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1、第五章基因的克隆与分第五章基因的克隆与分第五章基因的克隆与分第五章基因的克隆与分离离离离第1页，本讲稿共49页第一节第一节PCRPCR扩增获得目的基因或扩增获得目的基因或cDNAcDNA第二节基因组文库的构建与基因分离第二节基因组文库的构建与基因分离第三节第三节cDNAcDNA文库的构建与筛选文库的构建与筛选第四节根据差异表达获得目的基因第四节根据差异表达获得目的基因第五节基因的化学合成第五节基因的化学合成第2页，本讲稿共49页一、cDNA末端的快速扩增（RACE）RACE：根根据据已已得得到到的的不不完完整整的的cDNA序序列列设设计计引引物物对对mRNA3端端和和5端端进进行行克克隆隆，可
2、可获获得得全全的的cDNA克隆克隆。（。（RACE克隆的意义）克隆的意义）第一节 PCR扩增获得目的基因或cDNA第3页，本讲稿共49页1、根根据据基基因因编编码码蛋蛋白白同同源源序序列列，或或多多个个同同源源基基因因cDNA序序列列设设计计（简并）引物，（简并）引物，RT-PCR克隆核心序列克隆核心序列，测序。，测序。2、根据核心序列，设计新的引物进行、根据核心序列，设计新的引物进行cDNA的的3端和端和5端的扩增端的扩增。3、拼拼接接成成 cDNA全全序序列列的的信信息息，设设计计新新的的引引物物扩扩增增全全长长cDNA序序列。列。第一节 PCR扩增获得目的基因或cDNA一、cDNA末端的
3、快速扩增（RACE）第4页，本讲稿共49页（二）经典（二）经典RACE克隆原理：克隆原理：3 RACE：由由含含有有oligo（dT）的的接接头头引引物物引引发发合合成成cDNA第第一一链链，根根据据中中间间核核心心序序列列设设计计出出上上游游引引物物，与与3引引物物扩增第一链扩增第一链cDNA，可得到全长，可得到全长cDNA的的3末端序列。末端序列。5 RACE：先先用用oligo（dT）引引发发合合成成cDNA第第一一链链，然然后后在在第第一一链链cDNA的的3端端加加上上人人工工锚锚定定序序列列，利利用用5锚锚定定引物及引物及3特异性引物进行扩增，得到全长特异性引物进行扩增，得到全长cD
4、NA的的5末端序列。末端序列。第5页，本讲稿共49页由含有oligo（dT）的接头引物引发合成第一链cDNA根据中间核心序列设计出根据中间核心序列设计出5特异性引物特异性引物与与3引物扩增第一链引物扩增第一链cDNA可得到全长可得到全长cDNA的的3末端序列末端序列第6页，本讲稿共49页5RACE在第一链在第一链cDNA的的3端加上人工锚定序列端加上人工锚定序列用oligo（dT）引发合成cDNA第一链 利用利用5锚定引物及锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的的5末端序列末端序列 第7页，本讲稿共49页第二节 基因组文库的构建与基因分离基因组文库：将某
5、一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。操作：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。一、基因组文库（genomic library）第8页，本讲稿共49页（2）目前常用的载体 二、构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为 23 kp cosmid载体：容量为 45 kb YAC：容量为 1
6、 Mb BAC:容量为 300 kb第9页，本讲稿共49页1、文库的完整性：文库应包含基因组的完整序列信息2、基因组信息的可重建性：重建基因组的完整信息3、文库的大小：即文库中应包含的独立重组子数目三、基因组文库应满足的条件第10页，本讲稿共49页文库的大小：一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-P)ln(1-L/G)P：文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）L：克隆fragment的平均大小G：Genome大小N：所需的重组载体数（克隆数）N=4.61GL第11页，本讲稿共49页例如：人的基因组是例如：人的基因组是 3109 bp，插入，插入DNA片断的平均
7、片断的平均长度如果是长度如果是1.7104 bp，所需的重组载体数：所需的重组载体数：N=基因组文库实际克隆数：比计算值大2倍或3倍，或更高4.61Gf=4.6131091.7104=8.1105第12页，本讲稿共49页四、基因组文库构建的一般步骤1、染色体DNA的分离2、大片段的制备3、载体的制备4、重组连接5、包装6、重组噬菌体感染大肠杆菌 基因组文库 第13页，本讲稿共49页2、大片段的制备小孔喷射（小孔喷射（10kb）、超声波（）、超声波（300bp）、机械搅拌（）、机械搅拌（8kb）酶切法：酶切法：不完全酶解：产生随机性的不完全酶解：产生随机性的DNA片段，片段大小取决于内切酶识片段
8、，片段大小取决于内切酶识别的位点数和酶解程度。别的位点数和酶解程度。识别识别4对碱基的内切酶适用于制备对碱基的内切酶适用于制备120kb的的DNA片段片段 物理切割法：物理切割法：1、染色体DNA的分离如：如：Sau3A与与BamHI的酶切末端。的酶切末端。p108第14页，本讲稿共49页3、载体的制备内切酶，将载体切成三段：左臂、右臂、中间片段左臂可置换区右臂Sal IBamH I EcoR IEcoR IBamH I Sal I20kb14kb9kb第15页，本讲稿共49页4、重组连接左臂插入片段右臂左臂插入片段插入片段右臂第16页，本讲稿共49页5、包装6、重组噬菌体感染大肠杆菌 基因组
9、文库 第17页，本讲稿共49页五、基因组文库的筛选筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来探针筛选法：两步或三步原位杂交法第18页，本讲稿共49页以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。cDNA librarymRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶引物将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞全部mRNA信息）的集合称为该组织细胞的cDNA文库。第三节第三节 cDNA文库的构建与筛选文库的构建与筛选第19页，本讲稿共49页（1 1）以）以）以）以mRNAmRNA为材
10、料，适用于为材料，适用于为材料，适用于为材料，适用于RNARNA病毒病毒病毒病毒（2 2）文库小文库小文库小文库小，构建容易，筛选简单，构建容易，筛选简单，构建容易，筛选简单，构建容易，筛选简单（3 3）每一个）每一个）每一个）每一个cDNAcDNA克隆对应一种克隆对应一种克隆对应一种克隆对应一种mRNAmRNA序列序列序列序列（4 4）不含内含子序列不含内含子序列不含内含子序列不含内含子序列，可进行原核表达，可进行原核表达，可进行原核表达，可进行原核表达一、cDNA文库的特点cDNA文库应满足的条件：文库应满足的条件：文库应满足的条件：文库应满足的条件：文库的代表性：文库的代表性：文库的代表
11、性：文库的代表性：文库中重组文库中重组文库中重组文库中重组cDNAcDNA分子是否可以完整的反映来分子是否可以完整的反映来分子是否可以完整的反映来分子是否可以完整的反映来源细胞中的表达信息，用源细胞中的表达信息，用源细胞中的表达信息，用源细胞中的表达信息，用库容量库容量库容量库容量衡量。衡量。衡量。衡量。序列的完整性：序列的完整性：序列的完整性：序列的完整性：5UTR5UTR（容易丢失）、编码区、（容易丢失）、编码区、（容易丢失）、编码区、（容易丢失）、编码区、3UTR3UTRp117p117第20页，本讲稿共49页二、构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（total RNA）提取Triz
12、ol试剂提取，或商业化的试剂盒（kit）。（2）mRNA的分离纯化分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。第21页，本讲稿共49页反转录酶（3）cDNA的合成 cDNA第一链合成第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物第22页，本讲稿共49页用RNase H识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。mRNAcDNA第一链3 3 5 5 引物cDNA第一链3 5 引物 降解降解mRNA模板模板RNaseHmRNAmRNAm
13、RNA第23页，本讲稿共49页 cDNA第二链合成第二链合成mRNA小片断为引物，合成第二链cDNA。DNA Pol I除去引物并修补后，再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。mRNAcDNA第一链3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶DNA 聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3 5 DNA ligase去引物第24页，本讲稿共49页在在双双链链cDNA末末端端接接上上人人工工接接头头（含含限限制制性性内内切切酶酶黏黏性末端），即可与载体连接，转入受体菌。性末端），即可与载体连接，转入受体菌。或或借借助助末末端端转转移移酶酶给给载载体体和和双双链链cDNA的的3端端分分别别加加上上几个几个C或
14、或G，成为粘性末端。，成为粘性末端。（4）cDNA与载体连接接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶第25页，本讲稿共49页（5）重组载体转化受体菌第26页，本讲稿共49页分子探针杂交法：用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析三、文库的查询（screening）第27页，本讲稿共49页 基基因因组组文文库库克克隆隆的的是是任任何何片片段段，包包括括未未知知功功能能的的DNADNA序序列列、调调控控基基因因，cDNAcDNA文文库库克克隆隆的的是是具具有有蛋蛋白白质质产产物物的的结构基因结构基因。基基因因组组文文库库克克隆隆
15、的的是是全全部部遗遗传传信信息息，不不受受时时空空影影响响；cDNAcDNA文文库库克克隆隆的的是是不不完完全全的的编编码码DNADNA序序列列，受受发发育育的的调调控因子的影响控因子的影响。基基因因组组文文库库中中编编码码基基因因是是真真实实的的基基因因，含含有有内内含含子子和和外显子；外显子；cDNAcDNA克隆的是克隆的是不含内含子不含内含子的基因。的基因。Genomic library与cDNA library区别第28页，本讲稿共49页一、cDNA末端的快速扩增（RACE）根根据据已已得得到到的的不不完完整整的的cDNA序序列列设设计计引引物物对对mRNA3端端和和5端端进进行行克克
16、隆隆，可可获获得得全全的的cDNA克克隆隆。（RACE克隆的意义）克隆的意义）上节内容回顾（二）经典RACE克隆原理：（一）RACE：第29页，本讲稿共49页由含有oligo（dT）的接头引物引发合成第一链cDNA根据中间核心序列设计出根据中间核心序列设计出5特异性引物特异性引物与与3引物扩增第一链引物扩增第一链cDNA可得到全长可得到全长cDNA的的3末端序列末端序列第30页，本讲稿共49页5RACE在第一链在第一链cDNA的的3端加上人工锚定序列端加上人工锚定序列用oligo（dT）引发合成cDNA第一链 利用利用5锚定引物及锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长特异性引物进行扩增，得到
17、全长cDNA的的5末端序列末端序列 第31页，本讲稿共49页二、基因组文库的构建与基因分离基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。（一）基因组文库（genomic library）（二）基因组文库应满足的条件1、文库的完整性2、基因组信息的可重建性3、文库的大小第32页，本讲稿共49页（三）基因组文库构建的一般步骤1、染色体DNA的分离2、大片段的制备3、载体的制备4、重组连接5、包装6、重组噬菌体感染大肠杆菌 基因组文库 第33页，本讲稿共49页（四）基因组文库的筛选筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克
18、隆筛选出来探针筛选法：两步或三步原位杂交法第34页，本讲稿共49页（一）cDNA library将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞全部mRNA信息）的集合称为该组织细胞的cDNA文库。三、cDNA文库的构建与筛选（二）cDNA文库应满足的条件1 1、文库的代表性、文库的代表性、文库的代表性、文库的代表性2 2、序列的完整性、序列的完整性、序列的完整性、序列的完整性第35页，本讲稿共49页（三）构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（total RNA）提取（2）mRNA
19、的分离纯化（3）cDNA的合成（4）cDNA与载体连接（5）重组载体转化受体菌第36页，本讲稿共49页 基基因因组组文文库库克克隆隆的的是是任任何何片片段段，包包括括未未知知功功能能的的DNADNA序序列列、调调控控基基因因，cDNAcDNA文文库库克克隆隆的的是是具具有有蛋蛋白白质质产产物物的的结构基因结构基因。基基因因组组文文库库克克隆隆的的是是全全部部遗遗传传信信息息，不不受受时时空空影影响响；cDNAcDNA文文库库克克隆隆的的是是不不完完全全的的编编码码DNADNA序序列列，受受发发育育的的调调控因子的影响控因子的影响。基基因因组组文文库库中中编编码码基基因因是是真真实实的的基基因因
20、，含含有有内内含含子子和和外显子；外显子；cDNAcDNA克隆的是克隆的是不含内含子不含内含子的基因。的基因。Genomic library与cDNA library区别第37页，本讲稿共49页第四节 基因差异表达获得目的基因在在在在生生生生物物物物个个个个体体体体发发发发育育育育的的的的不不不不同同同同阶阶阶阶段段段段，或或或或是是是是在在在在不不不不同同同同的的的的组组组组织织织织或或或或细细细细胞胞胞胞中中中中发发发发生生生生的的的的不不不不同同同同基基基基因因因因按按按按时时时时间间间间、空空空空间间间间进进进进行行行行有有有有序序序序的的的的表表表表达达达达方方方方式式式式，称称称称
21、为为为为基基基基因因因因的的的的差差差差异表达异表达异表达异表达。真真真真核核核核基基基基因因因因总总总总数数数数约约约约为为为为100 100 000000个个个个，但但但但在在在在一一一一定定定定的的的的发发发发育育育育阶阶阶阶段段段段、在在在在某某某某一一一一类类类类型型型型细细细细胞胞胞胞当当当当中中中中，则则则则只只只只有有有有15%15%左左左左右右右右的的的的基基基基因因因因得得得得以以以以表表表表达达达达，产产产产生生生生出出出出大大大大约约约约15 00015 000种不同的种不同的种不同的种不同的mRNAmRNA分子。分子。分子。分子。一、差异显示PCR（DDRT-PCR）
22、DDRT-PCRDDRT-PCR：基于：基于：基于：基于PCRPCR的的的的mRNAmRNA差异显示技术差异显示技术差异显示技术差异显示技术第38页，本讲稿共49页（1）3 锚定引物锚定引物Oligo（dTMN）：Oligo（dT）引引物物的的3端端加加两两个个核核苷苷酸酸（倒倒数数第第二二个个不不再是再是T）。）。AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NMTTTTTTTTM：A、G or C N:A、G、T or C5 3 利用mRNA的poly A尾巴设计 利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增第39页，本讲稿共49页12种锚定引物AG TTTTTTTT5 3 CG TTTT
23、TTTT5 3 GG TTTTTTTT5 3 TG TTTTTTTT5 3 AA TTTTTTTT5 3 CA TTTTTTTT5 3 GA TTTTTTTT5 3 TA TTTTTTTT5 3 AC TTTTTTTT5 3 CC TTTTTTTT5 3 GC TTTTTTTT5 3 TC TTTTTTTT5 3 这这这这些些些些引引引引物物物物由由由由11121112个个个个T T及及及及两两两两个个个个其其其其它它它它 的的的的 碱碱碱碱 基基基基 组组组组 成成成成，用用用用 通通通通 式式式式5-5-T T1111MNMN或或或或5-T5-T1212MNMN表示。表示。表示。表示。使使
24、使使用用用用这这这这种种种种锚锚锚锚定定定定引引引引物物物物，可可可可以以以以将将将将整整整整个个个个mRNAmRNA群群群群体体体体在在在在cDNAcDNA水水水水平平平平上上上上，分分分分成成成成大大大大致致致致相相相相等等等等但但但但序序序序列列列列结结结结构构构构不不不不同同同同的的的的1212份亚群体。份亚群体。份亚群体。份亚群体。第40页，本讲稿共49页（2）5端的随机引物端的随机引物 同同同同时时时时为为为为扩扩扩扩增增增增出出出出polyApolyA上上上上游游游游500bp500bp以以以以内内内内所所所所有有有有可可可可能能能能性性性性的的的的mRNAmRNA序列，在序列，
25、在序列，在序列，在55端又设计了端又设计了端又设计了端又设计了2020种种种种10bp10bp长的随机引物。长的随机引物。长的随机引物。长的随机引物。AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NMTTTTTTTT5 3 RTNMTTTTTTTT5 cDNA3 NNNNNNNNNN5 3 cDNA第二链，并PCR第41页，本讲稿共49页（3）用一种）用一种3锚定引物和一种锚定引物和一种5随机引物进行扩增随机引物进行扩增12种锚定引物，若与种锚定引物，若与20种随机引物，可组成种随机引物，可组成240组组引物。引物。引物组合：引物组合：实验结果：如如果果每每条条带带相相当当于于一一种种mRN
26、A，20000 mRNA基基本本上反映了一种特定细胞中全部的上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。240组能分出组能分出20000多条带！多条带！第42页，本讲稿共49页（4）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较相同引物对在不同来源cDNA中的PCR产物并排电泳选择有差异的带，回收测序，得到部分选择有差异的带，回收测序，得到部分cDNA序列。序列。再通过筛选文库等各种方法获得全长再通过筛选文库等各种方法获得全长cDNA或基因。或基因。优点：优点：速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量少等；速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量少等；
27、缺点：缺点：假阳性率高、获得的假阳性率高、获得的cDNAcDNA片段很短。片段很短。第43页，本讲稿共49页1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。第五节 基因的化学合成一、化学合成目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法。第44页，本讲稿共49页1、互补延伸连接法二、化学合成DNA片断的组装预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3 5 5 3 Klenow片段引物5 3 T4DNA连接酶T
28、4多核苷酸激酶第45页，本讲稿共49页（3）T4 DNA连接接酶连接连接T4多核苷酸激酶完整的DNA双链2、互补连接法（合成的（合成的DNA单链的单链的5端是端是-OH）（2）5端磷酸化端磷酸化（1）互补配对）互补配对预预先先设设计计合合成成的的片片断断之之间间都都有有互互补补区区域域，不不同同片片断断之之间间的的互互补补区区域域能能形形成成有断点的完整双链。有断点的完整双链。第46页，本讲稿共49页1.直接合成基因2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很难操作cDNA 3.合成探针序列4.定点突变合成合成带有定点突变的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低三、寡聚核苷酸化学合成的优点或应用第47页，本讲稿共49页DNA合成仪5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点的人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor第48页，本讲稿共49页1、经典RACE克隆的原理是什么？有何意义？2、什么是Genomic library？与cDNA library有何区别？3、什么是cDNA文库？cDNA文库必需满足什么条件，构建包括哪些步骤？4、差异显示PCR获得目的基因的技术原理是什么？有什么优缺点？思 考 题第49页，本讲稿共49页