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1、原创性声明本人声明所呈交的本科毕业论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明。签名：_ 日期：_关于论文使用授权的说明本人完全了解宁德师范学院有关保留、使用毕业论文的规定，即：宁德师范学院有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；宁德师范学院可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。（保密的论文在解密后应遵守此规定）签名：_ 导师签名：_ 日期：_摘 要三氯卡班是一种新型的抗菌剂，因有连续
2、、温和、稳定的杀菌特点，被广泛应用于日常生活中。因其具有生物累积性而在环境中长期存在,本实验选择三氯卡班（Chemical class card，简称TCC)和锦鲫作为实验材料，在室内模拟条件下进行半静态染毒实验，研究低浓度10 mg/kg、高浓度100 mg/kg的三氯卡班对锦鲫肝脏抗氧化防御系统的影响。实验结果：在KP 10mg/kg时，锦鲫的SOD酶活性先抑制后诱导上升，CAT酶活性先抑制后诱导再抑制下降，这说明锦鲫的抗氧化防御系统损伤并不明显；在KP100mg/kg时，锦鲫SOD酶活性均受到诱导上升，CAT酶活性均受到抑制下降，这说明锦鲫的抗氧化损伤受到伤害。这说明更高浓度的KP或者更
3、长的暴露时间才会对锦鲫的SOD、CAT酶活性起到显著的诱导和抑制作用，但这些体内表征的变化都说明了三氯卡班能导致锦鲫肝脏的氧化损伤。关键词: 锦鲫；三氯卡班；抗氧化防御系统；SOD；CATAbstractTrichlorocarban is a new antibacterial agent, which is widely used in daily life because of its continuous, mild and stable sterilization characteristics. Because of its bioaccumulation and long-ter
4、m existence in the environment, the chemical class card (TCC) and Carassius auratus (Carassius auratus) were selected as experimental materials in this experiment. Under the indoor simulation conditions, the semi-static toxicity experiment was carried out to study the effects of low concentration of
5、 10 mg / kg and high concentration of 100 mg / kg of triclosan on the antioxidant defense system of Carassius auratus liver. Results: at KP 10mg / kg, the SOD activity of Carassius auratus was inhibited first and then induced to rise, while the cat activity was inhibited first and then induced to fa
6、ll, which indicated that the damage of antioxidant defense system of Carassius auratus was not obvious; at KP 100mg / kg, the SOD activity of Carassius auratus was induced to rise, and the cat activity was inhibited to fall, which indicated that the antioxidant damage of Carassius auratus was damage
7、d. This indicated that higher concentration of KP or longer exposure time could significantly induce and inhibit SOD and cat enzyme activities of Carassius auratus, but the changes of these in vivo characterization indicated that Trichlorocarban could cause oxidative damage of Carassius auratus live
8、r.Key words:Carassius auratus; Trichlorocarban; antioxidant defense system; SOD; CAT;目 录1 引言11.1 三氯卡班的理化性质11.2 三氯卡班在环境中的分布21.3 三氯卡班的毒性作用21.4 三氯卡班的研究进展31.5 锦鲫的抗氧化防御系统31.5.1 生物体的抗氧化防御系统31.5.2 抗氧化防御的机理41.6 本文研究的目的和意义42 实验部分52.1 实验仪器及试剂52.1.1 实验仪器52.1.2 实验试剂52.2 实验过程52.2.1 采样和样品预处理52.2.2 暴露实验52.2.3 总蛋白的
9、测定62.2.4 SOD 酶活性的测定62.2.5 CAT酶活性的测定62.2.6 数据统计分析63 实验结果73.1 蛋白质浓度的变化情况73.2 SOD酶活性的变化情况83.3 CAT酶活性的变化情况83.4 讨论104 结论115 展望11参考文献12致谢14三氯卡班对锦鲫的环境健康风险评价1 引 言由于居民生活质量的不断提高和工业的快速发展，环境中出现了越来越多的人工化学合成品。近几年来，个人护理用品（Pharmaceuticals and Personal Care Products，简称PPCPs）作为一种新型的外来化学物质带来的环境问题日益突出。PPCPs中的主要成分是三氯卡班，
10、因此，人们逐渐深入对三氯卡班的环境问题研究。三氯卡班是一种新型的抗菌剂，因有连续、温和、稳定的杀菌特点，被广泛应用于日常生活中，如纺织品、洗衣粉、除臭剂、皮肤护理品、牙膏和伤口消毒剂等类产品中。三氯卡班与传统的杀菌剂相比，其稳定性和相容性极好，没有异味，化学性质稳定。因其具有生物累积性而在环境中长期存在,本实验选择三氯卡班（Chemical class card，简称TCC)和锦鲫作为实验材料，在室内模拟条件下进行半静态染毒实验，研究低浓度10 mg/kg、高浓度100 mg/kg的三氯卡班对锦鲫肝脏抗氧化防御系统的影响。1.1 三氯卡班的理化性质三氯卡班（Chemical class car
11、d，简称TCC）又名N-(4-氯苯基)-N-(3,4-二氯苯基)脲，分子式为C13H9Cl3N2O，分子量为315.58，熔点为254-256，密度约为1530 KG/m，大部分呈白色微细粉末，无臭味，几乎不溶于水。图1-1三氯卡班化学结构式1.2 三氯卡班在环境中的分布 随着生活质量的不断提高，化学合成品的使用量也越来越大，在城市排水系统和剩余污泥中人们检测到了三氯卡班。研究发现，在城市污水处理系统中，只有21%的三氯卡班被降解，76%吸附于污泥中，3%则保留在出水中。由于三氯卡班的强亲脂性使得附着在底泥或固体等颗粒物中，其浓度可以达到mg/kg的级别。环境中的三氯卡班主要来源是城市污水处理
12、厂中的排水和剩余污泥的排放。除此之外，还有未经过任何污水处理的商业用水和居民用水，直接排入河流，最终汇入至海洋。1.3三氯卡班的毒性作用三氯卡班已污染环境长久，但人们一直没有引起重视，其主要原因是人们一直认为三氯卡班是有效的杀菌剂并且不会对生命造成危害，但是三氯卡班的化学结构同非甾体雌激素(如DES,双酚A等)相类似因此，人们才开始研究该类杀菌剂对环境造成的影响。经研究发现，三氯卡班的毒性会影响哺乳动物的生殖繁衍和幼体动物的发育。研究结果表示，三氯卡班会干扰细胞中睾酮的基因表达，容易造成前列腺异常增大、癌症、生殖功能障碍和发育异常等疾病。水生生物同样也受到三氯卡班的毒性影响。研究三氯卡班对裸藻
13、的形态及繁殖状况的实验中发现低浓度下的三氯卡班时，裸藻的细胞形状没有直接受到影响，但是其叶绿体形态发生了改变；而当三氯卡班的浓度升高时，就会直接影响裸藻结合孢子的数量，影响其有性生殖。将鱼群模拟在室内条件下进行半静态染毒实验，发现在低浓度的三氯卡班下，鱼群的表征性特征发生了变化，鱼群的鳍长发生了改变但并没有改变鱼群的雌雄比例，说明了三氯卡班对鱼类的内分泌产生了一定的干扰。三氯卡班的毒性研究从哺乳动物到水生生物，逐渐深入研究。三氯卡班不仅可以干扰基因表达、干扰内分泌系统，还有可能还会引发癌症、生殖功能障碍和发育异常等病症，成为重大的环境卫生问题。因此本论文对三氯卡班对锦鲤的毒性作用及机制展开系列
14、研究。 1.4 三氯卡班的研究进展研究人员通过对雄性老鼠喂食三氯卡班实验发现，三氯卡班会控制细胞中睾酮的基因表达，造成前列腺异常增大等缺陷。研究人员表示，内分泌干扰物普遍都是遏制或削减激素活动，但是三氯卡班会增加激素活动。达洁灵消毒剂中含三氯卡班和十烷基二甲基甜菜碱，提取了适量悬液做定量杀菌实验、稳定性检测与部分毒性试验。结果表明：三氯卡班有较好杀菌效果，稳定性好，基本无毒、与皮肤有较好的相容性。研究三氯卡班对土壤微生物酶活性的影响实验中发现，随着三氯卡班的浓度增大，土壤中细菌的酶活性有先诱导后抑制的作用，而且作用的时间较长。对于真菌，随着三氯卡班的浓度升高，均表现为诱导作用，但随时间的推移，
15、逐渐表现为先抑制后诱导的作用。对于土壤中蛋白酶和多酚氧化酶活性的研究发现，任何浓度的三氯卡班对其均有抑制作用，但对过氧化氢酶活性有先抑制后诱导的作用。1.5锦鲫的抗氧化防御系统1.5.1 生物体的抗氧化防御系统生物体体内本身就存在一套完整的抗氧化防御系统，当外部污染物进入生物体内时，他们会经历一系列的生物化学变化，并在相关酶的催化作用下，外部污染物被转化成其衍生物，这一过程称为生物转化，所产生的衍生物又称代谢物。生物在对体内的外源污染物进行生物转化时，会形成的中间代谢物，而中间代谢物往往伴随有大量的活性氧如O2-、H2O2和ROOH存在。在正常生理条件下，抗氧化防御系统能调节相关酶的分泌，通过
16、相关酶催化作用有效的清除生物体内产生的活性氧。如果抗氧化防御系统的清除能力跟不上生物体内活性氧的生成速率，大量活性氧在生物体内累计，当活性氧达到一定量后将引起生物体产生氧化应激，对机体造成氧化胁迫，从而对机体造成不可恢复性氧化损伤，使生物体产生中毒反应。抗氧化防御系统的第一道防线是抗氧化酶中的SOD、CAT，主要是去除体内自由基和增强身体抵抗力的作用；抗氧化防御系统的第二阶段是解毒酶GST、GSH-px，其除了能和SOD催化生成的过氧化氢反应，还能除去活性氧与脂质反应得到的脂质过氧化物，将其还原成无毒的醇类和水。而非酶物质，在抗氧化防御系统中通过抗氧化酶的催化与外源污染物代谢的物质结合，从而降
17、低污染物的生物毒性。1.5.2 抗氧化防御的机理抗氧化防御系统分为三步进行抗氧防御：第一步抗氧化防御是防止生物体体内生物转化时产生活性氧自由基，第二步抗氧化防御是依靠抗氧化性的酶类化学物质以及抗氧小分子对已产成的自由基进行清除，第三步抗氧化抗氧化防御是对已氧化损伤的分子进行修复或清除。生物体代谢产生大量活性氧自由基引起氧化应激时，SOD酶和CAT酶共同发挥作用可有效清除体内产生的自由基，维持机体正常的生理平衡。SOD、CAT是抗氧化防御系统的重要防线。其中SOD是水生生物抗氧化防御系统中抗氧化酶的重要组成之一，它能将氧自由基O-2催化从成H2O2，但其生成的H2O2和O2-反应生成有毒的羟基自
18、由基，因此由SOD催化产生的H2O2需要及时清除；而CAT主要催化H2O2转化为H2O和O2，可以降低H2O2的浓度，从而保护机体组织，维持机体细胞内环境的稳定。清除活性氧自由基的反应如下：O-2+2H+ H2O2 +O2 (SOD催化反应)H2O2 H2O +O2 (CAT催化反应)自由基是有氧生物所必需的，但是如果自由基的生成量过大，抗氧化防御系统的抗氧化清除能力不够，不能及时清除，从而受到抑制，长期下来就会导致抗氧化防御系统损伤，抗氧化能力下降。因此，抗氧化酶活性的变化成为鱼类的机体状况依据。1.6本论文研究目的和意义 在现如今，我们不当当要面对由于抗生素的滥用，使得生物耐药性增强，还需
19、要解决抗生素带来的潜在生态毒性。抗生素大多数的研究还是集中在藻类急性毒性和短期毒性，在鱼体上研究较少。这就需要增添这方面的研究数据，所以选取常见的锦鲫作为实验对象，研究在不同三氯卡班浓度下，锦鲫肝脏对脱氢酶的变化情况。通过观察到的变化，初步判断三氯卡班的毒性大小，也会后续的研究提供方向。实验主要通过判断蛋白质浓度、SOD酶活性、CAT酶活性的变化差异而得出结论。2 实验部分2.1 实验仪器及试剂2.1.1 实验仪器高效液相色谱质谱仪（HPLC-ESI-MS）、冷冻离心机 (Beckman,美国)、旋转切片机（L eica rM2015. Germany)、解剖剪、镊子及解剖刀；2.1.2 实验
20、试剂三氯卡班（TCC，纯度：100）购自于上海迈瑞尔化学技术有限公司；二甲苯溶液、福尔马林（国药集团试剂有限公司，上海）、SOD、CAT和蛋白质含量测定试剂盒（南京建成生物工程研究院，南京），实验中所用的试剂纯度均为100%。2.2 实验过程2.2.1采样和样品预处理锦鲫购于宁德市鱼市场，分别在暴露天数为7、14、30天采样，每组取3条锦鲫，捞取实验用鱼击昏后快速用滤纸吸干表面的水，放在天平上迅速称重，后进行解剖，取出鱼的肝脏，用锡箔纸包好，称重后放入冰箱冷藏备用。2.2.2暴露实验暴露实验是锦鲫模拟在室内条件下进行半静态染毒实验。将锦鲫随机分成若干实验组 ，分别设置三个浓度组(0mgkg-1
21、、10mgkg-1、100mgkg-1)进行单独暴露。光暗比设置为14h:10h,每条鱼喂食量约10 mg/d，一天喂食一次或喂食多次，每天记录鱼的体长和体重，每天及时清除食物残渣和粪便。采集样品时需捞出锦鲫、击晕锦鲫并放在称量盘上，迅速称重，并用仪器测量锦鲫体长和解剖锦鲫各器官，将鱼的腮及肝脏，使用0.9%的生理盐水冲洗干净后，迅速放入-100冰箱或液氮罐中保存备用，保证所取样品是鲜活的。测定样品时，先用滤纸吸干样品表面的水分，迅速称重并放入1：9（质量体积比)的冷生理盐水中，用电动匀浆器匀浆，接着在冷冻离心机上离心15min。离心结束取其上清液测量酶活性。2.2.3 总蛋白的测定总蛋白的测
22、定是根据Liying的方法测定，用考马斯亮蓝G-250作为染料，牛血清白蛋白作为标准蛋白，在游离状态下的G-250呈棕红色，当标准蛋白液或样品与显色剂反应时，溶液成蓝色。特定区间内的蛋白质含量与色素的结合物在595nm下的吸光度随光密度值的增大而增大，用测定的蛋白质含量校正酶的活性。提取适量酶提取液于试管中，滴加3ml考马斯亮蓝G-250染料进行染色，使其充分混合，10分钟后在595nm波长下测量其吸光度，同时用对照管（蒸馏水空白）的吸光度作校正。2.2.4 SOD酶活性的测定SOD酶活性的测定是根据Otting和Flohe（1984）文章中的方法，采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定相关生
23、化参数。其实验原理：黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的催化下生成超氧离子自由基，在氧化羟胺的作用下，形成亚硝酸盐。加入显色剂后，在550nm下用分光光度计测其吸光度，可观察到颜色变为淡紫红色。超氧离子具有专一抑制SOD酶的特点，当被测样品中含有SOD酶时，生成的亚硝酸盐量降低，直接导致吸光度减小。通过对比标准样品吸光度与所测样品之间的吸光度，推算出SOD酶的活性，单位为 U SOD/g蛋白质。通过实验中吸光度的变化，间接计算出SOD酶的活性，活力表达式为 U/mg protein。 SOD酶活性定义：每毫克组织蛋白在1mL反应液中，抑制率达50%时，所对应的SOD酶量为一个活力单位(U)。同时用对照管（蒸
24、馏水空白）的吸光度作校正。2.2.5 CAT酶活性的测定CAT酶活性的测定是利用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行批量化测定。采用钼酸铵比色法：在CAT酶的催化下H2O2分解成H2O和O2，CAT酶反应完后，剩余的H2O2 与钼酸铵反应生成淡黄色的络合物，使反应迅速得到平衡，然后用分光光度计测定其在405nm波长处的吸光度，间接可计算出CAT酶的活性，CAT活性表达式为U/mg protein。同时用对照管（蒸馏水空白）的吸光度作校正。2.2.6数据统计分析利用SPSS软件（Statistical Package for Social Sciences，ver.12.0，SPSS公司，芝加哥，
25、美国）进行实验过程中的数据处理和分析。用平均值标准误差（standard deviation，SD）的方式来表示实验数据。当P0.05可认为实验组与对照组之间有明显的差异；文中统计分析图均用Origin 10.1绘制。3 实验结果3.1 蛋白质浓度的变化情况观察图3-1看出，实验进行到7天时，10mg/kg浓度组对其蛋白浓度没有有明显的诱导现象，100mg/kg浓度组对其蛋白浓度没有有明显的抑制现象（P0.05）。第14天，10gL-1和100gL-1浓度组没有显著的抑制作用（P0.05）。第30天，浓度组还是存在抑制现象，但没有明显的差异性。表3-1 不同浓度的TCC在不同时间暴露下的蛋白质
26、浓度的变化暴露时间/天TCC暴露浓度Control10mg/kg100mg/kg71.441.451.16140.970.950.91301.161.071.01图3-1不同剂量三氯卡班暴露下蛋白质浓度变化3.2 SOD酶活性的变化情况观察图3-2看出，暴露实验进行到第7天时，10mg/kg浓度组对锦鲫肝脏SOD酶活性没有显著性抑制，100mg/kg浓度组对锦鲫肝脏SOD酶活性没有显著性诱导（P0.05）。实验进行到第14天时，10mg/kg浓度组对锦鲫肝脏SOD酶活性有显著性诱导，100mg/kg浓度组对锦鲫肝脏SOD酶活性有显著性诱导现象（P0.05）；在第30天时，10mg/kg、100
27、mg/kg浓度组SOD酶活性与对照组相比，仍有明显诱导现象（P0.05）；表3-2 不同浓度的TCC在不同时间暴露下的SOD酶活性的变化暴露时间/天TCC暴露浓度Control10mg/kg100mg/kg754.3349.3760.741464.4581.3579.433068.7683.3886.52图3-2：不同剂量三氯卡班暴露下SOD酶活性变化3.3CAT酶活性的变化情况观察图3-3看出，实验的第7天时，10mgkg-1浓度组CAT酶活性没有明显抑制现象，100mgkg-1浓度组CAT酶活性有明显的抑制现象（对比对照组）。这可能是高浓度组（100mgkg-1）鱼体未能产生大量的氧自由基
28、，导致CAT酶降低了合成量，使CAT酶表现出暂时的较低活性水平；在第14天时，低浓度组（10mgkg-1)开始出现上升现象，而高浓度组（100mgkg-1）CAT酶活性出现了抑制现象。对于低浓度组现象，可能是因为抗氧化防御系统中其他的抗氧化酶参与调节，使得CAT酶活性从刚开始被抑制的状态到轻微诱导现象。对于高浓度组，可能是鱼体产生过量的氧自由基，消耗掉大量CAT酶。使得其CAT酶活性呈现下降趋势；在第30天时，10mg/kg浓度组CAT酶活性与对照组相比，没有显著性抑制差异；100mg/kg浓度组CAT酶活性与对照组相比，有显著性抑制现象，这说明10mg/kg浓度的三氯卡班并不会对鱼体肝脏抗氧
29、化防御系统造成较大的损伤，鱼体还能通过自身的调节进行正常的生命活动。表3-3 不同浓度的TCC在不同时间暴露下的CAT酶活性的变化暴露时间/天TCC暴露浓度Control10mg/kg100mg/kg715.4415.2710.551421.5227.0716.813020.9719.0114.83图3-3：不同剂量三氯卡班暴露下肝脏CAT酶活力变化3.4讨论本实验研究目的是了解三氯卡班对锦鲫的毒性大小及机理，初步探讨三氯卡班对锦鲫肝脏的氧化应激系统损伤，为明确三氯卡班对水生生态系统的影响提供依据。总的来说，在暴露实验的早期阶段，肝脏抗氧化防御系统的SOD呈现诱导现象，CAT的酶活性呈现抑制现
30、象，其中SOD酶活性的诱导程度大。SOD 酶属于机体抗氧化防御系统的第一道防线，能对外部刺激迅速作出反应，CAT酶和GPX酶组成系统的第二道防线，参与机体的自我调节。相比SOD酶活性的变化幅度，CAT酶活性变化较小，其原因是由于其他抗氧化酶（如GPX酶）的参与消除过量的氧自由基，使得CAT酶活性变化程度较小，基本保持在正常的水平（对比对照组）。在实验进行到中期时，高浓度组SOD酶活性出现了短暂的显著性诱导，而低浓度组SOD酶活性出现了滞后，在实验后期呈现出了诱导趋势。卢彤岩等人通过观察暴露在不同浓度（20、50、100mg/kg）的达氟沙星的施氏鲟肝脏抗氧化系统抗氧化酶变化，发现高浓度组SOD
31、酶活性首先被诱导，而低浓度组SOD酶的诱导现象滞后表现。在暴露实验进行到后期，SOD和CAT酶活性基本恢复到正常水平（对比对照组）。孟文娜等研究发现不同浓度（0.05、0.01、0.1、0.5、1.0、5.0、10mg/L）土霉素暴露下，锦鲫肝脏抗氧化酶出现了不同程度的抑制和氧化损伤，在实验后期抗氧化酶活性都回升到对照组水平，得出了土霉素对抗氧化防御系统有轻微的氧化损伤，但不会有明显的毒害。吴志刚等在研究CPFX对锦鲫肝脏的氧化损伤时，也发现暴露实验期间，CPFX未能对抗氧化防御系统造成损伤。这与本实验结论相符。在三氯卡班暴露下，SOD和CAT酶活性呈一个连续性的变化，从抑制到诱导再到正常水平
32、，说明了机体的抗氧化防御系统处于一个动态平衡，通过自身抗氧化酶的调节消除过量的氧自由基，维持机体进行正常的生命活动，也说明了该实验浓度下的三氯卡班对锦鲫肝脏氧化损伤影响较小，这也与章强在三氯卡班与铜对小型鱼类的生态毒性研究中得出的结论相符。4结论本论文针对三氯卡班进入环境后锦鲫肝脏的损伤以及对肝脏抗氧化应激系统的影响。论文主要研究结论如下：（1）在实验期间SOD和CAT酶活性从抑制到诱导再到正常水平，处于一种连续动态变化中。高浓度组SOD酶活性出现了显著性诱导，说明鱼体对三氯卡班刺激作出了反应。（2）在本次暴露实验最后，SOD活性，CAT活性没有对三氯卡班表现出显著的抑制，所以今后还需要尝试改
33、变实验对象，从微生物、细胞等方面深入研究三氯卡班的生态毒性。5展望1.全面深入的探究三氯卡班对于生物体抗氧化防御系统的毒性效应。2.未来可以探究三氯卡班具体对哪个器官有损伤，在各器官的浓度大小。3.研究三氯卡班对生物体整个抗氧化防御系统抗氧化酶的影响。参 考 文 献1 Singer H, Muller S, Tixier C, et al. Triclosan: occurrence and fate of a widely usedbiocide in the aquatic environment: Field measurements in wastewater treatment pl
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