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1、第五章 离心分离(centrifugation)1病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 对于浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，可以采用过滤分离。但当固体颗粒细小而难以过滤时，发酵液不易被过滤纯化，离心操作往显得十分有效。离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。动植物细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离。2病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程离心分离 优点：分离速度快，分离效率高、
2、液相澄清度好；缺点：与过滤设备相比，设备投资高、能耗大、离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同。通常情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体；而过滤可获得的水分含量较低的滤饼。3病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程离心分离利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的分离、浓缩或提炼操作。分类离心沉降 利用固液两相的密度差，在离心机无孔转鼓或管子中进行的悬浮液的分离；离心过滤 利用离心力并通过过滤介质，在有孔转鼓离心机中分离悬浮液的操作；离心分离和超离心 利用不同溶质颗粒在液体中各部分分布的差异，分离不同相
3、对密度液体的操作。4病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程主要内容 离心沉降 离心过滤 离心机的选用 离心机在生物工业中的应用 超离心法5病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程d=2R球形颗粒沉降的受力情况6病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5.1 离心沉降 5.1.1 原理原理 浮力Fg(s-)gV=/6d3(s-)gd:粒子直径；s和分别为粒子和流体的密度；Stockes定
4、律，粘滞力Ff3du1/2CDA u2：流体粘度；u：粒子的运动速度；CD：阻滞系数；A：粒子在运动方向的投影面积；CDf(Re)Re=du/Re1 CD=24/Re 1Re104 CD=24/Re+3/Re0.5+0.34对于生化溶质，一般满足Re1的要求。Ff=CD(1/2 u2)(1/4 d2)=24/Re(1/2 u2)(1/4 d2)当粒子匀速沉降时，FgFf；u=d2/(18)(s-)g7病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5.1.1 原理 若粒子在离心力场中沉降 则 u=d2/(18)(s-)2r 离心分离
5、因数 Fr=2r/g；常速离心机Fr 3000;中速离心机3000 Fr 50000，用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；高速离心机50000 Fr，用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；超速离心机 2104106，用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。8病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5.1.2 离心沉降设备 沉降式离心机包括：瓶式离心机和工业用无孔转鼓离心机 按离心机的作用方式分类9病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长
6、繁殖，引起不同程度的病理生理过程1）斜角式离心机v是一类结构最简单的实验室常用离心机，v指离心管腔与转轴成一定倾角的转子；v角度越大，沉降越结实，分离效果越好，v角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。v颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积。10病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程1）斜角式离心机结构稳定，可装载较多的样品使用较高的转速。加速或减速时，对样品有搅动。有些梯度离心要求用角转头，否则形成的梯度不均一，线性很差1 1病原体侵入机体，消弱机体
7、防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程2）平抛式离心机v平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在 3000-6000rpm。v 转子活动管套内的离心管，静止时垂直挂在转头上，旋转时随着转子转动，从垂直悬吊上升到水平位置（约200800rpm）。v颗粒在水平转子中的沉降是沿管子轴向移动。v样品便于收集v受振动和变速搅乱后对流现象小，v但转头结构复杂，最高转速相对要低，容量也小一些。12病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程平抛式离心机转子13病原体侵入机体
8、，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程）管式离心机（tubular-bowl centrifuge）管式离心机具有一个细长而高速旋转的转鼓，转鼓内装有纵向平板，其下部有进料口。上部两侧有重液相和轻液相出口。14病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程管式离心机 待处理的物料在一定压力（3104 Pa左右）下由进料管经底部空心轴进入鼓内，靠挡板分布于鼓的四周，并使料液迅速达到与转鼓相同的角速度。转鼓带动物料高速旋转，在离心力下，悬浮液沿转鼓内壁向上流动的，料液在离心力场
9、的作用下因其密度差的存在而分离。澄清后的液相流动到转鼓上部的排液口排出。比重大的固体微粒逐渐沉积在转鼓内壁形成 沉渣层，达到一定数量后，停机人工清除。15病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程管式离心机特点：结构简单，可提供较大离心力，转速高，分离因数高达15000-65000。管状离心机可以冷却，有利蛋白质分离 间歇操作，须定时拆卸、清洗 适用于于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬浮液，适用于固含量低于1%，颗粒度小于5微米，黏度大的悬浮液澄清或固液两相密度差较小的分离。16病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对
10、稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 多室式离心机的转鼓内有若干同心圆筒组成的环状分离室，加长了被分离液体的流程，使液层减薄，增加了沉降面积，减少了沉降距离。同时还有粒度筛分的作用，悬浮液中的粗颗粒沉降到靠近内部的分离室壁上，细颗粒则沉降到靠近外部的室壁上，澄清的分离液经溢流排出。常用于抗菌素液液萃取分离，果汁和酒类饮料的澄清等。4）多室式multichamber centrifuge17病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5）碟片式离心机disk-bowl centrifuge 是在管式离心机的基础
11、上发展起来的，在转鼓中加入了许多重迭的碟片，缩短了颗粒的沉降距离，提高了分离效率。是生物工业中应用最为广泛的一种离心机 有一个密封的转鼓，内装十至上百个锥顶角为60100锥形碟片。碟片间的距离一般为0.5-2.5mm,18病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程碟片式离心机工作原理 当悬浮液在动压头的作用下，经中心管流入高速旋转的碟片之间的间隙时，便产生了惯性离心力，其中密度较大的固体颗粒在离心力作用下向上层碟片的下表面运动，而后在离心力作用下被向外甩出，沿碟片下表面向转子外围下滑，而液体则由于密度小，在后续液体的推动下沿着
12、碟片的隙道向转子中心流动，然后沿中心轴上升，从套管中排出，达到分离的目的 19病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程碟片式离心机类型 人工排渣的碟片离心机 碟片上不开孔，只有一个清液排出口。沉积在转鼓内壁上的沉渣，间歇排出。只适用于固体颗粒含量很少的悬浮液。喷嘴排渣的碟片离心机：当固体颗粒含量较多时，可采用具有喷嘴排渣的碟式离心沉降机。在有特殊形状内壁的转鼓壁上开设若干喷嘴 活门（活塞）排渣的碟片离心机 这是近年来开发的机型，它和相同直径的活塞机相似，其速度可增加23%30%,故可使分离因素达15000 左右，可用于酶制剂
13、，疫苗和胰岛素等生产中分离物的澄清。20病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程人工排渣的碟片式离心机 间歇式离心机 适用于进料中固相浓度很低(1%2%)，分离因数高。特别适用于分离两种液体同时除去少量固体，也可用于澄清作业，如用于抗生素的提取，疫苗的生产，梭状芽孢杆菌的收集以及维生素、生物碱甾类化合物。21病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程喷嘴排渣碟片式离心机 连续式离心机。双锥型转鼓。转鼓周边有若干个喷嘴(224个)，喷嘴孔径为0.53.2mm,
14、由于排渣的含液量高，具有流动性，多用于浓缩过程。转鼓直径可达900mm,最大处理量为300m3/h。适用于处理颗粒直径为 0.1 100um，体积浓度小于25%的悬浮液，如用于抗生素、酶、氨基酸和微生物，或单细胞蛋白质、酵母、淀粉等。22病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程活门排渣碟片式离心机 利用活门启闭排渣孔进行断续自动排渣。离心力强度范围为50009000,最大处理能力可达40m3/h。适用于处理颗粒直径0.1500um,固液密度差大于0.01g/cm3、固相含量小于10%的悬浮液。对一些难分离的物料特别有效，如大
15、肠杆菌类。23病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 连续操作的沉降设备。转鼓内有可旋转的螺旋输送器，其转数比转鼓的转数稍低。有立式和卧式两种，卧螺机是一种全速旋转，连续进料、分离和卸料的离心机，最大离心力可达6000，操作温度可达300 用于分离含固量较多的悬浮液，生产能力较大。6)螺旋式离心机scroll-type centrifuge24病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程螺旋式离心机工作原理 转鼓与螺旋以一定差速同向高速旋转，悬浮液通过螺旋输
16、送器的空心轴进入机内中部，由进料管连续引入螺旋内筒，加速后进入转鼓。在离心力场作用下，固相物沉积在转鼓壁上形成沉渣层。输料螺旋将沉积的固相物连续不断定推至转鼓锥端，经排渣口排出机外，较轻的液相物则形成内层液环，由转鼓大端溢流口连续溢出转鼓，经排液口排出机外。25病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5.2 离心过滤 3.2.1 原理 离心过滤是将料液送入有孔的转鼓并利用离心力场进行过滤的过程，以离心力为推动力完成过滤，兼有离心和过滤的双重作用。滤饼形成 滤饼压紧 滤饼压干26病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境
17、的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5.2.2 离心过滤设备离心过滤机有孔转鼓分离物系：固体密度大于或小于液体密度的悬浮液操作方式：连续式间歇式27病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5.2.2 离心过滤的设备28病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5.3离心机的选用29病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5.3离心机的选用30病原体侵入机体，消弱机
18、体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5.3离心机的选用31病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5.4离心机在生物工业中的应用 液相粘度 12mPa.s,固液密度差0.1g/ml,粒子大小0.5100um 灭菌32病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5.5 超离心法 超离心法是根据物质的沉降系数、质量和形状不同，应用强大的离心力，将混合物中各组分分离、浓缩、提纯的方法。原理 离心沉降 uw=d2/(
19、18)(s-)2r 若粒子在离心力场中作匀速直线运动，即uw=dr/dt t=18/2d2(s-)ln(r2/r1)适用条件：不适于非球形粒子；仅适合符合牛顿流体的稀的固体悬浮物；微分离心 细胞器的分离33病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5.5.2 超离心技术的分类制备性超离心 粒子差速离心 一般密度梯度离心法 等密度离心法 预形成梯度等密度离心 自形成梯度的等密度离心分析性超离心34病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程粒子差速离心 采用逐渐增
20、加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降粒子，在不同离心速度和不同离心时间下分批分离的方法。适于分离沉降系数相差较大的粒子，如细胞匀浆中细胞器的分离。35病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程分析性超离心相对分子质量的测定大分子纯度的估计检测大分子中构象的变化36病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程The End37病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程4.4离心机在生物工业中
21、的应用38病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程一般密度梯度离心法 分级区带离心 它是把样品铺放在一个连续的液体密度梯度上，然后进行离心，并控制离心分离的时间，使得粒子完全沉降之前，在液体梯度中移动而形成不连续分离区带。该法仅用于分离有一定沉降系数差的粒子，与粒子密度无关。这种方法已用于RNA-DNA混合物、核蛋白体亚单位和其他细胞成分的分离。39病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程等密度离心法 当不同粒子存在密度差时，在离心力场作用下，粒子或向下沉
22、降，或向上浮起，一直移动到与它们密度恰好相等的位置上(即等密度点)并形成区带，此即等密度离心法。位于等密度点上的粒子没有运动，区带的形状和位置都不受离心时间的影响。体系处于动态平衡。等密度离心的有效分离仅取决于粒子的密度差。密度差越大，分离效果越好，与粒子的大小和形状无关，但是此二者决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。40病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程预形成梯度等密度离心法 本法需要事先制备密度梯度，常用的梯度介质主要是非离子型的化合物。离心时把样品铺放在梯度介质的液面上，这个密度包括了所需要研究的密度范围，直到
23、粒子的漂浮密度和梯度的密度相等时，粒子才发生沉降，并排列成不同的区带。用这一技术可以定量的从线粒体和过氧化物酶体中分离溶酶体。41病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程预形成梯度等密度离心法 等密度分离也可不用密度梯度来进行，这时样品需先在一个足够使较重粒子沉降的速度下离心，分离除去这些较重的粒子后，再把含有所需粒子的样品悬浮在一个与被分离组分具有相等密度的介质中，重新离心直至所需的物质沉降为止，密度低于所需物质的粒子漂浮在弯月面上。42病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程自形成梯度等密度离心 常用的梯度介质有粒子型盐类如铯盐或铷盐和三碘化苯衍生物等。离心时是把密度均一的介质溶液和样品混合后装入离心管中，通过离心自形成梯度，让粒子在梯度中进行再分配。离心达到平衡后，不同密度的粒子在梯度中各自分配到其等密度点的待定位置上，形成不同的区带。43