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1、第一章口引口朵类Co mbre tastainA4类似物的合成、活性与 构效关系的研究1.1 研究背景恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见疾病，它目前已成为我国居民的主 要死因。寻找有效的抗肿瘤药物与方法，彻底攻克癌症，是一项世界性的难题。虽然抗肿瘤药物的化学结构和作用机制是多种多样的，但是目前临床上常用 的抗肿瘤药物普遍存在对实体瘤疗效较差、毒副作用大以及容易产生多药耐药性 等诸多缺陷。因此发现高效低毒的新型抗肿瘤药物，仍是一项极其重要的研究课 题。微管蛋白抑制剂是目前临床上应用的一类非常重要的抗肿瘤药物。它作用于 细胞的微管蛋白，从而阻止细胞正常的有丝分裂。许多抗肿瘤药物都属于微管蛋 白抑
2、制剂。这些药物大部分都来源于天然产物，主要包括：秋水仙碱、喜树碱、长春碱、紫杉醇以及鬼臼毒素等I虽然微管蛋白抑制剂在临床应用上取得了巨大的成功，但是其对骨髓和血液 系统的毒性较大，从而限制了它的使用。除了具有抑制微管蛋白的作用，许多微 管蛋白抑制剂还能阻滞以及破坏血管2上现在普遍认为肿瘤的新生血管在肿瘤 的发生、发展与转移的过程中起着非常重要的作用5o肿瘤新生血管不同与正常 血管的特性使其成为新一代抗肿瘤药物作用的重要靶点6o当前有两类肿瘤血管 靶向药物：一、抑制新生血管生成的新生血管抑制剂，二、破坏已生成肿瘤血管 的肿瘤血管破坏剂7。肿瘤血管靶向药物尤其是肿瘤血管破坏剂与传统的抗肿瘤 药物相
3、比具有见效快、毒性小、不易产生耐药性以及具有防止肿瘤转移的特性等 诸多优点8。基于上述共识，近年来肿瘤血管破坏剂成为国际上一个很有潜力的研究热 点。1.2 Co mbre tastatin A-4及其类似物的研究进展二苯乙烯类化合物Co mbr etastain A-4(CA-4)于1989年首先由Pettit,G.R.从 南非灌木Combretum caffrum的树干中分离得到(图1T)。除此之外，Pettit,G.R.同时还分离得到了一系列CA-4的类似物，这些化合物被统称为Co mbr etastains.大量研究已证明CA-4作用(3微管蛋白的秋水仙碱位点。与紫杉醇相反，CA-4主
4、要阻止微管蛋白二聚体的聚合，使细胞阻滞在有丝分裂的G2/M期。体外与体内 实验表明，CA-4具有广谱的抗肿瘤活性，尤其是对许多耐紫杉醇肿瘤具有很好 的活性。更为重要的是，CA-4表现出了前所未有的破外肿瘤血管的能力。一般 来说，大多数微管蛋白抑制剂对肿瘤血管的作用仅发生在最大耐受剂量附近，然 而CA-4仅在十分之一最大耐受剂量时就能产生明显的作用9。图1-1 CA-4的结构CA-4的前药Co mbr etastatin A-4 Ph o sph ate(CA-4P)的 I 期临床实验于 1998年 和1999年分别在英国和美国开展，针对多种晚期恶性肿瘤均取得了令人十分满意 的结果匕CA-4P目
5、前正在进行m期临床实验。CA-4P具有同CA-4相同的作用机 理，它能够在几个小时内快速使肿瘤血管闭合,从而显著减少肿瘤血管的灌流量,继而使大量肿瘤细胞缺氧而坏死LCA-4P常见的副作用主要由心血管引起，有心跳过快、高血压和肿瘤部位的 疼痛等，但与传统的微管蛋白抑制剂紫杉醇和长春新碱相比，无神经系统损伤和 造血抑制等副作用41.2.1 Co mbr etastatin A-4及其类似物的作用机理CA-4作用于细胞p微管蛋白的秋水仙碱位点，从而阻止微管蛋白二聚体的聚 合，继而导致细胞阻滞在有丝分裂的G2/M期。与秋水仙碱相反巴CA-4与微 管蛋白的结合是可逆的，同时在体内具有更短的半衰期。与大多
6、数微管蛋白抑制 剂不同，CA-4仅在其十分之一最大耐受剂量时就能对肿瘤血管产生明显的作用，而大多数微管蛋白抑制剂对肿瘤血管的作用仅发生在其最大耐受剂量附近。CA-4的这种特性能够显著的降低它的毒性，有研究表明这与CA-4与微管蛋白 可逆性的结合以及在体内CA-4很短的半衰期有关15-16o虽然CA-4对肿瘤血管具体的作用机制尚不明了，但是一般认为与其对血管 内皮细胞靶向作用有关。由于某种尚未阐明的原因，CA-4对微管蛋白的作用特 异性激活了肿瘤血管内皮细胞的信号通路，导致部分肿瘤血管内皮细胞细胞形态 的改变以及血管内皮细胞细胞膜的皱缩，继而使得血管通透性增加。血管对血流 的阻力随之增加，继而使
7、得血流的速度下降。同时，血流的速度下降又容易导致 红细胞的堆积。除此之外，血管通透性的增加会导致大量血管内蛋白的流失，继 而产生强大的间质流体压力，最终导致血管的崩溃。血管的崩溃同时会增加红细 胞的堆积。血管通透性的增加同时也会导致血管内水分的流失，继而导致血管粘 度的增加。血管粘度的增加又会加速红细胞的堆积。血流速度下降、血管崩溃、红细胞的堆积以及血管粘度增加等几个因素相互影响，最终导致血管的闭合。1.2.2 Co mbr etastatin A-4及其类似物的构效关系的研究作为非常有前途的新一代抗癌药物，CA-4在近十年来受到了药物化学家的 极大关注，有许多CA-4的类似物被合成。CA-4
8、的构效关系也有许多的经验的 总结Bi1从结构看CA-4及其类似物可分为A环、B环以及连接两环的桥。从 二维构效关系来看（图1-2）,一般认为：A环的三个甲氧基是重要药效团；桥必 须保持顺式结构，且长度不宜超过三个原子；B环中对位甲氧基也是重要药效团,间位的羟基是可以进行改造的。由于与秋水仙碱对微管聚合的抑制有竞争性，CA-4被认为作用于秋水仙碱 位点。通过计算机模拟，Hamel等的假设模型认为，CA-4的A、B两环分 别与微管蛋白的a和0链上两个相离的位点作用。Nguyen等21根据分子模型方法 统计15种作用于秋水仙碱靶点的结构类似物，认为秋水仙碱靶点的体积约为10A X10AX4-5 A（
9、图1-3A、B）o此类化合物的三甲氧基基团嵌入微管蛋白P链中（图1-3C）,两个起药效的芳环成大约45夹角（图1-3D）。图1-3 Hamel的假设模型1.3 口引噪类CA-4类似物的设计通过文献调研，我们对CA-4及其主要类似物现有的构效关系有了初步的了 解。当前对CA-4的结构改造主要集中于CA-4的B环以及桥，对A环的改造比 较少。，一般认为三甲氧基苯环基团为重要的药效团，许多针对A环的改造都 降低了细胞毒活性223。近年来针对A环比较重要的改造（图1-4）主要有：（1）Li等25在1994 年参考金雀异黄酮的结构，用苯基唾诺酮来代替CA-4的A环设计出一系列化合 物。其中化合物la显示
10、了与CA-4相当地抑制微管蛋白聚合的能力，对一系列 癌细胞的半数抑制浓度达到了 nM级。（2）Bailly等26在2003年用芳基香豆素 来代替CA-4的A环，其中化合物1b对人白血病CEM细胞增生的半数抑制浓 度达到了 0.0083处4。（3）Ro ber ti等27在2003年去掉A环中间的甲氧基，其中 化合物1c对人白血病HL-6 0细胞的半数抑制浓度为0.03 rM。虽然这类化合物 的细胞毒活性降低了，但是其具有不同于CA-4的作用机制。（4）Liso ws ki等28 在2004年用嚷吩并毗咤环代替A环，设计并合成了一系列的化合物，其中化合 物Id对一系列癌细胞增生的半数抑制浓度达到
11、了 nM级。（5）Pr inz等在2003 年用亚革基-9-10-（H）-懑:酮代替A环，其中化合物le对人白血病K56 2细胞的细 胞毒活性的半数抑制浓度为20 nMo（6）Lawr ence等3于2003年用5,6,7-三甲 氧基苯并吠喃酮来代替CA-4的A环得到了化合物Ifo化合物If对人白血病K56 2 细胞的细胞毒活性的半数抑制浓度为50 nMo1e图1-4化合物la-f的结构根据以上其他课题组的研究结果可以得出结论：用其它的芳杂环来代替 CA-4的三甲氧基苯环来进行新型CA-4类似物的设计是可行的。虽然上述化合 物的细胞毒活性以及抑制微管蛋白的毒性有所降低，但是也有可能降低对正常细
12、 胞的毒性，甚至有可能增加对血管内皮细胞的选择性。Lio u等31从2004年开始，用叫跺代替CA-4的B环，设计和合成出一系列 化合物。其中BPR0L075（图1-5）在体外显示了优于CA-4的细胞毒活性，同时 显示了与CA-4相当地抑制微管蛋白聚合的能力，对一系列多药耐药性癌细胞的 半数抑制浓度达到了 nM级。BPR0L075现已进入临床试验阶段32oFlynn等33用苯并吠喃代替CA-4的B环，设计和合成出一系列化合物。其 中BNC105（图1-5）在体外显示了优于CA-4的细胞毒活性与抑制微管蛋白聚合 的能力。同时，BNC105在体外试验中显示出了除了对激活的人脐带静脉血管内 皮细胞（
13、HUVEC）的高选择性。在体内试验中，BNC105的磷酸盐前药BNC105P 显示了对裸鼠移植异体瘤血管的选择性破坏作用34o BNC105P现在也以进入临 床试验阶段。Ar th uis35于2011年用三甲氧吧珠取代CA-4的A环，设计并合成了一系列 2-乙酰基三甲氧口引躲类化合物。与CA-4比较，这类化合物的细胞毒活性以及抑 制微管蛋白聚合活性都大大下降，这类化合物对小鼠B16黑色素瘤细胞增生的 半数抑制浓度最低仅达到10 HMoLee等36同样用三甲氧口引珠取代CA-4的A环。不同于Arthuis等的设计，Lee等直接把B环芳基连接在口引跺的N原子上。其中 化合物2（图1-5）的细胞毒
14、活性与CA-4相当。在体外毛细血管模型中，化合物 2能够破坏新生的体外毛细血管，同时不影响血管内皮细胞的活力。图1-5 BPR0L075、BNC105与化合物2的结构根据BPR0L075、BNC105与化合物2的结构，我们决定同样用5,6,7-三甲 氧基口引蛛来取代CA-4的A环。不同于Arthuis和Lee的设计，我们将B环连接 在三甲氧基口引蛛的1位或3位上，用亚甲基与谖基以及磺酰基来取代CA-4的桥 键，同时用不同取代苯基来模拟CA-4的B环。在上述基础上，进一步参考Lai 等37和Ty等38对BPR0L075的改造，在三甲氧基叫晚上的N原子上引入不同 的取代基。如图1-6所示，我们设计
15、了一系列5,6,7-三甲氧基丐用朵类目标化合物。HO.这些化合物包括1-酰基取代三甲氧基口引味化合物6-7（图1-7）、3-酰基取代 三甲氧基口引跺化合物8-23（图1-7）、1-烷基取代三甲氧基叫跺化合物5、24-25（图1-8）、3-烷基取代三甲氧基口引味化合物26-31（图1-8）、1-磺酰基取代三甲 氧基口引株化合物32-33（图l-8）o参考Flynn等33方法，我们将重点测试目标化合物对HUVEC的作用，尤其 是对激活的HUVEC的选择性。36 R3=4-OCH37a R3=3-OBn,4-OCH37 R3=3-OH,4-OCH38 Ri=R2=H;R3=4-OCH3 9 R=R2
16、=H;R3=2-OCH310 R1=Acetyl;R2=H;R3=4-OCH3 11=Sulfo nyl;R2=H;R3=4-OCH312 R1=R2=H;R3=3-OCH3 13 R1=R2=H;14 R1=R2=H;R3=3,4,5-tr i-OCH315a R1=R2=H;R3=3-OBn,4-OCH315 R1=R2=H;R3=3-OH,4-OCH316 R1=R2=H;R3=3-CI,4-OCH317 R1=R2=H;R3=3-I,4-OCH318 R1=R2=H;R3=3-F,4-OCH319a R1=H;R2=CH3；R3=3-OBn,4-OCH319 R1=H;R2=CH3；;
17、R3=3-OH,4-OCH3R=4-CH320 R1=CH3;R2=H;R3=4-OCH321a R1=CH3;R2=H;R3=3-OBn,4-OCH321 R1=CH3;R2=H;R3=3-OH,4-OCH322 R1=CH3;R2=H;R3=3-F,4-OCH323a R1=CH3;R2=CH3；R3=3-OBn,4-OCH323 R1=CH3;R2=CH3;R3=3-OH,4-OCH3图1-7化合物6-23的结构R5 R=4-CH324 R=4-OCH325a R=3-OBn,4-OCH325 R=3-OH,4-OCH326 R=4-OCH327 R=3,4,5-tr i-OCH328
18、R=3-F,4-OCH329a R=3-OBn,4OCH329 R=3-OH,4-OCH330 R=3-F,4-OCH331a R=3-OBn,4-OCH331 R=3-OH,4-OCH332 R=H33 R=4-CH3图1-8化合物5、24-33的结构1.4 结果与讨论1.4.1 目标化合物和中间体的合成1.4.1.1 目标化合物的合成策略通过文献调研35-37,我们发现相关的1位和3位酰基、烷基与磺酰基呻咪化 合物都有合成方法报道，都可以从5,6,7-三甲氧基叫睬（3）作为原料反应得到。而化合物3又可以由三甲氧基苯甲醛（4）得到。三甲氧基苯甲醛则可以由经济 的化工原料没食子酸得到（图1-9
19、）。tar get c o mpo unds图1-9目标化合物的反合成分析141.2 前体化合物3,4,5-三甲氧基苯甲醛（4）的合成参照陈利华等39方法略做改进，以没食子酸为原料，以硫酸二甲酯为烷基化试剂，以碳酸钾为除酸剂，在无水丙酮中回流制得3,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯。然后将3,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯与水合腐加热腐化得到3,4,5-三甲氧基苯肿。最后将3,4,5-三甲氧基苯朋用铁氧化钾还原得到化合物3,4,5-三甲氧基苯甲醛（图 l-10）o此反应路线原料经济易得，操作简便，适合工业化生产。反应试剂与条件：（i）硫酸二甲酯两酮，碳酸钾，回流5小时。（ii）水合肋90-95C。（ii
20、i）铁氟化钾，甲苯，氨水，室温 图1-10前体化合物4的合成141.3 前体化合物5,6,7-三甲氧基吗睬（3）的合成通过文献调研，我们发现多种6,7位多取代口引跺化合物的合成产率不高，最 后我们参照Mo r in等4。的方法（图1一11）由3,4,5-三甲氧基苯甲醛为原料，首先 通过Henr y反应41高收率得到AL然后通过低温硝化仅以8%的产率得到A2,最后通过Nenitzescu 口引味合成法以46%的产率得到了关键中间体5,6,7-三甲氧基 叫跺（3）o这条路线最终的总产率很低。最近Lee等36报道了一条收率有所提高的路线。Lee等以2-硝基-3,4,5-三甲 氧基苯甲酸甲酯为原料，经
21、三氟化硼乙醛还原后得到2-硝基-3,4,5-三甲氧基苯甲 醇，用PDC（重铭酸毗咤氧化2-硝基-3,4,5-三甲氧基苯甲醇后得到2-硝基-3,4,5-三甲氧基苯甲醛，2-硝基-3,4,5-三甲氧基苯甲醛之后与硝基甲烷缩合得到 中间体Alo Lee等报道应用此条反应路线从-硝基-3,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯为 原料制得A1的总产率达到了 41.9%。但是，2-硝基-3,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯并 国内并没有市售产品出售，以3,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯为原料合成2-硝基-3,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯的产率仅为20%左右，我们重复了 Lee等实验步骤，很难达 到Lee等所报道的高产率。由于3
22、,4,5-三甲氧基苯甲醛经济易得，同时尚未发现 其他产率高的合成路线，最终我们还是采用了 Mo r in等的合成线路。除此之外，采用Mo r in等的合成线路，我们还合成了 1-甲基-5,6,7-三甲氧基 吗睬。1-甲基-5,6,7-三甲氧基吗蛛的合成步骤也与5,6,7-三甲氧基吗躲基本相同，只是使用硝基乙烷代替硝基甲烷。1-甲基-5,6,7-三甲氧基呻躲的总产率比5,6,7-三甲氧基口引咪的稍高。反应条件与试剂：（i）硝基甲烷，正丁胺，醋酸，回流1小时，90%（ii）醋酸酎，发烟硝酸，-8。，30分钟，8%（iii）铁粉,醋酸，乙醇，回流一小时，46%图1-11前体化合物3的合成141.4
23、中间体3-革基氧基-4-甲氧基苯甲酸（A3）的合成中间体3-芳基氧基-4-甲氧基苯甲酸（A3）由3-羟基-4-甲氧基苯甲酸（异香 兰酸）制得，如图1-12所示。A3反应条件与试剂：（D甲醇，浓硫酸，回流5小时，80%（ii）DMF,氯化芾，RT一小时,80%（iii）40%NaOH 溶液图1-12中间体A3的合成141.5 中间体3-硝基-4-甲氧基苯甲酸（A4）的合成中间体3-硝基-4-甲氧基苯甲酸（A4）由4-甲氧基苯甲酸硝化制得，如图1-13 所示。反应条件与试剂:乙酸酎，浓硝酸 图1-13中间体A4的合成141.6 中间体3-碘4甲氧基苯甲酸（A5）的合成中间体3-碘-4-甲氧基苯甲酸
24、（A5）由3-硝基-4-甲氧基苯甲酸（A4）经过三 步反应制得。3-硝基-4-甲氧基苯甲酸（A4）首先经过氢化还原得到3-氨基-4-甲 氧基苯甲酸。3-氨基4甲氧基苯甲酸随后制成重氮盐。重氮盐最终经过Sandmeyer 反应得到3-碘-4-甲氧基苯甲酸（A5）,如图1-14所示。反应条件与试剂：（D杷碳，甲酸俊，甲醇，回流（ii）浓硫酸，亚硝酸钠（iii）碘化钾，水 图1-14中间体A5的合成141.7 中间体3-氯-4-甲氧基苯甲酸（A6）的合成中间体3-氯-4-甲氧基苯甲酸（A6）由4-甲氧基苯甲酸与次氯酸钠反应制得,如图1-15所示。0、，0HO/OHA6反应条件与试剂:4%氢氧化钠溶液
25、，10%次氯酸钠 图1-15中间体A6的合成1.4.1.8 中间体苯甲酰氯（A7-15）的合成进行口引躲3位付克酰基化与口引珠1位酰基化反应的各种苯甲基酰氯由相应的 取代苯甲酸制得。各种取代苯甲酸溶于含催化量无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的无水二氯甲烷中，与过量草酰氯在室温反应90分钟后，除去溶剂后得到中间 体A7-15（图l-16）o化合物A715不经纯化直接进行下一步反应。COOHcatDMF/r t 90minCOCIo xalylch lo r ide/CH2c以R=4-CH3 R=4-OCH3 R=3-OCH3 R=2-OCH3 R=3-OBn,4-OCH3 R=3,4,5-3O
26、CH3 R=3-CI,4-OCH3 R=3-I,4-OCH3 R=3-F,4-OCH3A7 R=4-CH3A8 R=4-OCH3A9 R=3-OCH3A10R=2-OCH3A11 R=3-OBn,4-OCH3A12 R=3,4,5-3OCH3A13 R=3-CI,4-OCH3A14 R=3-I,4-OCH3A15 R=3-F,4-OCH3图1-16中间体A7-12的合成1.4.1.9 目标化合物67的合成如图1-17所示，化合物6由A8在含叔丁醇钾的无水THF溶液中与3反应 得到。化合物All与3在含叔丁醇钾的无水THF溶液中与3反应得到化合物7a,化合物7a通过转移氢化脱去革基得到目标化合物
27、7O36 R3=4-OCH3I 7a R3=3-OBn,4-OCH3 7 R3=3-OH,4-OCH3图1-17目标化合物6-7的合成1.4.1.10 目标化合物89、12-19的合成口引躲的3位酰基化的方法有：（l）Sawada等42报道了以AlCb为催化剂，苯 酰氯与呵味3位酰基化的方法；（2）Katr itzky等43报道了以TiC为催化剂，N-酰基苯并三氮哇与口引躲3位酰基化的方法；（3）Ketch a等彳，报道了以AlCh为催 化剂，苯酰氯与N-苯磺酰基口引躲3位酰基化的方法；（4）Mur akami等45报道了以 三氟磷酸酎与磷酸催化剂，竣酸与2-竣酸乙酯口引珠3位酰基化的方法；（
28、5）Yang 等46报道了以A1C13与ZnCl2为催化剂，苯酰氯与口即朵镁3位酰基化的方法；通过多次尝试，我们发现：口引味在比较强的路易斯酸（AICb/ZnCb）存在下 容易分解；Ketch a等报道的方法只适合取代基较少的苯酰氯，且从5,6,7-三甲氧 基口引躲制得N-苯磺酰基取代叫跺的产率不高；Katr itzky等报道的方法不适用于 N-苯酰基苯并三氮哇；Mur akami等报道的方法不适于5,6,7-三甲氧基口引跺的3 位酰基化。最终我们发现只有Yang等46方法适合于所有目标化合物的合成。如 图1-18所示化合物3在乙基格式试剂的帮助下与氯化锌形成配合物，之后氯化 铝的催化下与A7
29、-15发生付克酰基化反应得到相应的3位酰基化吗咪化合物。化 合物15与19分别由15a与19a通过转移氢化脱掉革基得到。8 R1=R2=H；R3=4,-OCH3 9 R1=R2=H；R3=2,-OCH312=R2=H;R3=3-OCH3 13Ri=R2=H;R=4-CH314 R1=R2=H;R3=3,4,J5,-tr i-OCH3Pd/NH COCH CH OH 厂 15a R1=R2=H;R3=31-OBn,41-OCH3 Pd/C,NH4UUOH,UH3OH|_ 15 r1=r2=h；R3=3,-OH,4-OCH316 R1=R2=H;R3=3,-CI,4-OCH317 R1=R2=H;
30、R3=3,-I)4-OCH318 R1=R2=H;R3=3-F,4-OCH3 Pd/C,NH4COOH,CH3OH I19a R1=H;R2=CH3；R3=31-OBn,41-OCH319 R1=H;R2=CH3；;R3=3-OH,4-OCH3图1-18目标化合物8-9和12-19的合成1.4.1.11 目标化合物20-23的合成如图1-19所示，化合物20由8在含叔丁醇钾的无水THF溶液中用碘甲烷 甲基化反应得到。化合物15a与碘甲烷在含叔丁醇钾的无水THF溶液中反应得 到化合物21a,化合物21a通过转移氢化脱去革基得到目标化合物21。化合物 22由18在含叔丁醇钾的无水THF溶液中用碘甲
31、烷甲基化反应得到。化合物19a 与碘甲烷在含叔丁醇钾的无水THF溶液中反应得到化合物23a,化合物23a通 过转移氢化脱去革基得到目标化合物23 o8,15a,18,19aPd/C,NH4COOH/CH3OH 匚Pd/C,NH4co OH/CH30H 匚20 R1=CH3;R2=H;R3=4-OCH321a R1=CH3;R2=H;R3=3-OBn,4-OCH321 R1=CH3;R2=H;R3=3-OH,4-OCH322 R1=CH3;R2=H;R3=3-F,4-OCH323a R1=CH3;R2=CH3；R3=3-OBn,4-OCH323 R1=CH3；R2=CH3;R3=3-OH,4-O
32、CH3图1-19目标化合物20-23的合成1.4.1.12中间体芳溟(A16-20)的合成进行吗喙3位付克烷基化与口引跺1位烷基化反应的各种革滨由相应的取代苯 甲酸制得。各种取代苯甲酸溶于无水四氢吠喃（THF）,用氢化铝锂还原为相应 的苇醇，之后再溶于二氯乙烷中用三溟化磷制得化合物A1619（图1-20）。R=4-OCH3 R=3-OBn,4-OCH3 R=3,4,5-3OCH3 R=3-F,4-OCH3 R=4-CH3A16 R=4-OCH3 A17R=3-OBn,4-OCH3A18 R=3,4,5-3OCH3A19 R=3-F,4-OCH3A20 R=4-CH3图1-20中间体化合物A16
33、-20的合成1.4.1.13 目标化合物2425的合成如图1-21所示，化合物24由A16在含氢氧化钾与碘化钾的无水DMF溶液 中与5,6,7-三甲氧基口引躲（3）反应得到。化合物25a由A17在含氢氧化钾与碘 化钾的无水DMF溶液中与5,6,7-三甲氧基口引蛛反应得到，化合物25a通过转移 氢化脱去革基得到目标化合物25。A16,A17DMF,KOH,KIPd/C,NH4COOH/CH3OH匚寡紧渭嘘滑图1-21目标化合物24-25的合成1.4.1.14 目标化合物2629的合成口引躲的3位烷基化的主要问题是容易形成2位烷基化的副产物。我们参考 Ho fmann等47方法，如图1-22所示化
34、合物3在含碳酸氢镂的80%丙酮水（体积 比）溶液中与A16-18发生付克烷基化反应得到主要的3位烷基化丐I咪化合物以 及2位烷基化口引味副产物。经过ODS柱层析纯化后，得到3位烷基化口引味化合 物纯品。化合物29由29a通过转移氢化脱掉革基得到。oH N/ORNH4HCO3,80%aqueo us aceto ne26 R=4-OCH327 R=3,4,5-tr i-OCH328 R=3-F,4-OCH3 I29a R=3-OBn,4OCH3 Pd/C,NH4co OH/CH30H U29 R=3-OH,4-OCH3图1-22目标化合物26-29的合成1.4.1.15 目标化合物3031的合成
35、如图1-23所示，化合物30由化合物28在含叔丁醇钾的无水THF溶液中用 碘甲烷甲基化反应得到。化合物29a与碘甲烷在含叔丁醇钾的无水THF溶液中 反应得到化合物31a,化合物31a通过转移氢化脱去革基得到目标化合物31。28 R=3-F,4-OCH3 29a R=3-OBn,4OCH3CH3l/THF/f-BuOK30 R=3-F,4-OCH3Pd/C,NH4COOH/CH3OH匚穿黑蕃膜胪图1-23目标化合物30-31的合成1.4.1.16 目标化合物3233的合成如图1-24所示，化合物32在无水DMF溶液中氢化钠作碱与苯磺酰氯反应 得到。化合物33在无水DMF溶液中氢化钠作碱与对甲苯磺
36、酰氯反应得到。32 R=H33 R=4-CH3图1-24目标化合物32-33的合成1.4.2目标化合物的活性和构效关系1.4.2.1 目标化合物的肿瘤细胞增生抑制活性首先目标化合物6-31用CCK-8法测试了对人非小细胞肺癌细胞组A-549的 抑制活性。化合物的活性如表一所示。其中化合物21的显示出了很强的活性，它的半数抑制浓度达到了 28 nM,虽然比阳性对照CA-4弱，但是与阳性对照秋 水仙素相当。化合物31也显示出了很强的活性，它的半数抑制浓度达到了 71nM。化合物15、20、22、23、28、29和30显示了较强的癌细胞抑制活性，它们的半 数抑制浓度都达到了亚微摩尔级。除此之外化合物
37、5、32与33用SRB法测试了 对三种细胞组（人白血病HL6 0细胞组、人肝癌SMMC-7721和人宫颈癌Hela 细胞组）的抑制活性，不过其半数抑制浓度都超过了 10000 nM。1-酰基取代口引跺化合物6与7没有显示出癌细胞抑制活性，它的半数抑制浓 度大于10000 nMo 3-酰基取代叫跺化合物5显示了较弱的癌细胞抑制活性，它 的半数抑制浓度为8289 nMo通过化合物5与6这一对同分异构体以及与1-磺酰 基化合物32、33的比较表明3-酰基取代呻躲化合物的活性好于1-酰基取代呻昧 化合物和1-磺酰基口引喙化合物。表1-1化合物6-31对A549细胞的抑制活性co mpo undIC50
38、=(nMSDs)aco mpo undIC5o=(nM SDs61000020481.7+7.477100002128.30+6.368828939722146.15 6.0091000023107.818.9105274 267243088 4261110000253192.4 185.51210000262987 44813100002710000141000028387.428.515166.088.6829117.99 10.88161000030144.3 23.4217100003171.727.221810000Co lch icine20.002.04192623 153CA-
39、43.6 40.543位酰基取代叫跺化合物9、12和13没有显示出活性，它的半数抑制浓度 均大于10000 nMo通过与化合物5的比较表明在3-酰基取代口引喙化合物中：4-甲氧基取代的化合物的活性好于3位与2位；4-甲氧基取代化合物的活性好于4-甲基取代化合物。3,4,5-三甲氧基取代的化合物14没有显示出活性，它的半数抑 制浓度大于10000 nMo因此在苯甲酰基上增加甲氧基，会导致化合物的活性下 降。模拟CA-4的B环合成了 3-羟基4-甲氧基取代的化合物15。化合物15显示 出中等的活性，它的半数抑制浓度为166 nMo将羟基转化为卤素原子是一种常 见的药物设计方法，因此还合成了 3-氯
40、4-甲氧基取代的化合物16、3-碘4-甲氧 基取代的化合物17以及3-氟4-甲氧基取代的化合物18。不幸的是化合物16、17与18都没有显示出活性，它们的半数抑制浓度均大于10000 nMo在化合物8的明睬1位上引入甲基得到了化合物20o与化合物8相比，化 合物20的活性增强了，它的半数抑制浓度为481 nMo在化合物15的一位上引入甲基得到了化合物21。与化合物15相比，化合物21的活性增强了，它的半 数抑制浓度为28 nMo在化合物18的1位上引入甲基得到了化合物22。与化合 物18相比，化合物22的活性增强了，它的半数抑制浓度为146 nMo因此在3 位酰基取代口引跺化合物的口引珠的1位
41、上引入甲基将增强活性。在化合物8的一位上引入乙酰基得到了化合物10、引入苯磺酰基得到了化 合物“。化合物10与11都没有显示出癌细胞抑制活性，它们的半数抑制浓度 均大于10000 nMo因此在3位酰基取代口引躲化合物的口引躲的1位上引入较大的 基团，比如乙酰基与磺酰基将降低活性。在化合物15的口引跺2位上引入甲基得到了化合物19。与化合物15相比，化合物19的活性降低了，它的半数抑制浓度为2623 nMo在化合物21的口引跺2 位上引入甲基得到了化合物23。与化合物21相比，化合物23的活性降低了，它的半数抑制浓度为107 nMo因此在3-酰基取代口引跺化合物的口引味的2位上引 入甲基将降低活
42、性。1-烷基取代口引跺化合物24与15显示了较弱的活性，它的半数抑制浓度分别 为3088与3192 nMo 3-烷基取代口引喙化合物26的活性比他的1-烷基取代异构体 24的活性有所增加，它的半数抑制浓度分别为2987 nM。3-烷基取代口引跺化合物 29的活性比它的1-烷基取代异构体25的活性大大增强,它的半数抑制浓度为118 nMo因此，3-烷基取代呻昧化合物的活性好于1-烷基取代呻躲化合物。由于化 合物29与化合物15的活性相当，因此3-烷基取代口引珠化合物与3-酰基取代口引 躲化合物的活性相当。和3-酰基取代口引躲化合物相似，在3-烷基取代口引噪化合物的口引味1位上引 入甲基也会增强活
43、性。从化合物28与30以及化合物29与31的活性比较上都可 以看到这种规律。目标化合物21、23、29和31还进一步测试了对人宫颈癌细胞组Hela、人 骨肉瘤细胞组HT1080和人肝癌细胞组HepG2的抑制活性。如表1-2所示，化合 物21的活性最好，其对Hela、HepG2和HT1080细胞的半数抑制浓度分别达到 了 125、44和26 nMo化合物31的活性与化合物21相当，对Hela、HepG2和 HT1080细胞的半数抑制浓度分别达到了 40、45和42 nMo化合物21与31的活 性与阳性对照秋水仙碱相当。化合物23的活性弱于化合物21与23,但是强于 化合物29。这些结果与上述总结
44、的构效关系是一致的。表1-2化合物21、23、29、31对三种癌细胞的抑制活性co mpo und _IC50=(nMSDs)bHelaHepG2HT1080Co lch icine37.389.5846.742.6 315.380.1821125.374.6 644.45 1.8826.323.98236 32.26 8.591.6 312.17573.9486.029148.511.8172.17 14.20117.86 11.6 53140.6 88.2045.490.4842.18 10.391.4.2.2 目标化合物对HUVEC的抑制活性肿瘤血管内皮细胞在肿瘤血管生成中起着关键作用。
45、作为本课题研究的出发 点，我们希望找到能够选择性抑制肿瘤血管内皮细胞而不破坏正常血管内皮细胞 的药物。肿瘤血管内皮细胞处于激活和不断增殖的状态，而血管内皮细胞处于静 止和衰老的状态4849。参考Flynn等34研究，将HUVEC培养在含有能够促进其 生长的培养基中，使HUVEC处于激活和不断增殖的状态；将HUVEC培养在仅 维持自身生存的培养基中，使HUVEC处于静止和停止增殖的状态。分别用激活 的HUVEC来模拟肿瘤血管内皮细胞，用静止的HUVEC来模拟肿瘤血管内皮细 胞。癌细胞抑制活性较好的化合物分别测试了对激活的HUVEC和静止的 HUVEC的作用，以此来推测化合物对肿瘤血管内皮细胞的选
46、择性。化合物对静 止和激活的HUVEC的半数抑制浓度以及选择比如表1-3所示，其中选择比=化 合物对静止的HUVEC的半数抑制浓度/化合物对激活的HUVEC的半数抑制浓 度。由表1-3可以看到，化合物对癌细胞的抑制活性与对激活的HUVEC的抑制 活性成正相关性。对癌细胞的抑制活性最强的化合物21和31对激活的HUVEC 的抑制活性也最强，其半数抑制浓度分别达到了 25和27 nMo化合物22与23 对激活的HUVEC的抑制活性也较强，其半数抑制浓度分别达到了 96和43 nMo 化合物15与29对激活的HUVEC表现出中等的抑制活性，其半数抑制浓度分别 为 327 和 228 nMo表1-3部
47、分化合物对HUVEC的抑制活性Co mpdactived HUVEC IC50=(nMSDs)quesicent HUVEC IC50=(nMSDs)selective r atioCo lch icine8.91 0.527.6 00.440.85CA-43.340.458.900.6 22.6 615327 17.3529752189.102125.33.135240 2802072296.4 11.8150.78.6 21.562343.75.0316 0.722.13.6 82922821.32453 22510.83127+4.586 296 790233有趣的是，化合物对癌细胞的抑
48、制活性与其对静止的HUVEC的抑制活性没 有相关性。对癌细胞的抑制活性最强的化合物21和31对静止的HUVEC的抑制 活性最弱，其半数抑制浓度分别达到了 5240和6296 nM。化合物15与29对静 止的HUVEC表现出微弱的抑制活性，其半数抑制浓度分别为2975和2453 nM。化合物22与23对静止的HUVEC的抑制活性最强，其半数抑制浓度分别达到了 150和160 nMo由于选择比由上述两个数据决定，因此化合物对癌细胞的抑制 活性与对HUVEC的选择比没有关系。化合物21和31的对HUVEC的选择比最 高，分别达到了 207和233o化合物15与29对HUVEC表现出微弱的选择性，选择
49、比分别为9.1和10.8o化合物22与23对HUVEC基本没有选择性，选择比 分别为1.56和3.68。阳性对照CA-4与秋水仙素对HUVEC基本没有选择性，选 择比分别为0.85和2.66。化合物21和31的对HUVEC的选择比大大超过了 CA-4 与秋水仙素。同时化合物15与29对HUVEC的选择比也超过了 CA-4与秋水仙 素。许多微管蛋白抑制剂的疗效受制于它的最大耐受剂量5。比如秋水仙素仅在 其最大耐受剂量附近对血管起作用”，这限制了他在抗肿瘤方面的应用。因此增 强化合物的最大耐受剂量是新一代抑制微管蛋白化合物发展目标化合物对静 止的HUVEC抑制活性越弱意味着化合物的最大耐受剂量越高
50、34o化合物对 HUVEC的高选择比意味着化合物对肿瘤血管的高靶向性，和对正常血管的弱毒 性。因此化合物21与31对HUVEC的高选择比意味着他们很有希望成为新一代 高效低毒的微管蛋白抑制剂。同时化合物21与31对HUVEC高选择比的原因也是一个值得研究的课题。1.4.2.3 化合物21和31对小管形成的作用和对形成小管的破坏作用小管形成实验(Capillar y Fo r matio n Ass ays)是常见的在体外模拟新生血管 的模型53国，它将血管内皮细胞种植在Matr igel基质胶中让其形成小管结构(Capillar y),用这种过程模拟新生血管形成的过程。将待测药物与HUVEC同