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1、第一节第一节PCRPCR扩增获得目的基因或扩增获得目的基因或cDNAcDNA第二节基因组文库的构建与基因分离第二节基因组文库的构建与基因分离第三节第三节cDNAcDNA文库的构建与筛选文库的构建与筛选第四节根据差异表达获得目的基因第四节根据差异表达获得目的基因第五节基因的化学合成第五节基因的化学合成一、一、cDNA末端的快速扩增（末端的快速扩增（RACE）RACE：根根据据已已得得到到的的不不完完整整的的cDNA序序列列设设计计引引物物对对mRNA3端端和和5端端进进行行克克隆隆，可可获获得得全全的的cDNA克隆克隆。（。（RACE克隆的意义）克隆的意义）第一节 PCR扩增获得目的基因或cDN
2、A1、根根据据基基因因编编码码蛋蛋白白同同源源序序列列，或或多多个个同同源源基基因因cDNA序序列设计（简并）引物，列设计（简并）引物，RT-PCR克隆核心序列克隆核心序列，测序。，测序。2、根根据据核核心心序序列列，设设计计新新的的引引物物进进行行cDNA的的3端端和和5端端的扩增的扩增。3、拼拼接接成成 cDNA全全序序列列的的信信息息，设设计计新新的的引引物物扩扩增增全全长长cDNA序列。序列。第一节 PCR扩增获得目的基因或cDNA一、一、cDNA末端的快速扩增（末端的快速扩增（RACE）（二）经典（二）经典RACE克隆原理：克隆原理：3 RACE：由由含含有有oligo（dT）的的接
3、接头头引引物物引引发发合合成成cDNA第第一一链链，根根据据中中间间核核心心序序列列设设计计出出上上游游引引物物，与与3引引物物扩扩增增第第一一链链cDNA，可可得得到到全全长长cDNA的的3末末端序列。端序列。5 RACE：先先用用oligo（dT）引引发发合合成成cDNA第第一一链链，然然后后在在第第一一链链cDNA的的3端端加加上上人人工工锚锚定定序序列列，利利用用5锚锚定定引引物物及及3特特异异性性引引物物进进行行扩扩增增，得得到到全全长长cDNA的的5末端序列。末端序列。由含有由含有oligo（dT）的接头引物引发合成第一链）的接头引物引发合成第一链cDNA根据中间核心序列设计出根据
4、中间核心序列设计出5特异性引物特异性引物与与3引物扩增第一链引物扩增第一链cDNA可得到全长可得到全长cDNA的的3末端序列末端序列5RACE在第一链在第一链cDNA的的3端加上人工锚定序列端加上人工锚定序列用用oligo（dT）引发合成）引发合成cDNA第一链第一链 利用利用5锚定引物及锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的的5末端序列末端序列 第二节 基因组文库的构建与基因分离基基因因组组文文库库：将将某某一一生生物物基基因因组组DNA片片段段化化并并全全部部克克隆隆后后所所获获得得的的重重组组子子群群体体的的总总称称。理理论论上上讲讲，这这些些重组
5、载体上带有了该生物体的重组载体上带有了该生物体的全部基因全部基因。操操作作：将将某某种种生生物物细细胞胞的的整整个个基基因因组组DNA切切割割成成大大小小合合适适的的片片断断，并并将将所所有有这这些些片片断断都都与与适适当当的的载载体体连连接，引入相应的宿主细胞中接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增保存和扩增。一、基因组文库（一、基因组文库（genomic library）（2）目前常用的载体）目前常用的载体 二、二、构建基因文库的载体选用构建基因文库的载体选用载体能够容载的载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的的基因文库所需要的重组子重组子的
6、数目。的数目。载体容量越大，所要求的载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所片断数目越少，所需的需的重组子重组子越少。越少。（1）对载体的要求）对载体的要求 载体系列：载体系列：容量为容量为 23 kp cosmid载体：载体：容量为容量为 45 kb YAC：容量为容量为 1 Mb BAC:容量为容量为 300 kb1、文库的完整性：、文库的完整性：文库应包含基因组的完整序列信息文库应包含基因组的完整序列信息2、基因组信息的可重建性：、基因组信息的可重建性：重建基因组的完整信息重建基因组的完整信息3、文库的大小：、文库的大小：即文库中应包含的独立重组子数目即文库中应包含的独立重组子数目三
7、、基因组文库应满足的条件三、基因组文库应满足的条件文库的大小：文库的大小：一个文库要包含一个文库要包含99%的基因组的基因组DNA时所需要的克隆数目。时所需要的克隆数目。N=ln(1-P)ln(1-L/G)P：文库包含了整个基因组：文库包含了整个基因组DNA的概率（的概率（99%）L：克隆：克隆fragment的平均大小的平均大小G：Genome大小大小N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）N=4.61GL例如：人的基因组是例如：人的基因组是 3109 bp，插入，插入DNA片断的片断的平均长度如果是平均长度如果是1.7104 bp，所需的重组所需的重组载体数：载体数：N=
8、基因组文库实际克隆数：比计算值大基因组文库实际克隆数：比计算值大2倍或倍或3倍，或更高倍，或更高4.61Gf=4.6131091.7104=8.1105四、基因组文库构建的一般步骤四、基因组文库构建的一般步骤1、染色体、染色体DNA的分离的分离2、大片段的制备、大片段的制备3、载体的制备、载体的制备4、重组连接、重组连接5、包装、包装6、重组噬菌体、重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 基因组文库基因组文库 2、大片段的制备、大片段的制备小孔喷射（小孔喷射（10kb）、超声波（）、超声波（300bp）、机械搅拌（）、机械搅拌（8kb）酶切法：酶切法：不完全酶解：产生随机性的不完全酶解：产生随机性
9、的DNA片段，片段大小取决于片段，片段大小取决于内切酶识别的位点数和酶解程度。内切酶识别的位点数和酶解程度。识别识别4对碱基的内切酶适用于制备对碱基的内切酶适用于制备120kb的的DNA片段片段 物理切割法：物理切割法：1、染色体、染色体DNA的分离的分离如：如：Sau3A与与BamHI的酶切末端。的酶切末端。p1083、载体的制备、载体的制备内切酶，将内切酶，将 载体切成三段：载体切成三段：左臂、右臂、中间片段左臂、右臂、中间片段左臂左臂可置换区可置换区右臂右臂Sal IBamH I EcoR IEcoR IBamH I Sal I20kb14kb9kb4、重组连接、重组连接左臂左臂插入片段
10、插入片段右臂右臂左臂左臂插入片段插入片段插入片段插入片段右臂右臂5、包装、包装6、重组噬菌体、重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 基因组文库基因组文库 五、基因组文库的筛选五、基因组文库的筛选筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来探针筛选法：探针筛选法：两步或三步原位杂交法两步或三步原位杂交法以以mRNA为模板为模板逆转录逆转录出的出的DNA称称cDNA。cDNA librarymRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物将将某某一一生生物物的的特特定定组组织织或或特特定定发发育育时时期期细细胞胞内内的的全全部部mRNA反反
11、转转录录成成cDNA，与与适适当当的的载载体体连连接接后后转转化化受受体体菌菌，则则每每个个细细菌菌含含有有一一段段cDNA，这这些些cDNA克克隆隆（包包含含着着细细胞胞全全部部mRNA信息）的集合称为信息）的集合称为该组织细胞该组织细胞的的cDNA文库。文库。第三节第三节 cDNA文库的构建与筛选文库的构建与筛选（1 1）以）以）以）以mRNAmRNA为材料，适用于为材料，适用于为材料，适用于为材料，适用于RNARNA病毒病毒病毒病毒（2 2）文库小文库小文库小文库小，构建容易，筛选简单，构建容易，筛选简单，构建容易，筛选简单，构建容易，筛选简单（3 3）每一个）每一个）每一个）每一个cD
12、NAcDNA克隆对应一种克隆对应一种克隆对应一种克隆对应一种mRNAmRNA序列序列序列序列（4 4）不含内含子序列不含内含子序列不含内含子序列不含内含子序列，可进行原核表达，可进行原核表达，可进行原核表达，可进行原核表达一、一、cDNA文库的特点文库的特点cDNA文库应满足的条件：文库应满足的条件：文库应满足的条件：文库应满足的条件：文库的代表性：文库的代表性：文库的代表性：文库的代表性：文库中重组文库中重组文库中重组文库中重组cDNAcDNA分子是否可以完整的分子是否可以完整的分子是否可以完整的分子是否可以完整的反映来源细胞中的表达信息，用反映来源细胞中的表达信息，用反映来源细胞中的表达信
13、息，用反映来源细胞中的表达信息，用库容量库容量库容量库容量衡量。衡量。衡量。衡量。序列的完整性：序列的完整性：序列的完整性：序列的完整性：5UTR5UTR（容易丢失）、编码区、（容易丢失）、编码区、（容易丢失）、编码区、（容易丢失）、编码区、3UTR3UTRp117p117二、二、构建构建cDNA文库的一般步骤文库的一般步骤（1）总）总RNA（total RNA）提取）提取Trizol试剂提取，或商业化的试剂盒（试剂提取，或商业化的试剂盒（kit）。）。（2）mRNA的分离纯化的分离纯化分离分离mRNA用商业化的用商业化的Oligo dT纤维柱。纤维柱。反转录酶反转录酶（3）cDNA的合成的合
14、成 cDNA第一链合成第一链合成逆转录酶能以逆转录酶能以RNA为模板合成为模板合成DNA。用用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。的第一链。mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物用用RNase H识识别别mRNA-cDNA杂杂交交分分子子中中的的mRNA，并将其降解成许多小片断。并将其降解成许多小片断。mRNAcDNA第一链第一链3 3 5 5 引物引物cDNA第一链第一链3 5 引物引物 降解降解mRNA模板模板RNaseHmRNAmRNAmRNA cDNA第二链合成第二链合成mRNA小片断为引物，合
15、成第二链小片断为引物，合成第二链cDNA。DNA Pol I除去引物并修补后，再使用除去引物并修补后，再使用DNA连接酶连接酶连成一整条连成一整条DNA链。链。mRNAcDNA第一链第一链3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶cDNA第二链第二链cDNA第一链第一链3 5 DNA ligase去引物去引物在在双双链链cDNA末末端端接接上上人人工工接接头头（含含限限制制性性内内切切酶黏性末端），即可与载体连接，转入受体菌。酶黏性末端），即可与载体连接，转入受体菌。或或借借助助末末端端转转移移酶酶给给载载体体和和双双链链cDNA的的3端端分分别加上几个别加上几个C或或G
16、，成为粘性末端。，成为粘性末端。（4）cDNA与载体连接与载体连接接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶（5）重组载体转化受体菌）重组载体转化受体菌分子探针杂交法分子探针杂交法：用目的基因探针与文库中的重组载：用目的基因探针与文库中的重组载体进行体进行Southern blot杂交杂交。文库文库载体载体探针探针电泳后杂交电泳后杂交放射自显影放射自显影测序分析测序分析三、文库的查询（三、文库的查询（screening）基基因因组组文文库库克克隆隆的的是是任任何何片片段段，包包括括未未知知功功能能的的DNADNA序序列列、调调控控基基因因，cDNAcDNA文文库库
17、克克隆隆的的是是具具有有蛋蛋白白质产物的质产物的结构基因结构基因。基基因因组组文文库库克克隆隆的的是是全全部部遗遗传传信信息息，不不受受时时空空影影响响；cDNAcDNA文文库库克克隆隆的的是是不不完完全全的的编编码码DNADNA序序列列，受受发发育育的调控因子的影响的调控因子的影响。基基因因组组文文库库中中编编码码基基因因是是真真实实的的基基因因，含含有有内内含含子子和外显子；和外显子；cDNAcDNA克隆的是克隆的是不含内含子不含内含子的基因。的基因。G Genomicenomic library library与与cDNAcDNA library library区别区别一、一、cDNA末
18、端的快速扩增（末端的快速扩增（RACE）根根据据已已得得到到的的不不完完整整的的cDNA序序列列设设计计引引物物对对mRNA3端端和和5端端进进行行克克隆隆，可可获获得得全全的的cDNA克克隆隆。（。（RACE克隆的意义）克隆的意义）上节内容回顾上节内容回顾（二）经典（二）经典RACE克隆原理：克隆原理：（一）（一）RACE：由含有由含有oligo（dT）的接头引物引发合成第一链）的接头引物引发合成第一链cDNA根据中间核心序列设计出根据中间核心序列设计出5特异性引物特异性引物与与3引物扩增第一链引物扩增第一链cDNA可得到全长可得到全长cDNA的的3末端序列末端序列5RACE在第一链在第一链
19、cDNA的的3端加上人工锚定序列端加上人工锚定序列用用oligo（dT）引发合成）引发合成cDNA第一链第一链 利用利用5锚定引物及锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的的5末端序列末端序列 二、基因组文库的构建与基因分离二、基因组文库的构建与基因分离基基因因组组文文库库：将将某某一一生生物物基基因因组组DNA片片段段化化并并全全部部克克隆隆后后所所获获得得的的重重组组子子群群体体的的总总称称。理理论论上上讲讲，这这些些重组载体上带有了该生物体的重组载体上带有了该生物体的全部基因全部基因。（一）基因（一）基因组文文库（genomic library）（二
20、）基因组文库应满足的条件（二）基因组文库应满足的条件1、文库的完整性、文库的完整性2、基因组信息的可重建性、基因组信息的可重建性3、文库的大小、文库的大小（三）基因（三）基因组文文库构建的一般步构建的一般步骤1、染色体、染色体DNA的分离的分离2、大片段的制备、大片段的制备3、载体的制备、载体的制备4、重组连接、重组连接5、包装、包装6、重组噬菌体、重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 基因组文库基因组文库（四）基因（四）基因组文文库的的筛选筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来探针筛选法：探针筛选法：两步或三步原位杂交法两步或三步原位杂
21、交法（一）（一）cDNA library将将某某一一生生物物的的特特定定组组织织或或特特定定发发育育时时期期细细胞胞内内的的全全部部mRNA反反转转录录成成cDNA，与与适适当当的的载载体体连连接接后后转转化化受受体体菌菌，则则每每个个细细菌菌含含有有一一段段cDNA，这这些些cDNA克克隆隆（包包含含着着细细胞胞全全部部mRNA信息）的集合称为信息）的集合称为该组织细胞该组织细胞的的cDNA文库。文库。三、三、cDNA文库的构建与筛选文库的构建与筛选（二）（二）cDNA文文库应满足的条件足的条件1 1、文库的代表性、文库的代表性、文库的代表性、文库的代表性2 2、序列的完整性、序列的完整性、
22、序列的完整性、序列的完整性（三）（三）构建构建cDNA文文库的一般步的一般步骤（1）总）总RNA（total RNA）提取）提取（2）mRNA的分离纯化的分离纯化（3）cDNA的合成的合成（4）cDNA与载体连接与载体连接（5）重组载体转化受体菌）重组载体转化受体菌 基基因因组组文文库库克克隆隆的的是是任任何何片片段段，包包括括未未知知功功能能的的DNADNA序序列列、调调控控基基因因，cDNAcDNA文文库库克克隆隆的的是是具具有有蛋蛋白白质产物的质产物的结构基因结构基因。基基因因组组文文库库克克隆隆的的是是全全部部遗遗传传信信息息，不不受受时时空空影影响响；cDNAcDNA文文库库克克隆隆
23、的的是是不不完完全全的的编编码码DNADNA序序列列，受受发发育育的调控因子的影响的调控因子的影响。基基因因组组文文库库中中编编码码基基因因是是真真实实的的基基因因，含含有有内内含含子子和外显子；和外显子；cDNAcDNA克隆的是克隆的是不含内含子不含内含子的基因。的基因。Genomic Genomic librarylibrary与与cDNAcDNA library library区别区别第四节 基因差异表达获得目的基因在在在在生生生生物物物物个个个个体体体体发发发发育育育育的的的的不不不不同同同同阶阶阶阶段段段段，或或或或是是是是在在在在不不不不同同同同的的的的组组组组织织织织或或或或细细
24、细细胞胞胞胞中中中中发发发发生生生生的的的的不不不不同同同同基基基基因因因因按按按按时时时时间间间间、空空空空间间间间进进进进行行行行有有有有序序序序的的的的表表表表达达达达方方方方式式式式，称为基因的称为基因的称为基因的称为基因的差异表达差异表达差异表达差异表达。真真真真核核核核基基基基因因因因总总总总数数数数约约约约为为为为100 100 000000个个个个，但但但但在在在在一一一一定定定定的的的的发发发发育育育育阶阶阶阶段段段段、在在在在某某某某一一一一类类类类型型型型细细细细胞胞胞胞当当当当中中中中，则则则则只只只只有有有有15%15%左左左左右右右右的的的的基基基基因因因因得得得得
25、以以以以表表表表达达达达，产生出大约产生出大约产生出大约产生出大约15 00015 000种不同的种不同的种不同的种不同的mRNAmRNA分子。分子。分子。分子。一、一、差异显示差异显示PCR（DDRT-PCR）DDRT-PCRDDRT-PCR：基于：基于：基于：基于PCRPCR的的的的mRNAmRNA差异显示技术差异显示技术差异显示技术差异显示技术（1）3 锚定引物锚定引物Oligo（dTMN）：Oligo（dT）引引物物的的3端端加加两两个个核核苷苷酸酸（倒倒数数第第二二个不再是个不再是T）。）。AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NM TTTTTTTTM：A、G or C N
26、:A、G、T or C5 3 利用利用mRNA的的poly A尾巴设计尾巴设计 利用利用两组特殊的引物两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增对差别表达的基因进行扩增12种锚定引物种锚定引物AG TTTTTTTT5 3 CG TTTTTTTT5 3 GG TTTTTTTT5 3 TG TTTTTTTT5 3 AA TTTTTTTT5 3 CA TTTTTTTT5 3 GA TTTTTTTT5 3 TA TTTTTTTT5 3 AC TTTTTTTT5 3 CC TTTTTTTT5 3 GC TTTTTTTT5 3 TC TTTTTTTT5 3 这这这这些些些些引引引引物物物物由由由由111211
27、12个个个个T T及及及及两两两两个个个个其其其其它它它它的的的的碱碱碱碱基基基基组组组组成成成成，用用用用通通通通式式式式5-T5-T1111MNMN或或或或5-T5-T1212MNMN表示。表示。表示。表示。使使使使用用用用这这这这种种种种锚锚锚锚定定定定引引引引物物物物，可可可可以以以以 将将将将 整整整整 个个个个 mRNAmRNA群群群群 体体体体 在在在在cDNAcDNA水水水水平平平平上上上上，分分分分成成成成大大大大致致致致相相相相等等等等但但但但序序序序列列列列结结结结构构构构不不不不同同同同的的的的1212份份份份亚亚亚亚群体。群体。群体。群体。（2）5端的随机引物端的随机
28、引物 同同同同时时时时为为为为扩扩扩扩增增增增出出出出polyApolyA上上上上游游游游500bp500bp以以以以内内内内所所所所有有有有可可可可能能能能性性性性的的的的mRNAmRNA序列，在序列，在序列，在序列，在55端又设计了端又设计了端又设计了端又设计了2020种种种种10bp10bp长的随机引物。长的随机引物。长的随机引物。长的随机引物。AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NM TTTTTTTT5 3 RTNM TTTTTTTT 5 cDNA 3 NNNNNNNNNN5 3 cDNA第二链，并第二链，并PCR（3）用一种）用一种3锚定引物和一种锚定引物和一种5随机引物
29、进行扩增随机引物进行扩增12种锚定引物，若与种锚定引物，若与20种随机引物，可组成种随机引物，可组成240组引物。组引物。引物组合：引物组合：实验结果：实验结果：如如果果每每条条带带相相当当于于一一种种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。在测序胶上，每组扩出在测序胶上，每组扩出50-100条长度为条长度为100-500bp的带。的带。240组能分出组能分出20000多条带！多条带！（4）随机）随机-锚定引物锚定引物PCR的产物电泳比较的产物电泳比较相同引物对在不同来源相同引物对在不同来源cDNA中的中的PCR产物并排电泳产物并
30、排电泳选择有差异的带，回收测序，得到部分选择有差异的带，回收测序，得到部分cDNA序列。序列。再通过筛选文库等各种方法获得全长再通过筛选文库等各种方法获得全长cDNA或基因。或基因。优点：优点：速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量少等；速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量少等；缺点：缺点：假阳性率高、获得的假阳性率高、获得的cDNAcDNA片段很短。片段很短。1976年年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的提出了用化学方法合成基因的设想，并于设想，并于1979年在年在science上发表了率先成功地合上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。基因的
31、论文。第五节第五节 基因的化学合成基因的化学合成一、化学合成目前常用的方法一、化学合成目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸二酯法、磷酸三酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、固相合成法、自动化合成法。自动化合成法。1、互补延伸连接法、互补延伸连接法二、化学合成二、化学合成DNA片断的组装片断的组装预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。聚合酶延伸成完整的双链。3 5 5 3 Klenow片段片段引物引物5 3 T4DNA连接酶连接酶T4多核苷酸激酶多核苷酸
32、激酶（3）T4 DNA连接接酶连接连接T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶完整的完整的DNA双链双链2、互补连接法、互补连接法（合成的（合成的DNA单链的单链的5端是端是-OH）（2）5端磷酸化端磷酸化（1）互补配对）互补配对预预先先设设计计合合成成的的片片断断之之间间都都有有互互补补区区域域，不不同同片片断断之之间间的的互互补补区区域能形成有断点的完整双链。域能形成有断点的完整双链。1.直接合成基因直接合成基因2.合成引物（合成引物（20mer左右）左右）（1 1）mRNA的含量很低，很难操作的含量很低，很难操作cDNA 3.合成探针序列合成探针序列4.定点突变合成定点突变合成合成带有定点突变的基因
33、片断。合成带有定点突变的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低）有些基因比较短，化学合成费用较低三、三、寡聚核苷酸化学合成的优点或应用寡聚核苷酸化学合成的优点或应用DNA合成仪合成仪5.合成人工接头或衔接物合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点的含有各种酶切位点的人工接头人工接头（Adaptor）或）或衔衔接物接物（Linker）序列。）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor1、经典、经典RACE克隆的原理是什么？有何意义？克隆的原理是什么？有何意义？2、什么是、什么是Genomic library？与？与cDNA library有何区别？有何区别？3、什什么么是是cDNA文文库库？cDNA文文库库必必需需满满足足什什么么条条件件，构构建包括哪些步骤？建包括哪些步骤？4、差差异异显显示示PCR获获得得目目的的基基因因的的技技术术原原理理是是什什么么？有有什什么优缺点？么优缺点？思思 考考 题题