹诺酮抗性基因的水生细菌质粒可能是抗性基因转入人类病原体的来源39；;抗生素的过分滥用就会致使喹诺酮类药物选择
18、压力较之前加大许多不同的PMQR耐药基因既能独自出现并发生作用，又能在同一质粒上共同产生耐药性10;喹诺酮类药物在水产养殖上的不断过量使用，导致喹诺酮类药物选择压力增加；当压力达到一定程度时，就会使抗性基因对不一样的细菌产生相应的运动障碍;当选择压力足够大时，喹诺酮抗性基因在不同细菌间的转移障碍就会被打破411，进一步合成从而产生更多具有携带抗性基因的细菌。从这些之前没有发现的新发现中可以看出，新的研究成果表明，如果继续长期大量使用喹诺酮类抗生素假如一直存在着超量使用的现象，药物就会对水产生物造成危害，从而也会对人类的身体方面造成相应的影响。，许多广谱抗药性细菌会危害养殖鱼类和人类消费者的身体
19、健康。1.2.2 毒副作用因为格帕沙星以及克林沙星药物不适合作用于水体环境中，在很早之前就不被允许使用，但是诺氟沙星却由于大量使用没有办法降解一直停留在环境，则出现了“伪持久”现象。近年来，在验证喹诺酮类药物对于生物体是具有低毒副作用上，有许多实验结果都可以支持该观点：除了早前被禁用的格帕沙星和克林沙星外，其余的药物都因使用频繁而在环境中呈现出“伪持久”状态。近年来部分学者的研究佐证了喹诺酮类药物的低毒副作用:陈柳芳在探究不同浓度组恩诺沙星等三种喹诺酮类药物对斜生栅藻的影响中可以得出结论，以上三类药物都属于低毒副作用抗生素通过设定不同浓度的恩诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星处理斜生栅藻，发现其半致死
20、浓度均高于50mg/L，安全浓度为5mg/L以下，证明这3种喹诺酮类抗生素是低毒副作用药物512;吴志刚在有氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星的生存环境下，把锦鲤放入其中进行暴露实验，可以得出以上三种药物都是低毒副作用抗生素将锦鲤分别长期和短期暴露在含有氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星的养殖环境中，发现氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星对锦鲤均属于低毒性物质613。虽然诺氟沙星属于低毒性物质，但如果和其余不同类别的抗生素混合使用，长期使用就会对水生物造成一定的健康影响，进而对人体也产生相应的但由于在水产养殖过程中大量的喹诺酮类抗生素会同其他种类的抗生素一起使用，长期大量使用导致抗生素及其代谢产物在水环境中呈现
21、出“伪持久”状态，对此有学者研究了恒量混合-二酮抗生素(氟喹诺酮类、四环素类)对斑马鱼的毒性试验，发现在类似农场(水产养殖鱼池和畜牧场)、医院等特殊环境的浓度刺激下，斑马鱼的线粒体和心脏组织有不同程度的损伤，也就是说生物长期暴露在混合-二酮抗生素的环境中有一定的健康风险，同时表明，氟喹诺酮类可能对人体有一定的毒害作用714。1.2.3 残留抗生素在环境和生物体内的残留问题是当下水产养殖相关科技工作者迫切需要解决的问题。对于喹诺酮类抗生素而言，早在1995年就被确定为持续性污染养殖底泥的物质15。环境中喹诺酮类抗生素的残留量和残留的种类直接关系到细菌耐药性(选择压力的大小在一定程度上决定着喹诺酮
22、抗性基因跨物种转移)和毒副作用(环境中恒量混合-二酮抗生素的种类和浓度决定其毒副作用大小12-14)。部分研究表明，环境中残留的喹诺酮类抗生素不但影响了养殖水环境的平衡，同时由于养殖水体的排放，残留的喹诺酮类抗生素进入周边水环境，使得整个流域水环境都受到来自喹诺酮类抗生素的威胁。1.3 诺氟沙星的药物作用1、尿碱化剂可减少该品在尿中的溶解度，导致结晶尿和肾毒性。该品与茶碱类合用时可能由于与细胞色素P450结合部位的竞争性抑制，导致茶碱类的肝清除明显减少，血消除半衰期延长，血药浓度升高，出现茶碱中毒症状，如恶心、呕吐、震颤、不安、激动、抽搐、心悸等，故合用时应测定茶碱类血药浓度和调整剂量。12、
23、环孢素与该药物合用，可使前者的血药浓度升高，必须监测环孢素血浓度，并调整剂量。该药物与抗凝药华法林同用时可增强后者的抗凝作用，合用时应严密监测患者的凝血酶原时间。如果和环孢素一起使用，就会造成环孢素的血浓度有着相应的提高，这时候一定要认真观察血浓度的变化，并且根据相应变化对使用量进行不同的调整。抗凝药华法林和诺氟沙星一起使用，会增加前者的抗凝效果，并且在使用时要谨慎观察就医者的凝血酶原时间。23、丙磺舒可减少该药物自肾小管分泌约50%，合用时可因该药物血浓度增高而产生毒性。该药物与呋喃妥因有拮抗作用，不推荐联合应用。多种维生素，或其他含铁、锌离子的制剂及含铝或镁的制酸药可减少该药物的吸收，建议
24、避免合用，不能避免时在该药物服药前2小时，或服药后6小时服用。诺氟沙星不宜和呋喃妥，大部分的维生素药物，以及一些含有金属离子的药物一起使用，如果一定要共同使用，那么最好是与服用本药物间隔时间较长，可以在服用前两小时，也可以是使用药物六小时之后。4、去羟肌苷(didanosine，DDI)可减少该药物的口服吸收，因其制剂中含铝及镁，可与氟喹诺酮类螯合，故不宜合用。该药物干扰咖啡因的代谢，从而导致咖啡因清除减少，血消除半衰期延长，并可能产生中枢神经系统毒性。1.4 锦鲫的抗氧化防御系统1.4.1 生物体的抗氧化防御系统生物体中的抗氧化防御系统在笼统上可分为两个种类，酶类和非酶类。这两种类又可以细分
25、为：有酶和非酶两大类：酶类有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)等属于酶类这个种类；非酶类主要包括维生素C、E等属于非酶类这个种类等。生物体的抗氧化防御系统主要功能是防御过氧化损害伤、维持机体正常。生物体内自由基的增多是可以通过外界环境的变化来改变的，外界有相应的刺激，从而诱导抗氧化酶的合成，抗氧化酶浓度升高，这样被称为应激反应8-916-17。SOD、CAT是抗氧化防御系统的第一道屏障防线，主要作用是参与除去体内自由基，还有增强身体抵抗力的功能作用；解毒酶GST、GSH-px是抗氧化防御系统的第二阶段，除了和SOD催化生成的过氧化氢反应，还能除去活性氧与
26、脂质反应得到的脂质过氧化物，将其还原成没有毒性无毒的醇类和水。而非酶物质，在抗氧化防御系统中则通过抗氧化酶的催化与外源污染物代谢的物质结合，从而降低污染物的生物毒性。1.4.2 抗氧化防御的机理在机鱼体类的抗氧化防御系统中，抗氧化酶有着多种重要作用作用：能够清理生物体内的自由基离子，当外界对于生物体有氧化危害时也能够感知并且做出防御，还能够使生物体的防御力量加强并且能够增加免疫能力等等消除机体自由基的功能、对氧化胁迫的清除功能、增强机体防御能力、增强机体免疫等108。SOD、CAT是抗氧化防御系统的重要屏障之一，有了这屏障外界才不会轻易就对机体造成损伤防线。SOD作用是将自由基离子反应生成O2
27、-催化成H2O2。当生物体内的游离H2O2 存在量太多，就会与O2- 离子生成对机体有损害的毒性羟基。如果H2O2清除不及时，H2O2便会和O2-反应生成毒性羟基自由基。而CAT主要将SOD反应生成的H2O2作为原料催化生成的H2O2 转化为H2O和O2，可以降低H2O2的浓度，保护机体组织，并且让生物体内保持一个相对的平衡状态维持机体细胞内环境的稳定1119。清除活性氧自由基的反应如下：自由基是有氧生物所必需的，但是如果自由基的生成速度量超过机体本身的抗氧化清除速度能力，未分解的自由基长时间停留期在体内就会导致抗氧化防御系统损伤，抗氧化酶活性下降。所以，要想了解当下鱼体中的状况是可以通过监测
28、因此，抗氧化酶活性的变化进行相应的验证的在一定程度上能反映鱼类目前的机体状况，可以作为衡量鱼类是否受到外界环境的胁迫的一个重要的生理指标。综上所述，对研究鱼体内抗氧化防御系统的研究，在对了解以及并提高机体的免疫方面有着重大作用意义。1.5 本文的研究目的和意义在水产养殖方面上，诺氟沙星是一个非常有效的杀菌药物，并且在防治领域也有相应的积极作用。但由于大量使用会造成水体环境中的污染，在水环境中有细菌耐药性，没办法降解而滞留在水中等等，影响水生物的生长，进而危害到人体的健康。锦鲤（Cyprinuscarpio)属缠形目、鍵科，是水体景观中主要的观赏鱼类，享有“水中活宝石”之美誉，其繁殖快、食性杂，
29、对水质要求不高，便于实验室饲养管理，是鲤科常用的试验用鱼。国内外已有学者利用锦鲤开展了许多试验的研究。本论文主要研究诺氟沙星在不同的浓度下，对与锦鲫的肌肉和内脏团肝脏中超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽转硫酶活性的影响，从而用于评价诺氧氟沙星对锦鲫的毒性效应以及酶系的响应，也为了评价诺氟沙星五氯酚对于水生动物，尤其是鱼类的毒性影响和潜在生态风险提供了基础数据，为诺氟沙星的毒理学研究提供参考。我们是锦鲫你描述锦鲤，感觉你没有认真看，不然这些内容文不对题，你的态度。2 实验部分2.1 实验仪器与试剂高速低温冷冻离心机（Allegra64R）购于美国贝克曼库尔特公司
30、紫外可见分光光度计(Unico UV2000 spectrometry)购于上海仪电公司用于超声破碎仪购自昆山市超声仪器有限公司测定组织当中总蛋白含量、SOD酶的活性、CAT酶的活性的的试剂盒均选自都是购于南京建成生物工程研究所电子天平（AL204）购于上海佑科仪器仪表有限公司牛血清白蛋白（BSA）购自上海基峰公司，纯度98%诺氟沙星(Norfloxacin)购于上海研生生化试剂有限公司鲫鱼（Carassiusauratus，19.73.6g，9.01.0cm），所有锦鲫均购自宁德市金马花鸟市场上述实验试剂都是分析纯试剂。2.2 实验步骤2.2.1 锦鲫的驯养实验用水为活性炭去氯曝气自来水，水
31、的PH值应要保持在中性水平上下，水温应在22 2 C范围之间，溶解氧的含量大于5 mg/L。锦鲫必须要在实验室条件下至少驯养15天以上，并且每天定时定量投喂饲料（所选用的为锦鲫锦鲤专用饲料），实验用水要保持持续充氧的环境。在选择锦鲫时，尽可能选用体型大小一致并且健康的锦鲫锦鲤。驯养的过程要严格按照国家标准进行，如在过程当中出现鱼体死亡的情况，要及时发现以及采取相应的措施，并且在染毒实验开始前24h，停止锦鲫的投喂。在实验开始前一天不投喂任何食物。2.2.2 染毒实验本次染毒实验采取半静态染毒接触法，以诺氟沙星作为影响因子，设立三个实验组，分别为：空白对照组（浓度为0）、浓度为10mg/kgug
32、/L的诺氟沙星溶液、浓度为100ug/Lmg/kg的诺氟沙星溶液。将锦鲫置于pH7.60.3、水温222、溶解氧5mgL-1的实验环境中，使用设备为配备自动换水系统的30L曝气水鱼缸中。从驯养的锦鲤群当中选择活泼健康食性较好的锦鲤放置在干净的鱼缸当中，每一个实验组别中放入15条锦鲤，在鱼缸当中加入曝气水至30 L，事先做好水位标记，也就是2L水一条鱼，放完鱼之后开始进行染毒实验。在实验期间，每天定时定量投喂饲料，喂食量约0.037 g/鱼，等待两个小时，鱼缸中有剩余没被吃掉的饲料每天要及时清理水中的食物残渣以及粪便，用器具捞起，随即换水。要使每个鱼缸中的暴露浓度达到一致，在换水的过程当中，先放
33、一半的水，再加入一定体积事先配置好的诺氟沙星母液和水。其中，诺氟沙星母液浓度为100mg/L(用二甲基亚砜溶解配置)。其中，诺氟沙星母液浓度为100 mg/L。这些内容都要修改2.2.3 取样和制备样品在暴露7、14、30天之后的鱼缸中选择3条大小相仿并且健康的实验用鱼，迅速击晕，使用自来水和蒸馏水稍微清洗冲洗干净，用滤纸吸干鱼体表面的水分，使用电子天平称重之后快速解剖，取出各鱼腮、肝脏使用用0.9%浓度的生理盐水冲洗组织表面，肌肉、肠至盛有超纯水的表面皿中漂洗，漂洗后之后使用滤纸稍稍擦干吸干其鱼体表面上的水珠，再使用锡箔纸（在取样前就已经事先用甲醇溶液擦拭过）包裹严实包好，放进密封性良好的入
34、封口袋里中，做好标记，放在置于温度约-80C冰柜中储存保存，以备待测。制取样品上清液：从冰柜中取出上一步低温保存的鱼体肝脏样品。放置在盘上稍稍解冻，之后用滤纸稍微擦干吸干其其表面的水分后快迅速称重量。之后将所称量的组织样品放入烧杯中，在烧杯中配加入质量体积比为1：9的冷生理盐水，配制完成之后再使用电动匀浆器搅拌均匀浆后，将所得混合物放在于冷冻离心机里，将离心机设置温度条件为-4 C，离心15分钟min。静置之后取其上清液，分别测定肝脏中蛋白质含量以及和酶的活性。并且要在4h内测完。2.3 生化指标测定2.3.1 总蛋白测定测定总测蛋白含量的测则定选择采用Bradford法1220，牛血清白蛋白
35、(BSA)作为标准蛋白。蛋白会与呈现出棕红色的考马斯亮蓝G-250和蛋白反应，其反应物的颜色为变成蓝色溶液。吸光度的值为在595nm时下，蛋白质含量处于某一在一定范围当中内，和与色素结合的物质的光密度值呈正比例关系。在实验测定过程中要以蒸馏水为空白校正仪器，同时也要将高浓度的样品溶液稀释至吸光度线性范围内，测定BSA试样和蒸馏水的吸光度。取上清液加入少量G-250，在混合匀充分后让两者反应l0分钟，然后在595nm的波长下比色。测定的蛋白含量值用于校正SOD、CAT酶的活性测定。2.3.2 SOD活性测定SOD的活性测定选择使用采用南京建成生物工程研究所所建造的试剂盒来测定相关生化参数。测定过
36、程是根据Flohe和Otting(1984)描述的方法，在测定SOD酶的活性时，我们选择改良的黄嘌呤氧化酶13的方法SOD活性根据冯明宝21等提出的方法来测定。根据吸光度的变化情况，就可推算出被测样品的SOD酶活性，单位为U SOD/g 蛋白质。，再经过公式计算，就可以求出被测样品中的SOD活性，SOD的活性的表达式为U/mg protein。组织匀浆中的SOD活力定义：当酶的活性抑制率为0.5时，得出在1mL样品反应液中，1mg组织蛋白所对应的SOD量（U/mg-protein）。实验SOD活力定义：每mg组织蛋白在1mL反应液中，抑制率达百分之五十时所对应的SOD量为一个活性单位（U）。测
37、定过程中，样品管是进行校正的，所以测定时要两种同时进行，也就是标准管和对照管。需要同时测定标准管（标准样品试样）和对照管（蒸馏水空白），用作样品管的校正。2.3.3 CAT活性测定CAT活性测定过程是按照钼酸铵比色法1422：CAT能使H2O2发生反应，加入钼酸铵会与H2O2形成过氧钼酸化合物，溶液呈现出黄色，并且颜色黄色的深浅和与CAT酶的活性是成反比例的情况。然后在405nm波长测量定吸光度数值，计算出CAT活力。组织匀浆中CAT活力定义：每秒钟1mg过氧化氢酶分解1 mol H2O2的量。测定过程以蒸馏水作为空白样品管的校正。2.4 数据统计分析在本实验中所有的数据都使用SPSS数据处理
38、软件，该软件的统计学分析在本实验当中是必不可少的，对实验数据进行统计学分析，在实验中用到的数值用平均值标准偏差的方法来表示。使用单因素方差分析方法(ANOVA)进行分析，结果如果是P0.05，也就说明实验组和对照组相对比有着显著性差异当结果P0.05表示实验组与对照组之间有显著性差异，当结果表示P 0.01就可以则认为实验组与对照组相对比之间有着极显著性差异。统计分析图均用Origin 9.1 (Origin Lab，美国)绘制。3 结果与讨论3.1 结果分析3.1.1 诺氟沙星对锦鲫肝脏内的蛋白质浓度的影响3 结果与讨论3.1 结果分析3.2.1 诺氟沙星对锦鲫肝脏内的蛋白质浓度的影响表3-
39、1 不同剂浓度量的诺氟沙星暴露不同天数后肝脏蛋白质含量的变化暴露时间/天0mg/kg暴露浓度10mg/kg100mg/kg71.435170.168141.349760.146321.258330.17826140.965580.145641.033180.152870.990130.09672301.159120.231431.132620.091881.315870.31211诺氟沙星对锦鲫的肝脏蛋白质含量的影响如图3-1所示。将暴露不同天数的10mg/kg浓度组与100mg/kg浓度组分别和对照组相比较与空白组相比，暴露天数7天时，10mg/kg低浓度组与100mg/kg高浓度组对蛋白质
40、含量均有轻微抑制现象，且与10mg/kg低浓度组相比，100mg/kg高浓度组受到的抑制更加明显。暴露天数14天时，10mg/kg浓度组与100mg/kg浓度组对蛋白质含量均有轻微诱导现象，但是结果不明显。暴露30天时，10mg/kg浓度组相比空白组有较轻轻微抑制的现象，100mg/kg浓度组相比空白组有诱导现象。但不同暴露时间和不同浓度组间均无显著性差异，这就可以说明诺氟沙星对于蛋白质含量的影响是不显著的。无明显影响。图3-1不同浓度剂量的诺氟沙星暴露不同天数后肝脏蛋白质含量的变化3.12.2 诺氟沙星对锦鲫肝脏中的SOD酶活性的影响表3-2 不同浓度剂量的诺氟沙星暴露不同天数后肝脏SOD酶
41、活性的变化暴露时间/天0mg/kg暴露浓度10mg/kg100mg/kg754.333127.0327657.951135.1560450.24133.935311464.448763.0025978.992238.5704275.140627.910063068.761535.7687779.451721.7565379.385662.76239诺氟沙星对锦鲫抗氧化酶SOD的影响如图3-2所示。在暴露7天后高低浓度两组相比较于空白空白组是都没有均无显著性差异的，10mg/kg低浓度组中的SOD酶受到轻微诱导，酶活性略微提升，100mg/kg高浓度组SOD酶受到轻微抑制，酶活性略微下降；在暴露
42、14天后，锦鲫肝脏中的SOD酶的活性和与空白组相对比比，两个浓度组别均对SOD酶活性产生诱导效应，100mg/kg高浓度组的诱导率为16.59%，10mg/kg低浓度组的诱导率为22.57%，100mg/kg高浓度组诱导率为16.59%，并且都存在显著性差异（P0.05），高低浓度组之间没有显著性差异；在暴露30天后，锦鲫肝脏中的SOD酶活与空白组相比较，两个浓度组都均对SOD酶的活性性产生诱导效应，10mg/kg低浓度组的诱导率为15.55%，100mg/kg高浓度组的诱导率为15.45%，并且存在显著性差异（P0.05），高低浓度组之间没有显著性差异。总体来说，暴露7天时，高低浓度相比空白
43、组酶的活性变化不大，暴露天数14天和30天高低浓度组相比空白组起到了诱导作用，10mg/kg低浓度组比100mg/kg高浓度诱导率更高，随着时间推移，酶活性逐逐渐降低。逐渐降低。图3-2不同浓度剂量的诺氟沙星暴露不同天数后肝脏SOD酶活性的变化3.12.3 诺氟沙星对锦鲫肝脏中的CAT酶活性的影响表3-3 不同浓度剂量的诺氟沙星暴露不同天数后肝脏CAT酶活性的变化暴露时间/天0mg/kg暴露浓度10mg/kg100mg/kg715.439871.7421210.783052.1448412.483282.186071421.516922.989811.76922.4554911.305572.
44、054933020.973032.960888.815691.4652115.747554.37288诺氟沙星对锦鲫抗氧化酶CAT的影响如图3-3所示。在暴露7天后，高低浓度组相比空白实验组均有明显抑制作用，CAT酶活降低，10mg/kg低浓度组CAT酶的活性降低，抑制率为43.18%，并且两组之间有着显著性差异（P0.05），100mg/kg高浓度组不存在无显著性差异（高低浓度组均和空白实验组进行比较），高浓度组和低浓度组两者相比之间也不存在无显著性差异；在暴露14天后，锦鲫锦鲫肝脏的CAT酶活与空白实验组相对比组相比，10mg/kgug/L低浓度组和100mg/kg高浓度组CAT酶的活性都
45、均受到明显的抑制作用，低浓度组10mg/kg浓度组抑制率为82.82%，高浓度100mg/kg浓度组抑制率为86.76%，并且两组与空白实验组相比都存在均有显著性差异（P0.05），高低浓度组间不存在之间不存在显著性差异；暴露30天后，跟空白组进行比较同空白组对照，高低浓度组都均对CAT酶的活性产生有着抑制效果作用，10mg/kgug/L低浓度组对CAT酶活性有着明显的抑制作用现象，其抑制率为57.97%，且有显著性差异（P0.05），而100mg/kgug/L高浓度组的CAT酶活无显著性差异，高低浓度组间存在显著性差异（P0.05），抑制率为93.05%。总体来说，锦鲫在暴露30天后，与空白
46、实验组相比：高低浓度组都存在均受到抑制效果作用，10mg/kg低浓度组在随着时间的推移CAT酶活抑制作用越来越强逐渐增强，三个时间段均为显著性差异（与空白组对比）；100mg/kgug/L高浓度组的酶活，在暴露7天无显著性差异，到第14天显著抑制，到30天酶活又无显著性差异。图3-3不同剂量的SWCNTs暴露不同天数后肝脏CAT酶活性的变化图3-3不同浓度的诺氟沙星暴露不同天数后肝脏CAT酶活性的变化3.2 讨论对于生物而言，能够消耗自由基的酶是必不可少的SOD是生物体内唯一一种以自由基为底物的抗氧化酶(林庆斌等2006)1523，该抗氧化酶该酶通过催化超氧阴离子(O2-)发生歧化反应，产生过
47、氧化氢(H2O2)和氧(O2)，平衡体内的氧自由基，可以维持自由基在一个相对平稳的状态，SOD酶对于大部分动植物都是非常重要的，可以用于保护暴露于氧气中的细胞16-17。该酶广泛存在于各类动物、植物、微生物中，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞24-25。CAT则是以水解H2O2为原料，进行水解反应，能使生物体内H2O2和O2CAT维保持在一个相对平衡的状态，过氧化物就无法入侵体内进而保护细胞免受过氧化物的毒害，生物进行不断的进化，该酶在进化过程中起到关键性作用是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一1826。上述两个指标交替发挥清除机体内氧自由基的作用以上两个指标可以相互交替清理体内的氧自由基，自由基是非常不稳定的，有很大的可能会被外来物质打破平衡，氧自由基的动态平衡可能随时遭到破坏，当如果持续受到氧化胁迫，SOD酶消耗自由基的速度赶不上自