第五章基因的分离与鉴定.ppt

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1、第五章基因的分离与鉴定现在学习的是第1页，共80页n DNA克隆片段的产生和分离n 重组体DNA分子的构建及导入受 体细胞n 基因克隆的实验方案n 克隆基因的分离n 重组子的选择与鉴定现在学习的是第2页，共80页克隆基因的分离 1.应用核酸探针 2.应用差别杂交或扣除杂交法 3.应用mRNA差别显示技术 4.应用表达文库 5.酵母双杂交体系 现在学习的是第3页，共80页 应用核酸探针 分离克隆的目的基因现在学习的是第4页，共80页步骤：1.获得探针2.转膜3.杂交现在学习的是第5页，共80页Transfer the DNA in the plaque or colony to aNylon o

2、r nitrocellulose membranePhage DNA bind to the membrane directly Bacterial colonies must be lysed to release DNA on the membrane surface.Hybridization(in a solution Containing Nucleic acid probe)Wash to remove unhybri-dization probe and visualize X-ray film(radio-actively labeled)antibody or enzyme(

3、modified nucleotide labeled Line up the hybridizated region orrepeated hybridization(Alkali treatment)现在学习的是第6页，共80页探针的来源1.某种生物实验体系中分离到的基因序列，可作为从其它生物中分离相关基因的核酸探针。2.根据蛋白质家族保守性，合成核酸探针。功能相同或相近的蛋白质，存在着具有共同氨基酸序列的区段（保守区），往往由彼此相邻的67个氨基酸组成。现在学习的是第7页，共80页寡核苷酸探针的人工合成 1.探针的长度；要使探针与目的基因序列严格互补，最少的探针长度1516个核苷酸，实验

4、中为保证足够的特异性，通常使用1720个核苷酸。2.简并性；根据蛋白质氨基酸组分合成的寡核苷酸探针，通常是混合物的形式。在这种探针库中，只有一种是与目的基因完全互补的。现在学习的是第8页，共80页 由于探针库中只有一种是与目的基因完全互补的，其它的探针有可能与不相关的片断杂交，产生假阳性信号。1.猜测体探针 2.PCR-猜测体探针现在学习的是第9页，共80页 猜测体：一种人工合成的用于分离克隆基因的低简并性的寡核苷酸探针，其核苷酸序列是根据特定物种当中某种已知蛋白质的密码子使用频率，同时又采纳了根据猜测最可能在目的基因中出现的密码子资料，选择含有密码子简并程度最低的蛋白质区段进行合成。一种较长

5、的唯一的寡核苷酸序列，它能够大范围的却不能够完全的同靶序列互补。现在学习的是第10页，共80页现在学习的是第11页，共80页PCR-猜测体探针（尿酸氧化酶基因）根据末端根据末端32个氨基酸序列，设计个氨基酸序列，设计PCR简并引物，以简并引物，以cDNA为模板为模板用猜测探针杂交筛选阳性克隆用猜测探针杂交筛选阳性克隆现在学习的是第12页，共80页应用差别杂交或扣除杂交法 分离克隆的目的基因现在学习的是第13页，共80页差别杂交（differential hybridization）又称差别筛选(differential screening)适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA。

6、扣除杂交（subtractive hybridization）又叫扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning）通过构建扣除文库得以实现。现在学习的是第14页，共80页差别杂交：需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达、目的基因不表达），分别制备两种不同mRNA提取物，以两种总mRNA探针平行杂交，对有表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆文库进行筛选。现在学习的是第15页，共80页现在学习的是第16页，共80页差别杂交的局限性：1.杂交灵敏度低，对于低峰度的mRNA尤为明显 2.工作量大，重复性差，两套平行滤膜之间的DNA保有量有差别，导致杂交信号不一致。现在学习的是第

7、17页，共80页 扣除杂交：去除普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集。现在学习的是第18页，共80页现在学习的是第19页，共80页应用mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）分离克隆的目的基因 (differential display reverse transcription(differential display reverse transcription polymerase chain reaction)polymerase chain reaction)现在学习的是第20页，共80页原理：用3-端锚定引物和反转录酶合成cDNA的

8、第一链；用3-端锚定引物和5-端10-mer随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（DDRT-PCR），在标准的序列胶中电泳23小时，可显示出50100条长度在1005000bp之间的DNA条带。现在学习的是第21页，共80页 P.Liang等人设计合成了全部12种不同的引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫作3-端锚定脱氧核苷酸引物，并用5-T11MN或5-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。mRNA:5-NMAAAAAAAA-3(12种序

9、列)3-NMTTTTTTTTT-5 3-锚定引物：现在学习的是第22页，共80页现在学习的是第23页，共80页 10-mer，更好的同第一链结合，从而呈现出更多种的mRNA。一般用20种随机引物和12种3-端锚定引物组成的全部240组引物对PCR扩增后，所产生的大约20 000条条带，基本涵盖了在一定的发育阶段某种类型细胞中所表达的全部的mRNA。5-随机引物现在学习的是第24页，共80页 由于在cDNA群体中，代表特定细胞类型或发育阶段的mRNA的含量非常低，所以要把一种只在某一阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出来，就需要PCR扩增。DDRT-P

10、CR现在学习的是第25页，共80页 1.从一对处于不同发育阶段（或不同基因型）的细胞群体中分离总mRNA，并用3-端锚定引物作反转录合成第一链cDNA;2.用5-端随机引物和3-端锚定引物组成的引物对，在加入放射性同位素标记的dNTP的条件下，以第一步反转录产物作模板进行PCR扩增。3.将扩增样品在变性的DNA测序胶中进行电泳分离基本过程：现在学习的是第26页，共80页4.将有关的差别表达的DNA条带从测序胶上切割下来回收其DNA片断；5.胶块中的DNA量非常少，不能用于克隆，需进行二次扩增；6.将克隆的特定的DNA分别同基因组DNA及总mRNA作Southern或Northern杂交，测序；

11、7.以此目的片断作探针从cDNA文库中或基因组文库中筛选全长的cDNA克隆或基因组克隆。现在学习的是第27页，共80页现在学习的是第28页，共80页 1.可以同时比较多个样品表达的差异；2.可以同时检测“上游”及“下游”的基因；3.检测灵敏度高，所需样品少，经PCR扩增一些低峰度的mRNA也可以被检测出来；4.结合使用了PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本方法显得较单方便。优点：优点：现在学习的是第29页，共80页 1.1.假阳性比例高（50%75%）；同一长度的条带，含有多种DNA序列；邻近条带回收时，造成人为误差；mRNA3-端序列保守性高，而常用3-端cDNA作探针 2.扩增的差别条带分

12、子长度比较短小（110450bp）；局限性：局限性：现在学习的是第30页，共80页 应用表达文库 分离克隆的目的基因现在学习的是第31页，共80页 当没有可用的核苷酸序列供作筛选基因文库的探针时，将cDNA克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌寄主细胞然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克隆的真核目的基因。表达文库分离克隆的目的基因现在学习的是第32页，共80页1.表达的蛋白质以融合蛋白质的形式存在，其中原核蛋白质的氨基酸序列是整合在真核蛋白质的一个末端，不易被原核细胞中的有关蛋白酶消化降解，因而显得比较稳定，可以得到较高的表达水平。2.cDNA片断必须置于启动子序列下游，在其控制之下；按正确的取向和读

13、码结构插入，确保产生正确的蛋白质。特点特点：现在学习的是第33页，共80页 1.利用抗体筛选表达文库；2.测定蛋白质的功能；3.用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位点的DNA片断作探针筛选表达文库。筛选的方法：现在学习的是第34页，共80页将菌落或噬菌斑原位复制到膜上处理之后蛋白质暴露，与第一抗体温育漂洗未结合的抗体，加入经标记的第二抗体能与第一抗体结合抗体筛选表达文库现在学习的是第35页，共80页 生物化学研究表明，存在Ca离子的条件下，钙调蛋白能与许多种酶结合形成稳定的复合物。将放射性同位素标记得钙调蛋白用作探针筛选cDNA表达文库，鉴定能够表达出与它特异性结合的目标蛋白质的阳性克隆

14、。2.测定蛋白质的功能现在学习的是第36页，共80页 鉴定能够表达出与特定DNA片断（真核启动子中与转录因子结合的DNA元件）结合的目标蛋白质的克隆。3.用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位点的DNA片断作探针筛选表达文库现在学习的是第37页，共80页酵母双杂交体系（two-hybrid system）现在学习的是第38页，共80页 有效的分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因。应用于真核基因地表达调控，细胞粘合因子间的相互作用、信号转导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离等研究酵母双杂交体系又叫相互作用陷阱 (interaction trap)现在学习的是第39页，共

15、80页 许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上可以分开的、功能上相互独立的结构域组成（example）；应用重组DNA技术，也可以将来自同一个转录因子的、或者两种不同转录因子的、分开的两种结构域，在体内重新组装成具有功能的转录因子，从而激活UAS（上游激活序列）下游启动子调节的报告基因的表达。基本原理：现在学习的是第40页，共80页 酿酒酵母的半乳糖苷酶基因的转录激活因子GAL4，在N端1147位氨基酸区段有一个结合域（DNA-binding domain,DNA-BD）；在C端768881位氨基酸区段有一个转录激活域（transcription activation domain,AD）

16、DNA-BD 能识别激活序列并与之结合；AD通过同转录机制中的其它成份之间的结合作用启动下游基因进行转录。用DNA重组技术将它们分开，即使在同一个寄主中表达，也不会直接发生相互作用不能激活相关的效应基因进行转录。Example:现在学习的是第41页，共80页寄主菌株：剔除掉GAL4基因的酿酒酵母1.SFY526和HF7c带有报告基因lacZ、HIS3和LEU22.还有两种可以在大肠杆菌和酵母中自主复制的穿梭载体a.pGBT9(DNA-BD)：靶基因是按正确的取向和读码结构被克隆在载体的多克隆位点区内，于是靶蛋白和GAL4-BD之间产生融合作用，形成杂种蛋白质b.第二种质粒载体pGAD424(A

17、D质粒载体)用来构建cDNA表达文库专用载体，克隆cDNA片断是按正确的取向和读码结构插入在 载体的多克隆位点区内，因此由cDNA 编码的蛋白质便会同GSL4-AD之间产生融合作用，形成杂种蛋白质。现在学习的是第42页，共80页现在学习的是第43页，共80页现在学习的是第44页，共80页现在学习的是第45页，共80页a.选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c；b.构建带有GAL1 UAS-启动子-lac Z（His3）的转化载体;c.把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上，把所有cDNA都克隆到pGAD424载体上，构成cDNA表达文库。d.从大肠杆菌中

18、分别提取这两种重组质粒DNA，共转化感受态酿酒酵母菌株。e.将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。酵母双杂交体系的主要实验过程：go现在学习的是第46页，共80页 1.遗传检测法 2.物理检测法 3.菌落或噬菌斑杂交筛选法 4.免疫化学检测法 5.蛋白质筛选法 6.转译筛选法 重组子分子的选择与鉴定重组子分子的选择与鉴定现在学习的是第47页，共80页 重组子、目的重组子与非目的重组子由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子现在学习的是第48页

19、，共80页 该方法要求克隆基因能够表达，并利用相应的基因突变型作为受体细胞，当受体细胞由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表型时，我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基因优点：简便、快速，结果较可靠缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞遗传检测法现在学习的是第49页，共80页1.根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 a.抗药性记号插入失活选择法 b.-半乳糖苷酶显色反应选择法现在学习的是第50页，共80页现在学习的是第51页，共80页抗药性筛选法的基本原理抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、

20、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcs现在学习的是第52页，共80页抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子现在学习的是第53页，共80页显色筛选法显色筛选法的基本原理：显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反

21、应）等现在学习的是第54页，共80页显色筛选法的基本操作 将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落现在学习的是第55页，共80页2.根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。现在学习的是第56页，共80页Example:Example:gt.Bgt.B噬菌体（由于噬菌体（由于C C片断的缺失而造成片断的缺失而造成重组缺陷的重组缺陷的 red

22、 red噬菌体），在大肠杆菌噬菌体），在大肠杆菌lig tslig ts菌株上生长不能形成噬菌斑，在有连接酶功菌株上生长不能形成噬菌斑，在有连接酶功能的大肠杆菌能的大肠杆菌liglig菌株上形成噬菌斑。菌株上形成噬菌斑。将具有连接酶基因的重组体噬菌体将具有连接酶基因的重组体噬菌体gt.Bgt.B，涂布在大肠杆菌，涂布在大肠杆菌lig tslig ts菌株上时，通过寄主菌株上时，通过寄主细胞的互补作用，能够形成噬菌斑。根据形细胞的互补作用，能够形成噬菌斑。根据形成噬菌斑这种表型特征，直接选择具野生功成噬菌斑这种表型特征，直接选择具野生功能的重组体噬菌体。能的重组体噬菌体。现在学习的是第57页，共

23、80页缺点：不单要求克隆的DNA片断必须大到括足以包含一个完整的基因，而且还要求所编码的基因能够在大肠杆菌中实现功能表达。（对于真核基因很难达到要求）现在学习的是第58页，共80页物理检测法 1.凝胶电泳检测法 利用凝胶电泳的方法，鉴定外源片断是否插入及其长度 优点：简便、快速 缺点：只能提供克隆片段大小的信息 现在学习的是第59页，共80页2.R-环检测法：鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源区域 在临近双链DNA变性温度下和高浓度的甲酰胺溶液中（70%），双链的DNA-RNA分子比双链的DNA-DNA分子更加稳定。在这种条件下，RNA会同它的双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的

24、RNA-DNA，而被取代的另一条DNA呈单链状态。这种由双链RNA-DNA和单链DNA形成的泡状体称R-环结构现在学习的是第60页，共80页现在学习的是第61页，共80页 包括菌落或噬菌斑的原位杂交技术 优点：方法简便、快速。缺点：必须具有相应的探针。分子杂交技术检测法现在学习的是第62页，共80页 菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据现在学习的是第63页，共80页菌落原位杂交法的基本操作：菌落原位杂交法的基本操作：用硝酸纤维素薄膜影印克隆平

25、板用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜80烘干固定影印薄膜薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜用X光胶片覆盖薄膜感光现在学习的是第64页，共80页 利用免疫学的原理，检测克隆基因的表达产物。免疫化学检测法免疫化学检测法现在学习的是第65页，共80页 该方法类似于原位杂交法优点：方法简便，一次可检测大量的 克隆子缺点：克隆基因必须表达并具有相应的 抗体1.放射性抗体检测法放射性抗体检测法现在学习的是第66页，共80页 1.免疫血清含有几种IgG抗体，识别抗原分子上不同定子，并分别同各自识别的抗原定子相结合；2.抗体分子或抗体的F（ab）部分，

26、能够牢固的吸附在固体基质上（聚乙烯等塑料制品），而不容易被洗脱掉；3.通过体外碘化作用，IgG抗体会迅速的被放射性同位素125I标记上。原理：原理：现在学习的是第67页，共80页1.菌落溶解释放出抗原蛋白质；a.把平板放置在氯仿蒸气中；b.用烈性噬菌体的气溶胶喷洒；c.用带有能被热诱发的原噬菌体的寄主菌处理。2.将连结在固体支持物上的抗体缓慢的同溶解的细胞接触，形成抗原抗体复合物3.将固体支持物取出，与放射性标记的第二种抗体温育；4.放射自显影检测。步骤：步骤：现在学习的是第68页，共80页用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印裂解平板轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定与

27、II125标记的IgG保温洗涤、干燥、感光放射免疫原位杂交鉴定现在学习的是第69页，共80页细菌菌落溶解，释放出抗原蛋白质现在学习的是第70页，共80页双位点检测法：适用于含有杂种多肽菌落分析。杂种多肽 A B （A）抗体 （B）抗体 固定在固体基质 125I标记现在学习的是第71页，共80页滤膜抗体溶液放射性标记抗体检测法的操作程序聚乙烯薄膜培养皿及菌落放射性标记抗体检测法的操作程序现在学习的是第72页，共80页 在生长菌落的琼脂培养基中，加入专门抗这种蛋白质分子的特异性抗体。如果菌落的细菌会分泌出某种蛋白质，那么它的周围，就会出现一条由一种叫做沉淀素的抗体-抗原沉淀物所形成的白色的圆圈 灵

28、敏度低，易受干扰，实用性差。2.免疫沉淀检测法现在学习的是第73页，共80页免疫沉淀鉴定：免疫沉淀鉴定：现在学习的是第74页，共80页 用专门设计的表达载体，将真核基因编码的蛋白质在大肠杆菌中实现表达，通过免疫化学法进行检测。3.表达载体产物之免疫化学检测法现在学习的是第75页，共80页现在学习的是第76页，共80页用来检测同DNA特异性结合的蛋白质因子的一种方法 操作程序：1.用硝酸纤维素滤膜进行“噬菌斑转移”，使其中的蛋白质吸附在滤膜上；2.将滤膜同放射性标记的含有DNA结合蛋白质编码序列的双链DNA寡核苷酸探针杂交；3.根据放射自显影结果筛选出阳性反应克隆。蛋白质筛选法蛋白质筛选法现在学

29、习的是第77页，共80页DNA结合蛋白编码基因的鉴定：用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板用聚乙烯薄膜影印裂解平板轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定80烘干固定影印薄膜与探针溶液中杂交洗涤、干燥、感光探针选用能与目标蛋白特异性结合的DNA片段现在学习的是第78页，共80页 1.杂交抑制的转译 该方法用于cDNA文库中目的基因的筛选。其原理是在体外无细胞的转译中利用cDNA与mRNA杂交后导致mRNA的不能翻译，从而筛选阳性克隆子。分离的基因编码着丰富的mRNA。优点：不需要克隆基因的表达，不需要探针或抗体。缺点：较烦琐。转译筛选法转译筛选法现在学习的是第79页，共80页 1.将从大肠杆菌菌落或噬菌体群体中制备的带有目的基因 的重组质粒DNA变性后，与总mRNA杂交；2.转入无细胞转译体系（麦胚提取物或兔网织红细胞提取物）,由于加有35S标记的蛋氨酸，转译的多肽蛋白质可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分析；3.结果同未杂交的mRNA转译产物作比较，从中找出其转译合成被抑制的mRNA，即同目的基因变性DNA互补彼此杂交的mRNA。步骤：步骤：现在学习的是第80页，共80页