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1、原创性声明本人声明所呈交的本科毕业论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明。签名：_ 日期：_关于论文使用授权的说明本人完全了解宁德师范学院有关保留、使用毕业论文的规定，即：宁德师范学院有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；宁德师范学院可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。（保密的论文在解密后应遵守此规定）签名：_ 导师签名：_ 日期：_摘 要本文以单壁碳纳米管(SWCNTs)为
2、研究对象，锦鲫为受试对象，采用实验室半静态染毒方法，分析暴露在不同浓度(10g/L、100g/L、1000g/L)的单壁碳纳米管溶液在7、14、21、28天后鱼体肝脏内蛋白浓度、SOD活性和CAT活性等指标，探讨其潜在的致毒机制。实验结果表明，与空白组对比，SWCNTs高低浓度对蛋白质含量没有显著性影响；在实验前期，实验浓度为10ug/L的SWCNTs没有明显的影响到CAT活性和SOD活性，但是随着时间的增加，在28天后对CAT、SOD活性都出现抑制现象；100ug/L的SWCNTs除了在暴露第7天SOD活性和暴露14天CAT活性受到轻微诱导外，其他时候的酶活性都受到不同程度的抑制；随着浓度和
3、染毒暴露时间的增加，1000ug/L高浓度组的SOD活性均受到抑制，肝脏也有不同程度的损伤，CAT活性也受到抑制，而且染毒时间越长，效果越明显。关键词：锦鲫；SOD；CAT；单壁碳纳米管Abstract The potential toxicogenic mechanism of single-walled carbon nanotube solution exposed to different concentrations (10g/L、100g/L、1000g/L) after 7,14,21 and 28 days in the liver of fish was investigat
4、ed by using the laboratory semi-static method using single-walled carbon nanotube (SWCNTs) as the subject. Compared with the blank group, the SWCNTs concentration had no significant effect on protein content. Prior to the experiment, the SWCNTs with 10 ug/L did not significantly affect the CAT activ
5、ity and SOD activity, but with the increase of time, the inhibition of CAT、SOD activity appeared after 28 days.The SWCNTs activity of 100 ug/L was inhibited to varying degrees except SOD slight induction on day 7 and 14. With the increase of concentration and exposure time, the SOD activity of 1000
6、ug/L high concentration group was inhibited, and the liver was damaged to varying degrees, and the CAT activity was also inhibited, and the longer the exposure time was, the more obvious the effect was.Keywords：carassiusauratus;SOD;CAT;single walled carbon nanotubes;目 录1 引言11.1 碳纳米管的概述11.2 碳纳米管的性能及应
7、用11.2.1 电学性能11.2.2 力学性能11.2.3 热学性能21.2.4 光学性能21.2.5 碳纳米管在锂离子电池中的应用21.3 SWCNTs在水体的环境行为31.4 SWCNTs的致毒原理学研究31.5 抗氧化剂的防御检测系统在各种生物化学标志物的应用研究41.5.1 生物体的活性氧及其致毒机制41.5.2抗氧化防御系统51.6 研究目的及意义52 实验部分52.1 实验仪器与试剂62.2 实验步骤62.2.1 锦鲫的驯养62.2.2 单壁碳纳米管的超声分散62.2.3 染毒实验72.2.4 取样和制备样品72.2.5 总蛋白测定72.2.6 SOD活性测定72.2.7 CAT活
8、性测定83 结果与讨论83.1 结果分析83.1.1 SWCNTs对锦鲫肝脏内的蛋白质浓度的影响83.1.2 SWCNTs对锦鲫肝脏中的SOD酶活性的影响93.1.3 SWCNTs对锦鲫肝脏中的CAT酶活性的影响103.2 讨论124 结论145 展望14参考文献16致谢17单壁碳纳米管对锦鲫的环境健康风险评价1 引言1.1 碳纳米管的概述单壁碳纳米管(carbonnanotubes,cnts),也叫巴基管,它的分子结构比较独特，近几年，在力学方面兴起，是一种很好的力学材料。表面看起来像管状，两边都有密封口，沿着直径方向的长度值是纳米级别的，垂直于直径方向的长度值则用百万微米马克量级来表示。C
9、NTs主要由一条呈六个四边形横向排列的六个碳原子连接构成的有数层大小到数十层的轴向同轴螺旋圆管。碳固体纳米材料管体结构作为一维的新型碳固体纳米材料,重量轻,六个四边形状的管体成型结构而且两端连接完美,具有许多异常的性能，比如在化学、物理、电学、力学等方面，都被很好的利用。在近几年CNTs的运用范围也越来越高，利用碳纳米管特殊的性质可以解决现实生活中很多问题，使得碳纳米管和其他一些纳米材料的市场前景也不断地将其充分展现和实现了展示出来，被运用到各个领域。但是每样东西的投入使用都有利有弊，经过调查研究发现碳纳米管对水生生物的生长也有一定的危害性，在进入水体后，可能对水体环境会产生长期危害。1.2
10、碳纳米管的性能及应用1.2.1 电学性能sp2杂化的每一个正价碳原子都必须拥有一个未与键成对的正价电子使它垂直于晶体片层的一个电子轨道上,这也就赋予了这种碳纳米管优良的化学导电杂化性能。碳纳米管最大时的承载电流密度最高能够可达到109acm-2,是普通铜的最大导电性的1000倍。可将其直接用作极细小的充电导线,典型的实际应用景是目前在各种锂离子燃料电池中将其作为一种导电剂广泛使用。半导的活性碳纳米管在高端微电子集成设备制造领域将具有更广阔更长远的市场应用。1.2.2 力学性能sp2杂化的c-c金属键它是目前世界化学研究领域中已知的最强的几种化学金属键之一,碳纳米管的横向屈服能力强度在几百gpa
11、量级,杨氏模量在 TPa 量级,远远要高于防弹衣用的碳纤维、耐用碳纤维和其他钢材。所以在以后有望能够彻底替代传统碳纤维材料成为新型的高强度复合材料。1.2.3 热学性能碳纳米管是目前室温下声子导热控制性能最高的导热材料，它轴向的散热导热功率很高，最高可以达到6600W/(m K),再加上它在声子导热控制系统的平均声子自由程比较大，所以被认为是目前自然界中已知所有的导热材料中热学性能最高的,也是目前电子散热设备中高效的声子散热控制材料，是金刚石的3倍以上。1.2.4 光学性能一方面，碳纳米管电子波矢在光学性能上两个环向被量子化,因为之间存在着较多的范霍夫奇点,所以这种光学电子吸收峰很多而且强烈；
12、另一方面由于碳纳米管的波矢量在两个轴向上连续,所以电子和声子间容易同时发生散射,这两种光学特性相结合从而形成了这种碳纳米管的特别的电子光学吸收性能。高能量的反射光子在进入到反射后转变成一个低能量的反射光子,使用的碳纳米管可以产生光发生反射现象，同时它还具有通过电致驱动发光灯的现象。在碳纳米管中,将这种碳纤维纳米型灯管制作成功率为15w的节能灯管时,光强可以达到10000cd/m2,寿命延长可能会达到10000h。1.2.5 碳纳米管在锂离子电池中的应用因为这种碳纳米管材料具有102104的最小长径伸缩比、导电率和性能优异,所以目前主要广泛用于制造锂离子燃料电池及其正极端的导电导体材料。碳纳米管
13、技术可以在活性炭黑物质之间连接形成优异的新型长程分子导电传输网络,从而提高各种电子元件运输时的效率,可以有效替代目前传统的活性炭黑作为导电剂,从而减少化学添加剂用量,提高铅酸电池中的能量聚集密度,改善铅酸电池的分子电化学性能。在锂离子燃料电池的产品商业化研发应用领域方面,我们有限公司已成功率先进入韩国三星的ssdi、国轩高科、比亚迪、比克、卓能、天劲等在国内外大家熟悉的锂离子燃料电池研发生产制造企业的电池供应链管理系统,产品质量、性能等均得到广大客户一致认可。除此之外,碳纳米管因为其优异的绝缘导电性从而在各种抗氧化静电弹性涂料、导电高分子、橡胶、导电弹性塑料等的母粒中广泛应用,碳纳米管每个轴向
14、的绝缘抗拉伸性强度几乎是普通钢铁的100倍,而它的重量几乎只有普通钢的16.67%,因此它还可以被应用在其他聚合物材料基体中比如形成弹性增强型的复合材料等等。1.3 SWCNTs在水体的环境行为一方面，因为SWCNTs重量轻，所以可以扩散在空气中而被接触的动物体所吸收，另一方面，几乎所有的SWCNTs都会经过各种方式各种途径最终进入水体中而影响水体中各种生物或产生其他污染物。因为SWCNTs几乎会影响到地球上的大部分生物，所以就有必要研究SWCNTs所产生的环境风险影响。虽然在水体环境中SWCNTs的溶解度非常小，且并不容易发生聚集现象并飘散在水体。但是，在固定的条件下，SWCNTs也可以相对
15、稳定地在水体中悬浮，如溶液的离子强度、表面活性剂和溶解性有机质等因素1。一方面，研究发现，阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂以及非离子表面性剂溶液都可以使碳纳米管在溶液中稳定悬浮。表面活性剂可以通过增大碳结构表面积使得碳纳米管在水溶液中更易分散。于晓东2研究表明表面活性剂对CNT在水溶液的悬浮性能够产生显著影响，且按对CNT悬浮效果好坏顺序为阳离子表面活性剂阴离子表面活性剂非离子表面活性剂。曹建明3研究发现阴阳离子复配对碳纳米管在水溶液的分散的稳定性效果最好。另一方面，水体中离子的存在会对SWCNTs的聚集和分散产生影响。研究表明，经切割以及酸处理后的SWCNTs能够形成稳定的胶体溶液，且随着
16、溶液浓度的增大，也会发生聚集作用4。从溶解性有机质方面来讲，碳纳米管能够与水环境中的溶解性有机分子结合，从而提高其在水溶液中的分散能力和稳定性能。梁跃等5发现，天然有机质能使MWCNTs稳定悬浮，且随着浓度的增加MWCNTs在溶液中的稳定性逐渐增强。1.4 SWCNTs的致毒原理学研究综合国内外对碳纳米管进行的各种体内和体外毒理实验的研究报道发现，碳纳米管材料会对器官，组织和细胞产生损伤，并引起生物毒理学效应，如疾病甚至有机体死亡6。HYUNG等7-8的研究表明，碳纳米管进入水环境后，能够与水体中的溶解性有机质结合从而提高其在水中的分散能力和稳定性，极有可能会对水生物造成危害。关于纳米尺寸的超
17、细颗粒物的损伤或毒理机制有许多假设，但有一个共同的机制，即：氧化应激9。贾光等10研究发现，SWCNTs和MWCNTs对细胞的抑制率分别为20%和15%，说明SWCNTs具有较强的毒性且毒性效应大于MWCNTs。唐志扬等11将斑马鱼置于不同浓度的单壁碳纳米管悬浊液中暴露28天，结果表明，单壁碳纳米管对斑马鱼肝、腮、脑组织中GSH和SOD活性没有产生显著影响，但能使Na+-K+-ATPase活性显著升高。Sharma等12研究发现，SWCNTs对老鼠肺上皮细胞产生毒性效应，并能够导致ROS的增加，使谷胱甘肽含量降低及SOD活性受到抑制，从而造成氧化损伤。Yang等13把SWCNTs对小鼠的主要器
18、官如肺、肝和脾等进行静脉注射，也得到氧化损伤的结果。到目前为止，SWCNTs的毒性研究仍然较少，而且研究之间所得的毒性结论还存在部分争议。因此，SWCNTs的毒性效应有待深入研究。1.5 抗氧化剂的防御检测系统在各种生物化学标志物的应用研究目前许多有关生物毒理学基础研究的相关报道都没有提及到抗氧化剂和防御免疫系统已经可以作为研究生态生物毒理的重要研究指标。鱼类长期暴露在各种污染物下,在其体内的各种抗氧化剂和防御胁迫系统的各种相应有害物质有可能会间接发生血压升高或浓度降低,会对损害机体细胞进行各种抗氧化防御胁迫而直接造成机体损伤。生物体内各种抗氧化应激酶活性的长期变化研究能够为大气污染物对人类机
19、体形成胁迫时所产生的各种氧化应激作用提供科学参考。1.5.1 生物体的活性氧及其致毒机制活性氧(ROS)碳基是一个指其中含有一个氧和碳原子的自由基。辐射、紫外线和其他外源性化学物质的相互干扰也会导致活性碳和氧的大量生成。正常实际情况,生物的有机体需要保持一个ROSS的生成与OS消除的一种动态平衡。当机体细胞受到各种外源性有害物质的严重胁迫,动态平衡就被彻底打破，ROS大量物质累积速度增加,就可能会对整个机体的正常组织细胞功能造成严重损伤,引发影响机体各种疾病症的产生。为了有效抵抗这些污染物质所产生的活性和含氧的各种氧化应激胁迫,生物体就要学会不断产生各种氧化应激。氧化应激通常是由两个ROS键的
20、产生所反应引起的一种具有损伤性的结果。氧化应激对影响机体机能造成的各种氧化功能损伤也就需要充分运用有效抗氧化剂和防御免疫系统的有效防御氧化功能作用来有效应对。有关的研究结果表明,生物体内对ROS的氧化产生及其作用造成的酸性氧化物和损伤等都是可能导致空气污染物发生致命中毒的重要组成原因。1.5.2抗氧化防御系统抗氧化剂的防御反应系统主要是指人类能对各种环境污染及其胁迫因素做出快速抵抗响应的一种各类物质的系统总称,在有效维持R和ROS间的代谢平衡状态方面对其起着重要关键作用。它由具有抗氧化性的酶类化学物质以及其他具有较强抗氧化性的非抗氧酶类化学物质共同组成。抗氧化复合酶由活性超级过氧化物歧化酶(S
21、OD)、过氧化氢酶(CAT)和活性谷胱甘肽降解过氧化物酶(GPX),谷胱甘肽转硫酶(GST)等辅酶构成。其中,SOD酶和磷酸TC酶率先对目前机体细胞产生光合作用,最先能够参与两个ROS的分解消除,SOD酶最后能够将两个超氧阴性阳离子自由基(O2-)通过歧化合并分解而成为H2O2和O2,以有效维持目前机体的正常抗氧化力和代谢平衡。而CAT酶可以作为主要催化剂,继续将SOD酶分解生成的产物H2O2分解成新的H2O和O2,能够有效消除体内过氧化氢对术后组织细胞膜的毒性抑制作用,维持术后机体正常新陈代谢。GPX酶和GST酶可被作为人体抗氧化剂和防御免疫系统第二道致命防线,GPX也同样可通过利用H2O2
22、将一种还原型谷胱甘肽完全氧化,同时还原酶能有效消除体内过氧化物和脂质。GST结合酶在所有人类生物体中无处不在,可以有效催化化学污染物与分子GSH的相互结合并同时防止与所有生物大多数分子的共价元素结合,从而大大降低其化学毒性。本文主要通过研究阐明SWCNTs对人类生物体内各种SOD酶和CAT酶活性的直接影响。1.6 研究目的及意义本研究实验结果通过深入研究利用单壁绿色碳纳米管对小型锦鲫的肺和肝脏细胞中超级过氧化物歧化酶和肝脏过氧化氢降解酶活性的变化影响,从而研究评价利用单壁绿色碳纳米管对小型锦鲫的生物毒性作用效应及锦鲫酶类体系的毒性响应,为研究评价利用单壁绿色碳纳米管对各类水生动物,尤其特别是小
23、型鱼类的生物毒性效应影响和潜在鱼类生态环境风险影响提供了重要基础科学数据,并且可以为单壁绿色碳纳米管的生物毒理学应用研究发展提供重要参考。2 实验部分2.1 实验仪器与试剂实验中所用的超声破碎仪是采购于江苏省苏州市昆山市的超声仪器有限公司用来鉴定的紫外可见分光光度计(Unico UV2000 spectrometry)是采购于上海市的美国贝克曼库尔特公司用来分离锦鲫内脏的高速低温冷冻离心机（Allegra64R）是采购于南京建成生物工程研究所用来测定锦鲫的组织蛋白含量、SOD、CAT酶活性的试剂盒是采购于深圳市纳米港有限公司单壁碳纳米管，纯度95%，长度616m，直径5mg.L-1、水温222
24、C。我们严格的在实验室条件下喂养养锦鲫至少半个月以上，每天定量定时投饵一次，并保持供氧，保证水中的氧气充足。用来实验的鱼必须保证没有明显的疾病，一经发现有鱼感染或死亡，应马上做出相应的处理，以免细菌扩散而造成其他健康的鱼感染。2.2.2 单壁碳纳米管的超声分散第一，准确称量100mgSWCNTs于1L干净的烧杯中，然后加入1L超纯水。第二，小心的将超声破碎仪探头插入实验所用的SWCNTs溶液中，然后缓慢的调节烧杯的底座高度升高至探头末端距离烧杯得底部大约2cm左右，再调节超声功率约75W，设置超声时间为3s，间歇时间为3s。对超声分散时间进行预试验，最后发现经过10h超声破碎可以得到浓度高达1
25、00mg/L的SWCNTs稳定分散液母液，该溶液静置一个月没有出现明显沉淀。2.2.3 染毒实验在暴露实验中采用半静态染毒接触法，在实验操作过程中设立4个实验组：一个空白对照组以及3个SWCNTs不同浓度组(SWCNTs浓度分别为10ug/L、100ug/L和1000ug/L)。选取进食正常和行动活跃的健康锦鲫放入已经处理干的鱼缸中，每个鱼缸中都放入15条锦鲫，再加曝气水至30L(事先每个鱼缸都标记水位高度)，保证密度为2L水/条鱼。在暴露实验的期间，每天准时喂食，喂食约0.05g/鱼。喂食过后，捞起未食用的饲料，然后换水。为了保证每个鱼缸的暴露浓度尽量保持在相同的水平，换水时先把水放到剩下一
26、半，再加入一定体积事先配置好的SWCNTs母液和水。其中，SWCNTs母液浓度为100mg/L。2.2.4 取样和制备样品将锦鲫暴露7、14、21、28天后从每缸中取出五条大小相近、无明显病态的鱼样，首先将鱼样依次用自来水、蒸馏水冲洗干净，然后用滤纸吸干锦鲫表面残留的水分，最后用电子天平称量鱼体重量后迅速对其解剖，并将锦鲫的肝脏取出马上放至装有超纯水的表面皿中。肝脏经过漂洗后并用滤纸吸干其表面的水分子后称重，然后用甲醇擦拭过的锡箔纸打包好，放入透明的封口袋中，并做好标记，最后将其置于温度约-80C的冰柜中保存，冷冻干燥后等待检测。制取样品的上清液：首先从冰柜中小心的取出低温保存的锦鲫肝脏样品，
27、并用滤纸吸干其表面的水后马上称重。然后加入质量体积比为1：9的冷生理盐水，使用匀浆器将其均匀的搅和后，把匀浆后的混合物放于冷冻离心机上并执行15min。取其上清液，分别测定肝脏中酶活性和蛋白质含量并且必须在4h内检测完毕。2.2.5 总蛋白测定测蛋白含量用牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白对其进行测定，这个方法是根据liying文章的分光光度法来测定。2.2.6 SOD活性测定采用南京建成生物工程研究所运用的同种试剂盒来测定SOD活性相关生化参数。在检测的过程是根据Flohe和Otting(1984)所描述的方法，SOD活性根据冯明宝17等提出的方法来测定。首先根据吸光度所产生的变化情况，然后
28、就可确定被测样品的SOD活性，最后通过计算公式，就可以得出所被测样品中的SOD活性。SOD活力定义：每mg组织蛋白在1mL反应液中，抑制率达百分之五十时所对应的SOD量为一个活力单位(U)。2.2.7 CAT活性测定采用试剂盒测定CAT活性相关生化参数。测定过程遵循Goth描述的方法。先是根据吸光度的变化情况，然后再计算出CAT的活力。CAT活力定义：每mg组织蛋白每秒分解1mol的H2O2的量作为一个活力单位(U)。3 结果与讨论3.1 结果分析3.1.1 SWCNTs对锦鲫肝脏内的蛋白质浓度的影响表3-1 不同剂量的SWCNTs暴露不同天数后肝脏蛋白质浓度的变化暴露时间/天暴露浓度0ug/
29、L10ug/L100ug/L1000ug/l71.424920.313931.190870.168611.349180.254011.636550.14544141.246780.346221.158530.204731.332910.347281.176140.23077211.294030.645941.150250.262071.263910.242491.103960.29945281.338210.120831.222620.194741.335320.232371.1670.32375单壁碳纳米管对锦鲫的肝脏蛋白质浓度的影响如图3-1所示。将暴露不同天数的10ug/L、100ug/
30、L和1000ug/L三个浓度组分别与空白组相比，随着暴露时间和暴露的浓度增加，蛋白质浓度并没有明显的变化。只有在10ug/L的条件下蛋白质浓度均降低，但都未照成显著的差异。总体上在不同暴露时间和不同浓度组间蛋白质浓度均无显著性差异，说明SWCNTs对蛋白质浓度无明显影响。图3-1不同剂量的SWCNTs暴露不同天数后肝脏蛋白质浓度的变化3.1.2 SWCNTs对锦鲫肝脏中的SOD酶活性的影响表3-2不同剂量的SWCNTs暴露不同天数后肝脏SOD酶活性的变化暴露时间/天暴露浓度0ug/L10ug/L100ug/L1000ug/l758.161528.1874156.441542.1570667.0
31、99247.6425141.795413.098181461.70628.0158448.787675.7849750.211278.7032549.184967.938282161.841389.2243366.953387.910541.051536.5100538.649535.011222863.845653.4890744.221245.3967433.037554.5833632.463355.28219单壁碳纳米管对锦鲫抗氧化酶SOD的影响如图3-2所示。染毒7天后10ug/L和100ug/L浓度组的SOD酶活性与空白组相比无明显差异，在100ug/L浓度组条件下SOD活性有稍微
32、的增加，其诱导率为15.37%。1000ug/L浓度组SOD酶活有明显的降低，出现了抑制情况，锦鲫肝脏受到损伤，其抑制率为28.14%；暴露14天后，与空白组对比下三个浓度组的条件下SOD的活性都受到了抑制，锦鲫的肝脏受到不同程度的损伤，其各组(浓度由低到高）的抑制率为20.93%、18.68%、20.3%；暴露21天后，与空白组对比，10ug/L浓度组诱导酶活性轻微上升，说明受到了诱导，其诱导率为8.27%。而100ug/L和1000ug/L浓度组SOD酶明显受到抑制，其抑制率分别为3.62%、37.50%，在高浓度条件下锦鲫肝脏受到损伤，高低浓度组间存在显著性差异（P0.05）；暴露28天
33、后，高低浓度组的SOD酶活性都受到显著性抑制（P0.05），高低浓度组间酶活性存在显著性差异（P0.05）。总体来说，锦鲫在SWCNTs暴露28天后，与空白组相比：10ug/L低浓度组第7天SOD酶活与空白组基本相同，第14天开始明显的下降，至21天又开始上升为最高峰，到28天SOD酶活下降至低谷；100ug/L高浓度组的酶活，在暴露初期显著上升至最顶峰，而随着时间的推移，SOD酶活开始逐渐下降，至第28天达到最低。1000ug/L高浓度组SOD酶在第七天的时候显著降低，随后在第十四天时候出现轻微升高，但是仍然处于抑制的状态下，随后在21、28天持续降低。图3-2不同剂量的SWCNTs暴露不同
34、天数后肝脏SOD酶活性的变化3.1.3 SWCNTs对锦鲫肝脏中的CAT酶活性的影响表3-3 不同剂量的SWCNTs暴露不同天数后肝脏CAT酶活性的变化暴露时间/天暴露浓度0ug/L10ug/L100ug/L1000ug/l721.39132172.5477696225.248966991.34321635328.780114914.3210694724.337148163.8298395261422.870163233.36687876820.735519341.40371674932.465939543.20244491413.892790214.0765781362112.9755079
35、91.36483435330.579705296.31372826820.859644144.65023933815.652606852.3189283662825.16902332.81781911316.162470952.34778793718.403355813.1436239314.789268253.657459641单壁碳纳米管对锦鲫抗氧化酶CAT的影响如图3-3所示。染毒7天后，10ug/L低浓度组和1000ug/L高浓度组的CAT活性轻微上升，出现应激反应，产生抵抗能力，但是100ug/L浓度组的CAT活性出现明显的抑制，抑制率为18.03%，说明锦鲫肝脏受到了损伤；在暴露1
36、4天后，锦鲫肝脏的CAT酶活与对照组相比，10ug/L低浓度组与1000ug/L高浓度组对CAT酶活受到抑制，1000ug/L高浓度组抑制更加明显，而在100ug/L高浓度组的SOD酶活性呈现上升趋势，说明做出应激反应，出现了抵制能力；在暴露21天后，与空白组对照，10ug/L低浓度组对CAT酶活性出现了诱导现象，诱导率为35.78%。而100ug/L和1000ug/L高浓度组的CAT酶活受到明显的抑制，高低浓度组间存在显著性差异，抑制率分别是60.8%、20.6%；在暴露28天后，高低浓度组均对CAT酶活性产生明显的抑制作用，高低浓度组间酶活性无显著性差异，高低浓度组的抑制率分别是35.8%
37、、26.9%、41.2%。实验总体来说，锦鲫在SWCNTs暴露28天后，与空白组相比：10ug/L低浓度组第7天CAT酶活与空白组有稍微的上升，第14天开始下降，至21天又开始上升为最高峰，到28天CAT酶活下降至低谷；100ug/L高浓度组的酶活，在暴露第七天明显的下降，到第14天又受到诱导，产生的抵抗，出现了明显的上升，到第21天、28天CAT酶活又显著受到抑制；1000ug/L高浓度组在染毒第7天与空白对照组条件下出现了诱导现象，产生了抵抗能力，到第14天、21天和第28天下，均出现了明显的抑制，这个时候的锦鲫肝脏受到了损伤。图3-3不同剂量的SWCNTs暴露不同天数后肝脏CAT酶活性的
38、变化3.2 讨论碳纳米材料可以通过细胞的内吞作用、膜渗透作用、或通过载体蛋白和离子通道等运输到细胞内部18，然后产生毒性19,20。在合成历程中碳纳米管都会带有金属催化剂、无定形碳等杂质这是无法避免的，因此一定要对其进行纯化。碳纳米管的管壁之间具有较强的范德华作用，因此碳管正常都会以管束形式存在，其在溶剂中是很难分散，从而严重的影响了对其性质的研究。本实验中所用到的试剂都为纯试剂。在研究对颗粒物肺毒作用机制中，细胞在水平上最容易接触，因为肺上皮细胞是最主要靶细胞之一，所以研究碳纳米颗粒对肺泡上皮细胞的影响，对展望碳纳米管物质的肺毒性非常重要。本实验通过在室内模拟锦鲫生活条件研究单壁碳纳米管对锦
39、鲫的肝脏中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的影响，从而评价单壁碳纳米管对锦鲫的毒性效应及酶系的响应，为评价单壁碳纳米管对水生动物的毒性影响和潜在生态风险提供了基础数据。研究结果表明：对于10ug/L低浓度的实验组，刚开始的SOD酶活性、CAT酶活与空白组对比没有明显的差异，说明SWCNTs浓度较低，暴露时间短，活性氧自由基尚未大量生成，SOD、CAT活性维持在正常水平；随着染毒时间的增加，SOD酶活和CAT酶活均受到了抑制，且CAT酶的抑制较为明显,在暴露21天又逐渐恢复且超过空白对照组的酶活，之后随着时间的进一步推移又被抑制至最低值，这种现象与姚志峰21等的Cu2+对中华鲟抗氧化酶影响的研究结
40、论相一致。石洪玥22等认为10ug/L低浓度下的这种现象是由于起初机体对环境变化的不适应，体内活性氧自由基对酶产生损伤，而后又升高是因为机体产生应激反应，通过自身来调节抗氧化酶活性，抵御来自SWCNTs染毒物的威胁，随着ROS的大量积累，接着反过来消耗SOD和CAT导致酶活下降，并对机体产生损伤。在100ug/L浓度组条件，在锦鲫染毒第七天拿出来解剖的时，SOD酶受到了诱导，分泌了更多的SOD酶，出现应激反应，产生了抵御能力。随着时间的增加，肝脏出现了损伤，所以SOD酶减少，在第28天的时候到达低谷；这种酶活性先诱导后抑制的现象与抗氧化酶防御机制中“自适应阶段”和“抑制阶段”是相符合的。“自适
41、应阶段”的特点是受外源物质胁迫的机体为维持抗氧化代谢平衡而使酶活性略有上升。“抑制阶段”的特征在于抗氧化酶活显著下降，说明抗氧化酶系统对ROS的清除能力远小于ROS的累积水平。而CAT酶在第21天的时候产生了较强的抵御能力，CAT酶到达最高峰，随着时间的推移，逐渐减低，直至低谷。冯明宝23通过实验证明六个不同浓度组（0.40 mg/L、0.61 mg/L、0.64 mg/L、3.05 mg/L、3.22 mg/L、15.81 mg/L）的F-溶液下暴露不同天数对锦鲫肝脏抗氧化酶活性的影响，实验结果能与本实验结论找到相对应。王红蕾24等研究发现单壁碳纳米管暴露对小鼠肝脏和肺的抗氧化系统造成损伤。
42、在1000ug/L高浓度组条件，因为浓度太高，所以在锦鲫染毒之后的实验中，SOD酶均受到了抑制，随着时间的推移，抑制更加明显，说明锦鲫的肝脏受到了不可修复的损伤，已经严重的危害到锦鲫的生存。而CAT酶在第7天的时候产生应激反应，自身产生了抵御能力，所以在第7天的时候受到的诱导，分泌了更多的CAT酶。随着时间的增加，锦鲫的肝脏受到了损伤，CAT酶也受到了抑制，时间越长，抑制的越厉害，说明锦鲫的肝脏已经受到了较重的损伤。在SWCNTs的威胁迫使下，CAT酶和SOD酶作为自由基的天然清除剂，能够清除锦鲫肝脏体内过量的自由基，在一定程度上让生物体维持抗氧化代谢平衡，缓解或抵抗环境胁迫，但这种代谢平衡只
43、能在一定的条件范围起作用。随着暴露时间的增加和SWCNTs浓度的增多，活性氧慢慢的累积，开始攻击锦鲫肝脏细胞造成损伤，使得生物开始产生疾病。刘信勇25研究MWCNTs对斑马鱼的毒性效应，表明MWCNTs会对生物产生一定的毒性效应，且毒性效应与暴露浓度和暴露时间呈正相关。4 结论本论文针对SWCNTs进入环境后对锦鲫肝脏的损伤以及对肝脏抗氧化应激系统的影响。研究结论如下：（1）在SWCNTs的作用下，随着浓度的增加和暴露时间的推移，锦鲫肝脏蛋白质含量都没有明显性的增加或减少，说明SWCNTs对锦鲫肝脏的蛋白质含量影响不大。（2）SWCNTs导致锦鲫肝脏SOD活性几乎呈下降趋势，除了暴露第7天的1
44、00g/L高浓度组和暴露第21天的10g/L低浓度组的SOD活性受到轻微诱导外，锦鲫出现应激反应，其他的SOD酶活性均受到抑制，肝脏也有不同程度的损伤。（3）对于CAT活性来说，随着浓度的增加，染毒暴露时间的增加，虽然前期分泌更多CAT，出现应激反应，但是其诱导效果不明显；而后锦鲫肝脏的CAT活性也有受到不同程度的抑制作用，而且浓度越高抑制越明显，肝脏也受到损伤。这些体内表征的变化可证明SWCNTs能导致锦鲫肝脏的氧化损伤。因此，要判断污染物对鱼类的健康有没有影响可以根据体内SOD、CAT活性的变化来衡量。5 展望近几年来碳纳米管的运用范围越来越广，再加上它独特的性质，在各个领域都受到欢迎，但
45、是它也是有弊端的，CNTs非常轻，能够扩散到空气中，而且会吸附有害物质，容易被动物体吸入，还有就是大部分碳纳米管产品最终会进入水土环境与生物体及其他污染物间发生相互作用。因此，对于碳纳米管的水环境健康风险的研究就显得十分必要。到目前为止，关于CNTs的毒性研究仍然很少,尤其是对锦鲫的毒性效果还缺乏系统的报道。且有关实验探究方法存在不足，如碳纳米管分析方法少、暴露周期太短等。未来的科研探究可以往生物体内SWCNTs的有效浓度或者是更全面的探究SWCNTs对生物体抗氧化防御系统的抗氧化酶的影响。参 考 文 献1徐磊,段林,陈威. 碳纳米材料的环境行为及其对环境中污染物迁移归趋的影响J.应用生态学报
46、,20(1):205-212.2于晓东.碳纳米管的悬浮及其对抗生素类药物的吸附机理研究D山东:中国海洋大学环境科学与工程学院,2010.3曹建明.碳纳米管在水中的分散性J.广州化学,2005,30(3):12-17.4SanoM, OkamuraJ, ShinkaiS.Colloidal nature of single-walled carbonnanotubes in electrolytesolutionJ.Theschulze-hardyrule.Langmuir,2001,17:7172-7173.5梁跃,华祖林.环境因素对碳纳米管聚集迁移行为的影响J.化工新型材料,2016,44(3):113-115.6甘耀坤,李岩,杨旭.碳纳米管生物毒理作用的研究进展J.玉林师范学院学报,2006,27(5):116-121.7HYGNG H,FORTNER J D,HUGHLS J B,etal.Natural organic matter sta-bili-zes carbon namtubes in the aqueous phase J.Environ Sc