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1、霉菌毒素的检验霉菌毒素的检验掌握：掌握：o黄曲霉毒素的理化性质和薄层色谱法测定黄黄曲霉毒素的理化性质和薄层色谱法测定黄曲霉毒素曲霉毒素B1的原理和方法的原理和方法o微柱筛选法测定微柱筛选法测定AFTB1的原理及方法的原理及方法o赭曲霉毒素的理化性质和薄层色谱法测定的赭曲霉毒素的理化性质和薄层色谱法测定的原理及方法原理及方法熟悉：熟悉：o展青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇展青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇、和雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、毒素、玉米赤霉烯酮的测定方法玉米赤霉烯酮的测定方法了解：了解：o霉菌毒素的命名、分类、危害和霉菌毒素的命名、分类、危害和污染来源污染来源 概述概述 黄曲霉毒素
2、的检验黄曲霉毒素的检验 赭赭zh曲霉毒素曲霉毒素 展青霉素展青霉素 脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇 T-2毒素毒素 玉米赤霉烯酮的测定方法玉米赤霉烯酮的测定方法目录目录霉菌及霉菌毒素霉菌及霉菌毒素v霉菌霉菌：是丝状真菌的俗称，意即：是丝状真菌的俗称，意即发霉的真菌发霉的真菌，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。菇那样产生大型的子实体。常见毒性大的霉菌毒素常见毒性大的霉菌毒素：黄曲霉毒素：黄曲霉毒素（AFT）、杂色曲霉素、赭曲霉毒素、）、杂色曲霉素、赭曲霉毒素、伏马菌素、展青霉素、桔青霉
3、素、玉伏马菌素、展青霉素、桔青霉素、玉米赤霉烯酮米赤霉烯酮霉菌毒素的命名与分类霉菌毒素的命名与分类按照产生毒素的霉菌名称来命名按照产生毒素的霉菌名称来命名按毒作用部位分按毒作用部位分肝脏毒素肝脏毒素肾脏毒素肾脏毒素神经毒素神经毒素类似性激素作用物质类似性激素作用物质按毒素来源分按毒素来源分曲霉毒素曲霉毒素青霉毒素青霉毒素镰刀菌毒素镰刀菌毒素霉菌毒素的分类霉菌毒素的分类按毒作用机理按毒作用机理抑制蛋白质合成类抑制蛋白质合成类作用于离子通道类作用于离子通道类作用于细胞骨架类作用于细胞骨架类作用于细胞突触类作用于细胞突触类霉菌毒素的分类霉菌毒素的分类按毒素结构分按毒素结构分二呋喃环二呋喃环内酯环内酯
4、环醌类醌类霉菌毒素的产生条件霉菌毒素的产生条件v 水分水分v pHv 温度温度v 湿度湿度v 氧气氧气霉菌毒性与危害霉菌毒性与危害v肝、肾、神经、生殖、消化系统的损害肝、肾、神经、生殖、消化系统的损害v免疫抑制、细胞毒性免疫抑制、细胞毒性v致癌、致畸、致突变，如黄曲霉毒素能诱发人、致癌、致畸、致突变，如黄曲霉毒素能诱发人、猴、鼠、禽类发生肝癌，致癌所需时间最短为猴、鼠、禽类发生肝癌，致癌所需时间最短为24周。周。v第二节第二节 黄曲霉毒素的检验黄曲霉毒素的检验黄曲霉毒素黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)v黄曲霉、寄生霉和温特霉的代谢产物黄曲霉、寄生霉和温特霉的代谢产物 v剧毒物，其毒性
5、是氰化钾的剧毒物，其毒性是氰化钾的10倍倍，为砒霜的为砒霜的68倍倍，是目前发现的最强的化学致癌物质之一是目前发现的最强的化学致癌物质之一v黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强最为多见，其毒性和致癌性也最强v高温高湿地区生产的高温高湿地区生产的花生、玉米花生、玉米、大米、棉籽等、大米、棉籽等最容易被污染最容易被污染基基本本结结构：构：二二呋呋喃喃环环和和香香豆豆素素 产生荧光颜色产生荧光颜色不同，可分为不同，可分为B族（蓝色）族（蓝色）和和G族（绿色）族（绿色）两大类及其衍两大类及其衍生物生物 主要存在于牛奶中主要存在于牛奶中AFTB1及其衍生物及其衍生物AFTG2及其衍生物
6、及其衍生物黄曲霉毒素黄曲霉毒素的理化性质的理化性质n耐热，高于耐热，高于280裂解；耐光，不耐氧化剂裂解；耐光，不耐氧化剂n难溶于水，乙醚、石油醚，难溶于水，乙醚、石油醚，易溶于甲醇和氯仿易溶于甲醇和氯仿n在碱性条件下，其结构中的内脂环可被破坏形成在碱性条件下，其结构中的内脂环可被破坏形成香豆素钠盐，该盐能溶于水，无毒。香豆素钠盐，该盐能溶于水，无毒。n在酸性条件下，能发生逆反应，恢复其毒性。其在酸性条件下，能发生逆反应，恢复其毒性。其反应式为：反应式为：黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素的分析方法黄曲霉毒素的分析方法TLC酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法（ELISA）微柱筛选法微柱筛选法HPLC
7、国标法国标法薄层色谱法薄层色谱法单向展开法单向展开法 样品中样品中AFTB1经甲醇经甲醇-水溶液提水溶液提取后，浓缩、定容、点样于硅胶取后，浓缩、定容、点样于硅胶G薄层板上，经展开分离后，在薄层板上，经展开分离后，在波长波长365nm紫外光下观察蓝紫色紫外光下观察蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧荧光，根据其在薄层板上显示荧光的强度与标准比较来确定含量。光的强度与标准比较来确定含量。样品处理样品处理v样品样品加加正己烷（或石油醚）和甲醇正己烷（或石油醚）和甲醇-水水溶液，震荡溶液，震荡分层，取甲醇分层，取甲醇-水层水层氯仿萃取氯仿萃取无水无水NaNa2 2SOSO4 4过滤过滤滤滤液蒸干液蒸干
8、苯苯-乙腈溶解乙腈溶解备用备用点样点样在距薄层板下端的在距薄层板下端的2cm基线上用微量注射器滴加样基线上用微量注射器滴加样液，标液，一块板滴加液，标液，一块板滴加4 个点，点的直径个点，点的直径3mm，大小一致，在一条直线上。滴加样式如下：，大小一致，在一条直线上。滴加样式如下：第一点第二点第三点第四点第一点第二点第三点第四点样液样液 20 20 20 l淡标淡标(0.04 g/ml)10 10 l浓标浓标(0.2 g/ml)10 l （最低荧光点）（最低荧光点）（样点）（样点）（荧光定位）（荧光定位）预展及展开预展及展开 预展，预展，12cm无水乙醚无水乙醚展开展开1012cm 丙酮：氯仿
9、丙酮：氯仿 8 ：92观察及确证观察及确证365nm若若Rf=0.6附近有蓝附近有蓝紫色荧光紫色荧光确证确证点样后，在点样处滴加三氟乙酸点样后，在点样处滴加三氟乙酸Rf=0.1附附近有蓝紫近有蓝紫色荧光色荧光展开、紫外灯展开、紫外灯下观察下观察AFTB1AFTB2a极性增大极性增大确证点样操作确证点样操作 第一点第二点第三点第四点第一点第二点第三点第四点样液样液l 20 20淡标淡标（0.04 g/ml）10 10 三氟乙酸三氟乙酸 1小滴小滴小滴小滴 （反应（反应5min，热风吹，热风吹2min，40）定量操作方法定量操作方法 第一点第二点第一点第二点 第三点第三点 第四点第四点样液样液 1
10、0 15 20 l淡标淡标 10 l0.0004g（0.04 g/ml）定量操作方法定量操作方法如样点的荧光强度与淡标点的荧光强如样点的荧光强度与淡标点的荧光强度度一致一致，则样品中，则样品中AFTB1含量为含量为0.0004g如样点的荧光强度如样点的荧光强度比最低检出量强比最低检出量强，则根据其强度估计则根据其强度估计减少滴加微升数或减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升将样液稀释后再滴加不同微升，直至，直至样点的荧光强度与最低检出量的荧光样点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致。强度一致。高效液相色谱法测定高效液相色谱法测定AFTB1 样品中的黄曲霉毒素经样品中的黄曲霉毒素经C18柱分
11、离，用带柱分离，用带荧光检测器荧光检测器的的高效液相色谱仪检测，以保高效液相色谱仪检测，以保留时间定性，峰面积或峰高留时间定性，峰面积或峰高定量。定量。样品提取样品提取样品粉碎样品粉碎加少量水加少量水氯仿提取氯仿提取无水无水Na2SO4脱水脱水过滤过滤提取液，待净化提取液，待净化样品净化和衍生物反应样品净化和衍生物反应硅镁型吸附剂硅镁型吸附剂1.提取液提取液2.氯仿氯仿-正己烷正己烷 氯仿氯仿-甲醇甲醇3.丙酮丙酮-水洗脱水洗脱洗脱液水浴蒸干洗脱液水浴蒸干氯仿溶解氯仿溶解部分加入正己烷、三氟乙酸部分加入正己烷、三氟乙酸静置静置30min氮气吹干氮气吹干用流动相溶解用流动相溶解进高效液相色谱仪进
12、高效液相色谱仪高效液相测定参考条件高效液相测定参考条件v检测器：荧光检测器检测器：荧光检测器 激发波长：激发波长：360nm 发射波长：发射波长：425nmv色谱柱：色谱柱：C18v流动相：甲醇流动相：甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾（磷酸二氢钾（1+1）或乙腈或乙腈-甲醇甲醇-水（水（50+150+300）v流速：流速：1.3ml/min微柱筛选法微柱筛选法P130 样液中黄曲霉毒素被微柱管内样液中黄曲霉毒素被微柱管内硅镁型吸附剂层吸硅镁型吸附剂层吸附后附后,在在365nm紫外光灯下显示蓝紫色荧光环紫外光灯下显示蓝紫色荧光环，其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的浓度范围内其荧光强度与黄曲霉毒素在
13、一定的浓度范围内成正比例关系。由于在微柱上不能分离黄曲霉成正比例关系。由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素毒素B1、B2、G1、G2,所以测得结果为总的黄所以测得结果为总的黄曲霉毒素含量曲霉毒素含量。GB/T 5009.23-2006玻璃微柱管玻璃微柱管：内径内径0.4cm，长，长12cm,为便于加液可在管的为便于加液可在管的上部接一段粗的管口。上部接一段粗的管口。微柱层析架微柱层析架：附有接受洗脱废液的附有接受洗脱废液的容器，要尽可能密闭。容器，要尽可能密闭。下下层甲醇水提取液甲醇水提取液花生油花生油振振摇石油石油醚甲醇甲醇-水水氯仿仿下下层弃去水弃去水层，洗去残留甲醇，洗去残留甲醇过滤备用用无水
14、硫酸钠无水硫酸钠水水黄曲霉毒素的提取黄曲霉毒素的提取甲醇甲醇-水水-石油石油醚提取法提取法下下层萃取液萃取液玉米磨碎玉米磨碎润湿湿氯仿仿过滤备用用无水硫酸钠无水硫酸钠黄曲霉毒素的提取黄曲霉毒素的提取三三氯甲甲烷水提取法水提取法甲醇甲醇-水水微柱管制备微柱管制备脱脂棉（铺顶层）脱脂棉（铺顶层）3cm 无水硫酸钠（无水硫酸钠（60100目）目）1.5cm酸性氧化铝酸性氧化铝12.5cm中性氧化铝中性氧化铝0.5cm无水硫酸钠无水硫酸钠0.5cm硅镁型吸附剂硅镁型吸附剂0.5cm无水硫酸钠无水硫酸钠脱脂棉（作底层）脱脂棉（作底层）微柱层析微柱层析1ml液体液体样样液液0.0025g/ml标液液0.0
15、05g/ml标液液氯仿仿展开剂：丙酮三氯甲烷展开剂：丙酮三氯甲烷（1:9）结果观察与评定结果观察与评定 365nm紫外光照射紫外光照射 若样品柱管内硅镁型吸附剂层若样品柱管内硅镁型吸附剂层只现只现微黄色荧光环，则样品中黄曲霉毒微黄色荧光环，则样品中黄曲霉毒素含量为未检出素含量为未检出(在在5或或10gkg以以下下)；若出现若出现蓝紫色荧光环蓝紫色荧光环，则需进一步，则需进一步通过薄层色谱测定法进行测定。通过薄层色谱测定法进行测定。n确证时，不需重新提取样品确证时，不需重新提取样品n其操作如下其操作如下：准确吸取原三氯甲烷提取液于小蒸发皿准确吸取原三氯甲烷提取液于小蒸发皿内挥干，内挥干，以少量以
16、少量苯乙腈混合液苯乙腈混合液(982)分数次转入刻度小管中，分数次转入刻度小管中，定容至定容至1.0mL，密塞，混匀，按薄层层析法确，密塞，混匀，按薄层层析法确证，证，并测定黄曲霉毒素并测定黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 的含量。的含量。需要说明之处需要说明之处v层析用的氧化铝、硅镁型吸附剂及无水硫酸钠层析用的氧化铝、硅镁型吸附剂及无水硫酸钠使用前应在使用前应在120活化活化2 h，装瓶盖严于干燥装瓶盖严于干燥器内，可保存器内，可保存1周左右，周左右，超过超过1周需再次活化周需再次活化v层析结束后，最好在层析结束后，最好在2h内观察内观察v接受洗脱液的容器要密封接受洗脱液的容器要密封v第三节
17、第三节 赭曲霉毒素赭曲霉毒素A的检验的检验赭曲霉毒素的理化性质赭曲霉毒素的理化性质v由曲霉菌，如赭曲霉、硫色曲霉、蜂蜜曲霉以由曲霉菌，如赭曲霉、硫色曲霉、蜂蜜曲霉以及绿青霉等产生的一类毒素。及绿青霉等产生的一类毒素。v赭曲霉毒素赭曲霉毒素A（OTA）毒性最大，在霉变谷物、毒性最大，在霉变谷物、饲料等最常见。饲料等最常见。vOTA微溶于水、石油醚微溶于水、石油醚，加碱成盐，水溶解性加碱成盐，水溶解性增大增大v酸性时，溶于苯、氯仿。酸性时，溶于苯、氯仿。v对紫外线不稳定，几天即分解（应避光）对紫外线不稳定，几天即分解（应避光）v用用三氯甲烷三氯甲烷-0.1mol/L磷酸磷酸或或石油醚石油醚-甲醇甲
18、醇/水水提取样品中的赭曲霉毒素提取样品中的赭曲霉毒素A，样品提取液经液，样品提取液经液-液分配后，根据液分配后，根据其在其在365 nm紫外光灯下产生黄绿色荧紫外光灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与标准比较测定光，在薄层色谱板上与标准比较测定含量。含量。v采用双相展开法采用双相展开法薄层色谱法薄层色谱法GB/T 5009.96-2003氯仿仿层样品粉碎品粉碎过滤氯仿仿磷酸磷酸NaHCO3水水层氯仿仿层蒸干蒸干备用用苯苯-乙腈乙腈盐酸酸氯仿仿提取（甲法）提取（甲法）甲醇甲醇-水水层样品粉碎品粉碎过滤石油石油醚甲醇甲醇-水水氯仿仿层震震荡氯仿仿层备用用苯苯-乙腈乙腈NaCl饱和和溶液溶液提取（乙
19、法）提取（乙法）氯仿仿点样、纵展点样、纵展展开剂：展开剂：无水乙醚无水乙醚乙醚乙醚-甲醇甲醇-水水纵展纵展23cm 样品样品+标液标液横展横展展开展开1012cm样品样品+标液标液 样样液液与与标标品品展开剂：展开剂：无水乙醚无水乙醚乙醚乙醚-甲醇甲醇-水水纵展纵展展开剂：展开剂：甲苯甲苯-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲酸甲酸-水水甲苯甲苯-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲酸甲酸苯苯-冰乙酸冰乙酸 纵展纵展1315cm 样品样品+标液标液观察及确证观察及确证365nm与标准点的与标准点的相应处有黄相应处有黄绿色荧光绿色荧光确证确证用碳酸氢钠乙醇溶用碳酸氢钠乙醇溶液喷洒色谱板，室液喷洒色谱板，室温下干燥温下干燥紫外灯
20、紫外灯OTA荧光点荧光点应由黄绿色应由黄绿色变为蓝色变为蓝色 稀释定量稀释定量比较样液中比较样液中OA与标准与标准OA点的荧光强度，估计点的荧光强度，估计稀释倍数。稀释倍数。薄层板经双向展开后，当样品中薄层板经双向展开后，当样品中OA含量高时，含量高时，OA的荧光点会被横向拉长的荧光点会被横向拉长，使点变扁，使点变扁，或分成或分成两个黄绿色荧光点两个黄绿色荧光点。在横展过程中，在横展过程中，原点上原点上OA的量超过了硅的量超过了硅胶的吸附能力，胶的吸附能力，原点上的杂质和残留溶原点上的杂质和残留溶剂在横展中将剂在横展中将OA点横向拉长了。点横向拉长了。稀释定量稀释定量v这时可根据这时可根据OA
21、黄绿色荧光的总强度与标准荧光黄绿色荧光的总强度与标准荧光强度比较，强度比较，估计需减少的滴加微升数或所需稀估计需减少的滴加微升数或所需稀释倍数释倍数。v经稀释后测定含量时，可在样液点的左边基线经稀释后测定含量时，可在样液点的左边基线上上滴加二个标准点，滴加二个标准点，OA的量可为的量可为4ng、8ng，比较样液与两个标准比较样液与两个标准OA荧光点的荧光强度，概荧光点的荧光强度，概略定量略定量方法说明方法说明v本标准本标准规定了谷物和大豆规定了谷物和大豆中中OTA的薄层色谱测的薄层色谱测定方法。定方法。v本标准本标准适用于小麦、玉米和大豆适用于小麦、玉米和大豆中中OTA的测定。的测定。v薄层板
22、上薄层板上OTA的最低检出量为的最低检出量为4ng。v本方法的最低检测量为本方法的最低检测量为10g/kg。v标准使用液冰箱黑纸避光标准使用液冰箱黑纸避光v第四节第四节 展青霉素的检验展青霉素的检验一、一、展青霉素的理化性质展青霉素的理化性质v无色结晶，熔点无色结晶，熔点110，在，在70-10070-100可升华；可升华；v溶于水和乙醇；溶于水和乙醇；v在碱性条件下不稳定，在酸性溶液中较稳定，耐在碱性条件下不稳定，在酸性溶液中较稳定，耐热。热。二、食品中的来源二、食品中的来源v主要存在于腐烂水果及其制品中主要存在于腐烂水果及其制品中v展青霉素由荨麻青霉、扩张青霉和棒曲霉等霉菌展青霉素由荨麻青
23、霉、扩张青霉和棒曲霉等霉菌代谢产生的。代谢产生的。三、三、毒性与危害毒性与危害四、卫生标准四、卫生标准五、分析方法五、分析方法v展青霉素的测定方法有气相色谱法、高效液相色展青霉素的测定方法有气相色谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法。我国的标准分析方法为双向谱法和薄层色谱法。我国的标准分析方法为双向薄层扫描定量测定法。薄层扫描定量测定法。双相薄层扫描测定法双相薄层扫描测定法 用乙酸乙酯提取果汁，利用用乙酸乙酯提取果汁，利用1.5%碳碳酸钠净化样品，经双向薄层分离后，酸钠净化样品，经双向薄层分离后，利用薄层扫描仪进行紫外反射光扫利用薄层扫描仪进行紫外反射光扫描定量。描定量。本方法适合于本方法适合于苹
24、果、山楂制品及其半成品中苹果、山楂制品及其半成品中展青霉素的测定展青霉素的测定GB/T 5009.185-2003薄层扫描仪薄层扫描仪展青霉素的提取展青霉素的提取果汁：果汁：v加加乙酸乙酯乙酸乙酯，振摇，振摇2min，静置分层。重复以上，静置分层。重复以上步骤两次，合并有机相。步骤两次，合并有机相。v有机相有机相加碳酸钠加碳酸钠，振摇，振摇1min，静置分层后，弃，静置分层后，弃去碳酸钠层，再用碳酸钠重复处理一次。去碳酸钠层，再用碳酸钠重复处理一次。v提取液滤真空减压浓缩近干，用少许提取液滤真空减压浓缩近干，用少许三氯甲烷三氯甲烷清洗瓶壁，浓缩干，加三氯甲烷定溶，供薄层清洗瓶壁，浓缩干，加三氯
25、甲烷定溶，供薄层色谱分析用。色谱分析用。展青霉素的提取展青霉素的提取鲜苹果、果酱：鲜苹果、果酱：v苹果洗净、削皮、打碎苹果洗净、削皮、打碎v置研钵中，加置研钵中，加无水硫酸钠无水硫酸钠研磨后转至锥形瓶研磨后转至锥形瓶v加加乙酸乙酯乙酸乙酯浸泡、振荡，过滤浸泡、振荡，过滤v滤液滤液减压浓缩近干，用少许减压浓缩近干，用少许三氯甲烷三氯甲烷清洗瓶壁，清洗瓶壁，浓缩干，三氯甲烷定溶，供薄层色谱分析用。浓缩干，三氯甲烷定溶，供薄层色谱分析用。薄层分析薄层分析 点样点样 v 标液与样液相差标液与样液相差3cmv 在样品点用一垂直线上，距顶在样品点用一垂直线上，距顶端端2cm处点处点20ng的标准液，为的标
26、准液，为位置参考点。位置参考点。固定相：硅胶固定相：硅胶GF254 薄层分析薄层分析 双向展开双向展开v先横向，排除杂质的干扰，再纵向先横向，排除杂质的干扰，再纵向v在在波长波长254nm紫外灯下观察，紫外灯下观察，v展青霉素展青霉素Rf值约为值约为0.35，若样品点出现黑点，若样品点出现黑点，则样品为阳性。则样品为阳性。v根据样液黑色吸收点的强度高低，根据样液黑色吸收点的强度高低，稀释不同倍稀释不同倍数后，再点样数后，再点样10L，使每个样品点展青霉素的，使每个样品点展青霉素的绝对量在绝对量在10100ng之间之间，经双向展开后，进行，经双向展开后，进行扫描定量扫描定量测定。测定。确证确证阳
27、性样品的验证：阳性样品的验证：v将阳性样品的薄层色谱板将阳性样品的薄层色谱板喷以喷以MBTH显色剂显色剂，130烘烤烘烤15min，冷却至室，冷却至室温后，于波长温后，于波长360nm紫外灯下观察，紫外灯下观察，展青霉素应呈展青霉素应呈橙黄色点橙黄色点。定量定量v测定波长测定波长270nm；参考波长；参考波长310nm；反射光测定；反射光测定；扫描速度扫描速度40nn/min；记录仪纸速；记录仪纸速20nn/min；根据；根据标准及样品中展青霉素标准及样品中展青霉素峰面积峰面积，按下式计算样品，按下式计算样品中展青霉素含量。中展青霉素含量。X果汁中展青霉素含量，果汁中展青霉素含量，g/mL；Y
28、鲜苹果中展青霉素含，鲜苹果中展青霉素含，g/g；c展青霉素标准液浓度，展青霉素标准液浓度，g/mL；A样液展青霉素峰面积；样液展青霉素峰面积；YS展青霉素标准峰面积；展青霉素标准峰面积；V加三氯甲烷定容体积，加三氯甲烷定容体积，mL；D样液点稀释倍数；样液点稀释倍数；m样品质量，样品质量，g；V1液体样品的体积，液体样品的体积，mL。第五节第五节脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的检验脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇（脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）三羟基三羟基-12,13环氧单端孢霉环氧单端孢霉-9烯烯-8酮酮可溶于水、含水甲醇、
29、含水乙醇、乙酸乙酯等可溶于水、含水甲醇、含水乙醇、乙酸乙酯等紫外光下无荧光紫外光下无荧光雪腐镰刀菌烯醇（雪腐镰刀菌烯醇（NIV）四羟基四羟基-12,13环氧单端孢霉环氧单端孢霉-9烯烯-8酮酮易溶于水、甲醇、乙醇等易溶于水、甲醇、乙醇等极性比极性比DON大大也称呕吐毒素也称呕吐毒素v分子结构分子结构v毒性与危害毒性与危害v卫生标准卫生标准v主要来源：主要来源：DON及及NIV主要是雪腐镰刀菌污染小主要是雪腐镰刀菌污染小麦、玉米、豆饼等粮食和饲料产生的代谢产物。麦、玉米、豆饼等粮食和饲料产生的代谢产物。v分析方法：我国规定分析方法：我国规定DON的标准分析方法是薄层的标准分析方法是薄层色谱法（第
30、一法）和免疫测定法（第二法）。其色谱法（第一法）和免疫测定法（第二法）。其他常用的方法有他常用的方法有GC,HPLC及微柱法。及微柱法。脱氧雪腐镰刀菌烯醇脱氧雪腐镰刀菌烯醇-薄层色谱法测定薄层色谱法测定v脱氧雪腐镰刀菌烯醇经提取、净化、浓缩和脱氧雪腐镰刀菌烯醇经提取、净化、浓缩和硅硅胶胶G薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板时加入了层板时加入了三氯化铝三氯化铝，使脱氧雪腐镰刀菌烯，使脱氧雪腐镰刀菌烯醇在醇在365nm紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较。较。本标准适合于本标准适合于谷物及其制品谷物及其制品GB/T 5009.11
31、1-2003提取提取粉碎样品粉碎样品加水、三氯甲烷加水、三氯甲烷-无水乙醇无水乙醇振荡振荡1h过滤过滤滤液蒸干滤液蒸干液液分配液液分配 净化净化石油醚溶解残渣石油醚溶解残渣再用甲醇再用甲醇-水分次洗涤蒸发皿水分次洗涤蒸发皿 甲醇甲醇-水层水层过中性氧化铝、活性炭柱过中性氧化铝、活性炭柱甲醇甲醇-水淋洗柱子水淋洗柱子沸水浴浓缩至干沸水浴浓缩至干乙酸乙酯溶解，浓缩，备用乙酸乙酯溶解，浓缩，备用点样、展开、测定点样、展开、测定v先点样液横展：使先点样液横展：使DON偏离原点（杂质）偏离原点（杂质）展开剂：乙醚展开剂：乙醚-丙酮或无水乙醚丙酮或无水乙醚 对于小麦制品，还须再用对于小麦制品，还须再用10
32、mL石油醚横展一次石油醚横展一次。v加点标准液后纵展开加点标准液后纵展开 展开剂：展开剂：三氯甲烷三氯甲烷-丙酮丙酮-异丙醇异丙醇(8:1:1)三氯甲烷三氯甲烷-丙酮丙酮-异丙醇异丙醇-水水(7.5:1:1.5:0.1)薄层上端与样品点相对应的位置点一个薄层上端与样品点相对应的位置点一个DON标准点，作为定位参考标准点，作为定位参考观察观察365nmv杂质有荧光杂质有荧光 vDON无荧光无荧光而后薄层板在而后薄层板在130加热，冷却后加热，冷却后v如如DON处无荧光处无荧光，则为阴性，则为阴性v杂质、杂质、DON均有荧光均有荧光，但是刚好分开，但是刚好分开，为阳性为阳性定量定量阳性样品与不同量
33、的标准点一阳性样品与不同量的标准点一起进行薄层色谱分析，比较样起进行薄层色谱分析，比较样品与各标准点品与各标准点DON点荧光强点荧光强度，进行概略定量。度，进行概略定量。薄层色谱法（薄层色谱法（DON，NIV）v小麦中的小麦中的DON，NIV经提取、经提取、净化、浓缩和净化、浓缩和硅胶硅胶G薄层展开后，薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板加热薄层板。由于在制备薄层板时加入了时加入了三氯化铝三氯化铝，使，使DON，NIV在在365nm紫外光灯下显蓝色紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较。荧光，与标准比较。样品提取、净化样品提取、净化粉碎粉碎甲醇甲醇-水提取水提取二次二次过滤过滤加石油醚加石油醚取
34、甲醇水取甲醇水层层浓缩浓缩加水稀释加水稀释待净化待净化XAD-4色谱柱净化色谱柱净化甲醇洗脱甲醇洗脱测定测定v同前同前v只是展开剂不同只是展开剂不同v第六节第六节 T-2毒素的检验毒素的检验v由多种镰刀菌产生的一种霉菌毒素。由多种镰刀菌产生的一种霉菌毒素。v主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物及其制品主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物及其制品 v难溶于水，易溶于三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯难溶于水，易溶于三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯T-2毒素的检验毒素的检验本标准适合于本标准适合于谷物及其制品谷物及其制品GB/T 5009.118-2008高效液相色谱测定法高效液相色谱测定法间接间接ELISA法法直接直
35、接ELISA法法HPLCv试样中的试样中的T-2毒素用毒素用甲醇甲醇-水提水提取取后，提取液经后，提取液经免疫亲和柱净免疫亲和柱净化化，浓缩、衍生、定容后，用，浓缩、衍生、定容后，用配有配有荧光检测器荧光检测器的液相色谱仪的液相色谱仪进行测定，外标法定量。进行测定，外标法定量。免疫亲和柱净化免疫亲和柱净化v测定的基础是测定的基础是抗原抗体反应抗原抗体反应，抗体，抗体连接在柱体内，样品净化液缓慢的连接在柱体内，样品净化液缓慢的通过通过T-2毒素免疫亲和层析柱，在毒素免疫亲和层析柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合后洗涤免疫亲和柱除去没有
36、被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱的其他无关物质。用甲醇洗脱T-2毒素，然后进行后续操作。毒素，然后进行后续操作。提取、净化提取、净化样品样品加甲醇加甲醇-水、高速均质水、高速均质离心离心上清液滤纸过滤上清液滤纸过滤滤液用水稀释滤液用水稀释玻璃纤维滤纸过滤玻璃纤维滤纸过滤进免疫亲和柱净化进免疫亲和柱净化待衍生待衍生氮气吹干氮气吹干收集洗脱液收集洗脱液1.5ml甲醇洗脱甲醇洗脱弃去全部流出液弃去全部流出液水淋洗柱子水淋洗柱子衍生衍生净化后的样品净化后的样品二甲基氨基吡啶（二甲基氨基吡啶（催化剂催化剂）和氰酸蒽）和氰酸蒽混匀，混匀，50反应，冷却反应，冷却氮气吹干氮气吹干流动相乙腈流动相乙腈-水溶解水溶解进液相色谱测定进液相色谱测定v第七节第七节 玉米赤霉烯酮的检验玉米赤霉烯酮的检验玉米赤霉烯酮的测定玉米赤霉烯酮的测定 用提取液提取试样中的玉米赤霉烯酮，用提取液提取试样中的玉米赤霉烯酮，经经免疫亲和柱净化免疫亲和柱净化后，用高效液相色后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。谱荧光检测器测定，外标法定量。玉米赤霉烯酮的测定玉米赤霉烯酮的测定 试样中的玉米赤霉烯酮用乙腈试样中的玉米赤霉烯酮用乙腈-水提水提取后，经取后，经免疫亲和柱净化免疫亲和柱净化、浓缩后用、浓缩后用配有荧光检测器的高效液相色谱仪进配有荧光检测器的高效液相色谱仪进行测定，外标法定量。行测定，外标法定量。