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1、摘 要为了研究中草药添加对大黄鱼Larimichthys crocea谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)基因表达的影响，本实验通过在大黄鱼基础饲料中添加太子参、党参、黄芪等中草药，各实验组中添加的中草药不同，喂养周期30天，30天后取样，采用实时荧光定量PCR方法，检测中草药添加对大黄鱼肾脏组织中GPx基因相对表达量的影响。结果表明，与对照组相比，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降（E5组除外），E3组的表达量下降最多（40%），其次是E2组（31%），E5组的表达量比对照组升高15%，但是各组间均无显著性差异（P0.05）。本研究结果为今后中草药添加在大黄鱼饲料中的应用提供了有价值的参考
2、数据，也为中草药作为鱼类抗氧化增强剂提供了前期研究基础。关键词：中草药添加剂；大黄鱼；谷胱甘肽过氧化物酶基因；基因表达Abstract In order to research the effect of Chinese herbal medicine addition on glutathione peroxidase (GPX) gene expression in Larimichthys crocea, by adding Radix Pseudostellariae, Codonopsis pilosula, Radix Astragali and other Chinese her
3、bs to the basic feed of Rhubarb, different Chinese herbs were added to each experimental group , and feeding it for 30 days. Real-time fluorescence quantitative PCR method was used to detect the effect of Chinese herbal medicine on the relative expression of GPx genes in the kidney of Rhubarb. From
4、the results, contrast with the control group, the expression of the gene decreased in different degrees in each experimental group (except E5 group), the most decreased expression in E3 group (40%), followed by E2 group (31%), and the expression in E5 group increased 15% contrast with the control gr
5、oup, but every two set of data are almost identical, math ematically speaking (P0.05) .The results of this study provide valuable data for the future application of chinese herbal medicine added to large yellow croaker feed, and also provide a preliminary research basis for chinese herbal medicine a
6、s an antioxidant enhancer for fish.Key words: Chinese herbal medicine additive; Larimichthyscrocea; Glutathione peroxidase gene; Gene expression 目 录1引 言1.1大黄鱼1.2谷胱甘肽过氧化物酶基因1.3中草药及太子参应用现状1.4研究的目的及意义2材料和方法2.1材料与试剂2.1.1材料2.1.2试剂2.2方法2.2.1总RNA的提取2.2.2 RNA凝胶电泳2.2.3 RNA定量分析2.2.4 RNA反转录2.2.5实时荧光定量PCR3实验结果及
7、分析3.1 RNA提取结果3.2熔解曲线分析3.3基因表达分析4讨 论致 谢参考文献 1 引 言1.1 大黄鱼大黄鱼（Larimichthys crocea）属于鲈鱼属，又称桂花黄鱼、黄金龙，大王鱼，主要分布在海南、东海以及黄海的南部。大黄鱼深受人们的喜爱，主要是因为其肉质极为鲜嫩，味道极为鲜美，而且还富含丰富的蛋白质等营养物质，对人体十分有益。因此，大黄鱼是我国主要的“四大海洋经济鱼类”之一，给我国带来了极为可观的经济收入。因此，有很多商家看到了大黄鱼带来的经济效益，对大黄鱼进行高密度的养殖，导致大黄鱼的疾病越来越严重，比如大黄鱼品质变差，病害频发，环境和水质的污染等，这些问题都给养殖产业带
8、来了巨大的经济损失，从而影响了产业的发展1。因此，寻找促进养殖动物生长、提高肌肉品质和增强抗病性的新型饲料添加剂已成为水产养殖业的发展新趋势。1.2 谷胱甘肽过氧化物酶基因谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPx)作为机体内“分解过氧化物的酶”之一，它的存在极为重要，是能够提高生物体的免疫力，减少因过氧化物过多而引起的危害。它的主要工作原理是催化有机过氧化物,通过降低过氧化物来达到机体的平衡。而它的产物是水或者酒精，这些产物还能够平衡机体的氧化还原的稳态，进行再次利用。GPXs家族成员主要分为两种，一种是不含硒谷胱甘肽过氧化物酶(GPx,non-SeGPx)，还
9、有一种是含硒谷胱甘肽过氧化物酶(GPx,SeGPx)2。而在哺乳动物中，GPxs家族成员还可以再分为8种不同的亚型(GPx1、GPx2、GPx3、GPx4、GPx5、GPx6、GPx7、GPx8），其中GPx1、GPx2、GPx3、GPx4及GPx6(人类)是硒蛋白。硒蛋白GPxs与细胞凋亡、生物体抗氧化、各种疾病的预防(如地方病、心血管疾病、癌症、神经系统疾病)、信号转导、动物繁殖等有关。但是目前研究还不够透彻，如GPxs与机体氧化还原密切相关，但各种GPxs作用的机理存在差异:GPx1能分解机体内的过氧化氢和一些氢过氧化物；GPx2作用的特异性底物还不是很明确，可能与GPx1相似，但更倾向
10、于亚油酸氢过氧化物；GPx3能利用的底物很泛，比如过氧化氢和叔丁基过氧化氢等；GPx4能催化过氧化氢，也对还未检测到的脂质氢过氧化物有催化作用。与其他基因不同的是，该基因在小鼠胚胎初期起着决定性作用，而且硒元素对GPx4在生物体的表达量没有影响，所以GPx4在生物体的存活发挥重要作用；GPx6目前只在人类中发现，其作用机制尚不明确3, 4。近年来，关于谷胱甘肽过氧化物酶在水产动物上作为抗氧化、抗应激和促生长添加剂应用较多。分别在吉富罗非鱼5、鲤鱼6、草鱼7上进行了系统的研究。研究了:(1)在水产动物的促生长方面，谷胱甘肽过氧化物酶对其的作用，并探讨促生长机理，研究发现谷胱甘肽过氧化物酶对机体的
11、生长有促进作用，主要是通过影响相关基因的mRNA表达量和提高组织中IGF-I和GH等激素水平来影响生长性能。(2)谷胱甘肽过氧化物酶在水产动物抗氧化功能方面的影响，研究结果发现谷胱甘肽过氧化酶基因通过提高机体抗氧化酶活性，阻止脂质过氧化，提高机体抗病抗逆能力。以上研究充分说明了在水产动物中，谷胱甘肽过氧化物酶基因能够起到抗氧化的作用。1.3 中草药及太子参应用现状中草药作为中药中的一种常见药物，从本质上讲，中草药具有毒性低、残留低等特点。中草药来源于自然，因此成本也较低，但缺点是运行时间较长，运行速度慢。在机体内发挥重要作用，主要有以下几方面：（1）抗应激作用。中草药如人参、地龙具有抗应激作用
12、，可以提高生物体的免疫力，黄芪等通过抑制肾上腺增生起到抗应激作用8。（2）提高机体抗细菌作用。中草药如大黄、黄芪和白芷等其有效成分对细菌的生长有抑制作用，从而可以提高机体的抗细菌能力。据报道，在杂交鳢饲料中添加一定剂量的中草药添加剂，能够提高机体抗细菌感染能力和肌肉品质，为杂交鳢的健康安全饲养提供了有价值的参考依据9。（3）增强免疫功能作用。中草药的有效成分（如多糖）对免疫系统有促进作用，能提高免疫细胞的活性。王芸10等将2%的黄芪等中草药的水提取物饵料饲喂凡纳滨对虾,并测定了血清中的PO、SOD等免疫因子的活性，研究结果为黄芪等中草药对凡纳滨对虾的生长和免疫功能有促进作用,是纳滨对虾的中草药
13、免疫调节剂。（4）促进机体生长作用。中草药中含有丰富的蛋白质等营养成分，这些成分可被生物体利用，达到促进生长的作用。刘红柏等11通过喂养鲤黄芩、板兰根、黄芪、茯苓及鱼腥草等，结果发现,饲料中添加这些中草药都能使鲤加快生长速度，但仅添加黄芩和黄芪都有相同作用。综上所述，用中草药饲料代替抗生素不仅可以解决水产动物的养殖中水质污染等问题，还可以提高其自身的抗应激和免疫等功能。太子参是由三萜皂苷和多糖等物质组成的活性物质，可以从石竹科植物孩儿参的干燥块根中提取得到，能够提高抗病力和免疫力、抗氧化、降血糖及抗疲劳等作用，也是生活中常用的一种中草药。太子参作为名贵的中草药其被认可的功效有：补气益脾，滋养津
14、液。太子参品质的高低取决于太子参根块的饱满程度、是否香味浓郁、还有就是含糖量的高低。研究证明，太子参能够调节免疫力、增强机体物质代谢、延缓衰老、抗病毒等方面具有重要作用12-13。主要发挥作用的化学成分有：（1）微量元素。太子参富含锌、铜、硒、铁等对生物体有益的微量元素；（2）氨基酸。太子参含有人体所需的8大氨基酸;（3）多糖类。具有抗疲劳、抗应激作用，刘训红14等以小鼠为研究对象，饲喂太子参多糖，通过实验观察小鼠机体免疫和抗疲劳方面的变化，结果表明，太子参多糖不仅增加了小鼠免疫器官的重量还对吞噬功能有激活作用，对抗疲劳和抗低温有明显作用。徐先祥15为了探讨太子参多糖对患有糖尿病的小鼠的抗氧化
15、能力，通过尾静脉注射C4H2N2O4，研究表明太子参多糖能够降低丙二醛含量、提高SOD的活力。结果表太子参多糖能提高抗氧化力。然而太子参作为饲料添加剂在大黄鱼中报道较少。1.4 研究的目的及意义随着社会的不断发展，水产养殖业养殖规模越来越大，由于抗生素及化学药物的滥用导致了诸多问题，如鱼类的抗药性增加、水质污染、药物残留等一系列环境问题。中草药是一种绿色高效的饲料添加剂，与抗生素相比，更加安全高效，且对鱼类不产生抗药性，是一种新兴的饲料添加剂。中草药在增强抗氧化应激、水产动物肌肉品质、提高免疫等功能发挥重要作用，也在调节生理代谢和防病治病方面具有显著优势。太子参作为水产动物饲料添加剂的应用己有
16、一些研究报道，但中草药复合添加剂在饲料中的应用研究报道较少。中草药添加对大黄鱼谷胱甘肽过氧化物酶的基因表达是否有影响需要通过试验研究进行评估。本研究在基础饲料中添加复方中草药饲喂大黄鱼，通过实时荧光定量PCR检测，借以讨论中草药添加对大黄鱼谷胱甘肽过氧化物酶基因表达的影响，以期为今后中草药添加在大黄鱼饲料中的应用提供有了参考。2材料和方法2.1材料与试剂2.1.1 材料本实验使用到的大黄鱼来源于宁德市鼎诚水产有限公司自行繁育的健康、规格一致，平均体长（23.450.83）cm，体质量（34.058.23）g的大黄鱼幼鱼。原料鱼共分六组饲养分别为：1、2、3、4、5、6（CK），养殖在1.5T养
17、殖桶中，养殖周期30天，实验组饲料中添加的太子参及其他中草药浓度见表2-1。每组设置1个平行组，每组100尾大黄鱼幼鱼。每天分2次投喂鱼体质量1%2%的饲料，视摄食情况酌情调整。养殖水体水温控制在2426之间，溶解氧大于5.0mg/L，pH值维持在8.0左右，氨氮小于0.2mg/L。常规养殖管理，做好养殖记录。30天以后，每组分别随机取三尾健康个体进行活体解剖采样，取脾脏组织保存于Trizol裂解液，-80超低温冰箱保存备用。表2-1实验鱼各组饲料用料组成Table2-1FeedMaterialCompositionofFishGroups组别组分用量（%）1太子参0.52太子参、党参、黄芪、
18、甘草、枸杞、巴戟天各0.167（总1.0）3太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天太子参0.5，其他各0.1（总1.0）4太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓各0.111（总1.0）5太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓、太子参0.5，其他各0.0625（总1.0）2.1.2试剂TB Green Premix Ex Taq（Perfect Real time）、rTaq DNA Polymerase、购自大连宝生物公司。dNTP购自大连宝生物公司。DNA Marker购自北京博迈德科技发展有限公司。引物由上海生工生物公司合成。Trizol试剂购自生工。2
19、.2 方法2.2.1总RNA的提取1、 研磨：取1.5mLEP管加入30-50 mg组织块加入装有1mL Trizol的离心管中，将离心管插在装有碎冰的烧杯上进行研磨，直至没有大块组织为止。2、 取上清液移入新的离心管中，再加入1/5体积氯仿混合摇匀，冰上静5 min，4、12000 g下离心15 min。3、 用合适的移液枪取上清，加入等量的预冷异丙醇（为了沉淀RNA），震荡混合，-20下静置20 min，温度4、转速同上离心10 min。取上清时需注意宁可少取也不要取到中层蛋白和下层基因组溶液，若取到则对后续RNA纯度品质造成污染。4、 研磨之后配平，放在冰上静置5 min，在4、1200
20、0 g条件下离心5 min。5、 将上清液弃去后取1 毫升75%乙醇对RNA沉淀进行洗涤，条件同上离心5 min后干燥（干燥需干燥至EP管壁无残留乙醇，若残留乙醇过多可以用灭菌过的枪头吸出，干燥至RNA沉淀由乳白转至渐透明之间，则干燥完全），加无核酸酶水20-30 L，于-80冰箱保存备用。2.2.2 RNA凝胶电泳1.制胶：称取4.8 g琼脂糖，加40 mL 10 X TAE，电炉加热溶解放凉加入2 L核酸染色剂，倒入制胶模具，待凝固成型。2.点样：将RNA样品与RNA缓冲液进行混合，将混好的RNA样品依次对孔点入相对应的胶孔中，设定程序121V，15 min，开始电泳。3.将电泳完成的胶用
21、凝胶成像设备观察，验证其完整性。2.2.3 RNA定量分析RNA样品用超微量分光光度(Thermo Scientific)测定样品在260和280nm的吸收值，记录RNA样品浓度OD值用于后续实验，本次实验测定出RNA OD均值所在范围，由数据得知RNA纯度较高可进行下一步实验。2.2.4RNA反转录以RNA样品为模板，按照Taraka反转录试剂盒PrimeScriptRT-PCRKit方法进行cDNA第一条链的合成。在冰上配制反应液，按照反应数+2的量配制MasterMix，反应总体系为10L。（如表2-2）。表2-2cDNA第一条链反转录试剂组成Table2-2 Composition c
22、DNA the first chain reverse transcriptionreagent试剂用量（L）Total RNA0.5-1.0Enzyme Max 10.5Oligo dT 0.55Buffer 2.0Random 6 mers 0.5RNase Free dHOUp to 102.2.5实时荧光定量PCR根据大黄鱼基因组数据库中的基因序列设计引物，以-actinrRNA为内参基因(引物序列表见2-3），使用TB Green Premix Ex TaqTM (Takara)试剂盒对基因进行相对荧光定量PCR检测，每个反应设2个重复。Real-time PCR反应体系见表2-4。
23、、表2-3实时荧光定量PCR引物Table 2-3 Primers used in real-time PCR analysis基因名称正向引物反向引物gene nameforward primerreverse primer谷胱甘肽过氧化物酶TGGCTGGAGGCGTGAAAAGAATAACGAGTCCCTTGGC-actinTCGTCGGTCGTCCCAGGCATATGGCGTGGGGCAGAGCGT表2-4实时荧光定量PCR反应体系Table2-4 The reaction of real-time fluorescent quantitative PCR试剂用量（L）TB Green
24、Premix Ex TaqTM (2)12.5PCR Forward Primer2RCR Reverse Primer2RT反应液（1:10稀释的cDNA溶液）2dHO8.5Total25实时荧光定量PCR反应条件：Stage1：95 预变性 5 min，1个循环Stage2：95 15s，60 45 s，40 个循环。PCR反应后分析熔解曲线。重复两次实验，取平均值进行分析。所有基因的相对表达量用2-Ct计算，所得数据用SPSS 19.0 （社会科学统计软件包）统计数据，然后采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）平均值的差异显著性（P0.05）。3实验结果及分析3.1RNA提取结
25、果通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测分析RNA的完整性和浓度。本实验得到的RNA，经过电泳以后，发现18s、28s条带清晰，无明显smear，说明RNA具有较高的完整性（图3-1）。RNA的OD值测定是检测RNA质量的重要指标，RNA的OD260/280在1.8-2.0之间，说明其质量较好，完整性较高，若比值大于2.2说明RNA存在降解，比值小于1.8则可能存在污染。本实验获得的的 OD260/280均值在1.7-2.1之间，（表3-1），说明提取的RNA纯度较好，达到后续实验标准。图3-1大黄鱼RNA凝胶电泳图（部分） Figure 3-1 Gel electrophoresis RNA l
26、arge yellow croaker表3-1RNA的定量结果Table3-1 The quality and quantity of RNA样品编号OD260/280浓度（g/L）样品编号OD260/280浓度（g/L）Ki-E1-11.810.87Ki-E4-12.091.80Ki-E1-22.101.64Ki-E4-22.121.50Ki-E1-32.061.30Ki-E4-32.101.02Ki-E2-11.911.41Ki-E5-11.931.40Ki-E2-22.051.24Ki-E5-22.031.33Ki-E2-32.031.41Ki-E5-32.031.21Ki-E3-12.
27、011.33Ki-C12.031.12Ki-E3-21.901.44Ki-C22.021.55Ki-E3-32.091.72Ki-C31.931.30注：Ki（Kidney）为肾脏,E为实验组C为对照组3.2 熔解曲线分析采用实时荧光定量PCR可以直观反映反应的非特异性扩增，将特异性引物进行熔解曲线分析，发现熔解曲线呈现单峰，说明引物特异性较好，定量结果准确。熔解曲线见图3-1。图3-2 谷胱甘肽过氧化酶物基因熔解曲线Figure3-2 The dissolutioncurve of glutathioneperoxidase3.3基因表达分析图3-3 中草药添加对大黄鱼肾脏组织中GPx 的相
28、对表达影响Figure3-3 EffectofChineseherbalmedicineadditiononGPxexpressioninkidneyofRhubarb中草药添加对大黄鱼肾脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx)的相对表达影响如图3-3，结果表明，与对照组相比，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降（E5组除外），E3组的表达量下降最多（40%），其次是E2组（31%），E5组的表达量比对照组升高15%，但是各组间均无显著性差异（P0.05）。4讨 论本论文通过在饲料中添加太子参等中草药饲喂大黄鱼，通过实时荧光定量PCR,分析中草药添加对大黄鱼谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）
29、基因表达的影响。谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）这种酶的含量高低在一定程度上反映了机体自身抗氧化能力的强弱。本实验在大黄鱼的基础饲料中添加太子参、党参、黄芪等中草药后，在肾脏组织中出现了不同程度的下降（除了E5组)，但是各组间均无显著性差异（P大于0.05）。许多研究表明中草药添加剂能有效的清除机体产生的多余自由基，促进机体内抗氧化酶的基因表达16。张振明17等通过用D-半乳糖造衰老小鼠模型, 用不同药量的太子参水提物灌胃受试药组衰老小鼠，观察其对衰老模型小鼠抗氧化系统的影响，结果表明，太子参水提物通过清除.OH, 提高GSH-Px活力而发挥抗氧化活性。林燕18等报道，在饲料中添加3%浓度鱼腥草等
30、中草药，饲喂草鱼幼鱼投喂3060d，对提高草鱼幼鱼的自身免疫力效果最佳。孙裔雷19等发现，复方中草药能够提高虹鳟脾和肾脏组织中GSH-Px活力，明显增强机体的抗氧化能力。刘逊20等也证明了中草药添加对GSH-Px活力有增强作用。本实验结果显示，大黄鱼在饲喂中草药后，谷胱甘肽过氧化物酶基因的表达发生变化，其中肾脏组织中GPx基因的表达除E5组表达升高以外，其他组的表达均呈现不同程度的下降，尤其是E3组（太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天），下降的最大。可能原因有，一是本实验做的是基因表达水平的研究，而基因的功能最终是要反应在蛋白质水平，也就是酶活水平，因此对于中草药的抗氧化活性的判定，不能采
31、用单一的评价方法进行抗氧化剂的筛选；二是本实验在基础饲料中添加了多种中草药，不是单一一种中草药，由于饲料中中草药的搭配比例不当和种类多样性的情况下，中草药之间产生了排斥作用，使部分酶活表达不显著，导致本实验的结果不理想。但是中草药在提高酶活力，增强机体抗氧化能力已得到证实。要想水产养殖业的健康发展就需要添加草药。虽然现在也有中草药作为饲料，但是还是发展不够，如何健康的使用中草药还需要我们做进一步的研究。随着现代科学技术的迅速发展,中草药添加剂不仅可以提高机体抗氧化和免疫，同时也可以当作营养物使用；成分较复杂，具有抗菌、抗感染多种功效。能从根本上解决化学类药物对鱼类药物残留的问题。因此,在当今社
32、会发展目标大前提下，中草药添加剂的开发与利用具有可观的发展前景。致 谢光阴荏苒，大学生活即将结束，四年的学习生活使我受益匪浅。经历大半年时间的磨砺，毕业论文终于完稿，回首大半年来收集、整理、思索、停滞、修改直至最终完成的过程，我得到了许多的关怀和帮助，现在要向她们表达我最诚挚的谢意。首先，我要深深感谢我的导师史晓丽老师。在学习中，老师从选题指导、论文框架到细节修改，都给予了细致的指导，提出了很多宝贵的意见与建议，老师以其严谨求实的治学态度、高度的敬业精神、兢兢业业、孜孜以求的工作作风和大胆创新的进取精神对我产生重要影响。她渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维给了我深深的启迪。借此机会，我谨向史老
33、师致以深深地谢意。其次，我还要感谢生命科学学院全体领导和老师，由于他们的悉心教导，我才能在这几年的学习过程中汲取专业知识和迅速提升能力；同时也感谢这四年来与我互勉互励的诸位同学，在各位同学的共同努力之下，我们始终拥有一个良好的生活环境和一个积极向上的学习氛围，能在这个有爱的大家庭中学习，是我的荣幸。我还要感谢我的家人，我的父母，他们给我极大的鼓励与朴素的帮助。最后，我要感谢参与我论文评审和答辩的各位老师，他们给了我一个审视几年来学习成果的机会，让我能够明确今后的发展方向，他们对我的帮助是一笔无价的财富。我将在今后的工作、学习中加倍努力，以期能够取得更多成果回报他们、回报社会。再次感谢他们，祝他
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